Name: Silenciamento de BRCA2 Identificar funções biológicas regulada-BRCA2 romance em células humanas de cultura (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprenda a silenciar o gene BRCA2 usando siRNA em linhagens celulares humanas. Este método inclui duas rodadas de transfecção e análise por Western blotting para detectar proteínas de alto peso molecular em pesquisas sobre biologia do câncer.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de mérito FIRB-RBNE08YFN3_005 e RBNE08HWLZ_012, e pelo Ministério da Economia e Finanças italiano ao CNR para o projeto "FaReBio di Qualità".

1. Prepare soluções siRNA <ol><li> Ressuspender 5 nmol de embaralhada (Ctrl) e 5 nmol de BRCA2 siRNA peletes secos em 100 ul de água isenta de RNase (concentração final de siRNA: 50 uM). Este é o banco de siRNA e deve ser armazenado a -20 ° C em alíquotas de 10 ul. </li><li> Tomar uma aliquota de 10 ul de estoque de siRNA e adicionar 40 ul de água isenta de RNase para obter a solução de trabalho a 10 ^ M de siARN. Esta diluição deve ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização. NOTA: A solução de trabalho siRNA não devem ser submetidos a congelamento / descongelamento mais de 3 vezes. </li></ol> 2. Sementeira de linhas celulares epiteliais humanas <ol><li> Remover o meio de crescimento de linhas celulares epiteliais humanas que crescem como monocamadas celulares em placas de cultura de tecidos numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células na placa uma vez com PBS temperatura ambiente (10 ml de PBS para uma placa de 100 mm). </li><li> Para retirar as células a partir da placa,adicionar 2 ml de tripsina a 0,25% / solução de 0,53 mM de EDTA e incubar 3-5 minutos, dependendo do tipo de célula. </li><li> Antes de recolher as células destacadas, neutralizar a tripsina por adição de 2 ml de meio de crescimento completo contendo 10% de soro fetal bovino. </li><li> Transferir as células para um tubo de 15 ml. </li><li> Centrifugar as células a 320-330 x g durante 3 min a 4 ° C num rotor de balde oscilante. </li><li> Ressuspender as peletes de células em 5 ml de meio livre de antibióticos. </li><li> Contar as células ao microscópio numa câmara de Burker, quer utilizando um sistema automatizado de contagem de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Semente as células em placas de 6 poços para ser cerca de 80% confluente após 24 horas (0,5-1 x 10 6 células em 2 ml de meio para cada poço). O número de células óptimas a serem semeadas podem variar dependendo das linhas de células específicas e a taxa de crescimento. NOTA: Não adicionar antibióticos a médio neste momento porque os antibióticos irá interferir negativamente com a eficiência de transfection. É muito importante que as células estão na cultura de passagens baixas (&lt;10) para atingir uma elevada eficiência de transfecção siRNA BRCA2. </li></ol> 3. Células de transfecção com siRNA <ol><li> Vinte e quatro horas após o plaqueamento das células, prosseguir com a primeira rodada de transfecção. <ol><li> Dilui-se 6 ul de 10 siRNA reagente de transfecção à base de lípidos específicos, em 130 ul de meio de soro reduzido. </li><li> Dilui-se 3 ul de siRNA 10 uM (30 pmol) em 130 ul de meio de soro reduzido. </li><li> Combinar o siARN diluiu-se com o reagente de transfecção diluído e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente. </li><li> Durante a incubação, remover o meio das células e adicionar 2 ml de meio fresco pré-aquecido a 37 ° C (sem antibióticos). </li><li> Adicionar 250 ul de complexos de siRNA-reagentes de transfecção para as células (este valor é para um único poço de uma placa de 6 poços). </li><li> Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 3776; C com 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Após 24 horas, prosseguir com a segunda rodada de transfecção por passos 3.1.1-3.1.5 repetindo com a seguinte modificação para a etapa 3.1.2: diluir 5 ul de 10 mM siRNA (50 pmol) em 130 mL de meio de soro reduzido. <ol><li> Incubam-se as células durante 1-2 dias a 37 ° C antes da análise. NOTA: Duas rodadas de transfecções e uso de uma relação de reagente alta siRNA / transfecção na segunda rodada são essenciais para obter alta eficiência do BRCA2 silenciamento. </li></ol></li></ol> 4. Lisar as células para análise de imunotransferência <ol><li> Preparar tampão de lise fresco com PBS (pH 7,4) contendo 1% do não iónico, não-detergente desnaturante octilfenoxipolietoxietanol, pirofosfato de sódio a 5 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 10 ug / ml de leupeptina, 10 ug / ml de aprotinina. Mantê-lo em gelo. </li><li> Remover o meio das células e wash-los uma vez com PBS frio (2 ml / poço) na placa. Para evitar qualquer transição PBS, removê-la completamente a partir da placa. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de lise a cada poço. NOTA: Se as células têm de ser usado também para outros ensaios, trypsinize as células tal como descrito no passo 2,1-2,6 e ressuspender as células em tampão / meio apropriado de acordo com a aplicação a ser utilizada. </li><li> Rodar suavemente a placa para distribuir uniformemente o tampão de lise e incubar durante 15 min a 4 ° C num rotor. </li><li> Recolhe-se o lisado celular num tubo de microcentrífuga em gelo usando um raspador de células. </li><li> Centrifugar a 17.900 xg durante 25 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante num novo tubo. </li><li> Medir a concentração de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> Análise immunoblotting 5. BRCA2 <ol><li> Preparar o tampão de corrida, diluindo 50 ml de 20x de Tris-Acetato de SDS execução bpode ser prejudicado (Tricina 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% de SDS, pH 8,24) com 950 ml de água destilada. </li><li> Preparar a amostra como se segue: adicionar 15? G de lisado celular total, 5 uL de tampão de amostra 4x contendo sulfato de dodecilo de lítio, a pH 8,4, 2 mL de amostra de 10x agente redutor (DTT 0,5 M) e tampão de lise para um volume final de 20 ul. NOTA: Este protocolo permite a detecção de BRCA2 em linhas de células normais, também quando se utiliza uma menor quantidade de proteínas totais (inferior a 5 ug). </li><li> Desnaturar amostras a 55 ° C durante 10 min. NOTA: É fundamental usar 55 ° C. Desde que a proteína BRCA2 é termossensível 11, as temperaturas de desnaturação mais elevadas resultam em perda consistente dos intacto de comprimento completo (390 kDa) da proteína BRCA2. </li><li> Defina-se a câmara de electroforese de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Coloque as amostras e 10 ul de alto peso molecular pré-corados padrão de proteína em um gel precasted (Tris-Acetato de 3-8%) e executado em 120 V para aba 2 horas 12. Parar a corrida eletroforética antes do 55 kDa marcador azul deixa o gel precasted. </li><li> Preparar o tampão de transferência com 50 ml de tampão de transferência 20x, 100 ml de metanol a 100% e 850 ml de água. </li><li> Activar a membrana de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) por imersão em 100% de metanol durante 5 minutos, enxaguar com água destilada e equilibrar em tampão de transferência, pelo menos, durante 5 min. Soak as esponjas do aparelho de transferência com tampão de transferência a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Quando a corrida eletroforética é longo, montar o sanduíche na pilha de transferência na seguinte ordem (bottom-up): três esponjas saturadas em tampão de transferência, uma folha de papel 3MM grau saturado em tampão de transferência, o gel, membrana PVDF ativado, um 3MM folha de papel grau saturado em tampão de transferência, três esponjas saturado em tampão de transferência 13,14. Colocar a pilha no aparelho e as proteínas de transferência em 350 mA durante 4 horas a 4 ° C ou a 180 mA durante a noite a 4 ° C. NOTA: Ser BRCA2 uma proteína muito grande, é crucial para estender o tempo de transferência de 1 hora (tal como sugerido pelo fabricante, e a maioria dos protocolos de transferência) a 4 horas ou durante a noite para assegurar a transferência completa de proteínas de alto peso molecular. Além disso, devido ao longo tempo de transferência, que é essencial para realizar o blotting numa sala fria a 4 ° C para minimizar o sobreaquecimento e facilitar a desmontagem sanduíche. Sistemas de transferência semi-secas não são bons para a transferência de grandes proteínas. </li><li> Após a transferência, lavar a membrana com TBS, bloqueá-lo durante 1 hora à temperatura ambiente em TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contendo 5% de leite seco sem gordura e a sonda durante a noite a 4 ° C com 30 ul de anti-anticorpo policlonal de coelho BRCA2 ( 200 ug / ml), diluído em 9 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro [1: 300 (v / v)] de diluição. </li><li> Lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T, em seguida, o filtro incubar durante 1 hora com 1 ml de peroxidase de rábano conjugado com anti-anticorpo secundário de coelho diluído em 10 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro. Em seguida, lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T. </li><li> Realizar imunodetecção por ECL para revelar proteína BRCA2 usando quimioluminescência aumentada (ECL) de Reagente de Detecção de Western Blotting, seguindo as instruções do fabricante. Visualize bandas imunoquimioluminométricos sobre filmes de alta resolução ECL. </li><li> Realizar imunodetecção com um anticorpo para um gene de manutenção, como β-tubulina (55 kDa), no mesmo filtro como controlo de carga, utilizando um anticorpo monoclonal para β-tubulina diluído a 1: 1000 (10 ul de anticorpo anti-tubulina em 10 ml de TBS-T + 5% de leite seco não gordo) durante 1 h à TA. Lavar e incubar o anticorpo secundário como descrito para BRCA2 (5,10-5,11), excepto na utilização de peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho. </li><li> Adquirir uma imagem digital dos filmes impressionados com bandas imunoquimioluminométricos e analisar a intensidade da banda por imagem dedicada software de análise (por exemplo,., ImageJ). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Porque mutações germinativas do gene BRCA2 chumbo ao aumento do risco de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer feminino e masculino de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e melanoma 3,4, uma série de estudos têm sido realizados para compreender a função biológica da proteína BRCA2. A maioria destes estudos são baseados em genética, principalmente devido a dificuldades técnicas na análise de uma proteína gigante como BRCA2. O método descrito aqui para silenciar e anal...

O gene BRCA2 (cancro da mama susceptibilidade gene-2) codifica para uma proteína supressora de tumor que desempenha um papel crucial na reparação de DNA quebras de cadeia dupla através da regulação da função da enzima recombinase Rad51 1. BRCA2 também tem sido implicado na modulação da transcrição e o controlo do ciclo celular em dois. Mutações da linha germinativa no gene BRCA2 induzir uma autossómica dominante susceptibilidade para cancro da mama e do cancro do ovário em mulheres e cancro da próstata em homens, assim como a predisposição para outros tipos de cancro 3,4. No entanto, apesar do aumento do risco de desenvolvimento de cancro, BRCA2 que suprimem ou reduzem a função BRCA2 pode tornar as células de cancro mais vulnerável a agentes quimioterapêuticos que provocam danos no DNA 5-7. Cânceres esporádicos apresentam uma baixa taxa de mutações BRCA2 (&lt;3%) que os níveis reduzidos de proteína BRCA2 foram detectados em alguns tipos de câncer, o que sugere que a proteína BRCA2podem ser perdidos durante a tumorigênese em cânceres esporádicos através de mecanismos não-mutacional-dependentes 7,8. Assim, é importante compreender as funções BRCA2 no contexto da biologia do cancro, bem como em outras configurações biológicos. Uma poderosa ferramenta utilizada para identificar novos funções de um gene em células de mamífero é silenciar a sua expressão. Como um exemplo, o silenciamento BRCA2 expressão numa variedade de células epiteliais normais levou recentemente à identificação de uma nova função de BRCA2 como regulador de resistência anoikis, um passo importante durante a aquisição de célula de cancro invasivo e metastático capacidade 9. Gene silenciamento pode ser alcançado através da introdução nas células ou de interferência (Si) ou ARN pequeno gancho de cabelo curto (sh) moléculas de RNA alvo do gene específico. A alta potência de siRNA e sua facilidade de uso tornam a ferramenta preferencial para silenciar experiências destinadas a ganhar novos insights sobre processos biológicos críticos umnd para identificar novos alvos terapêuticos. No entanto, knockdown eficiente da expressão do gene pode não ser facilmente possível para todos os genes e pode ser altamente variável dependendo do tipo de célula. Porque a diminuição dos níveis de proteína intracelular é o fenótipo mais relevante sob investigação, que é fundamental para quantificar o silenciamento do gene por análise de imunotransf erência do produto do gene. Com este respeito, a proteína BRCA2 apresenta um desafio adicional: sendo uma proteína grande (cerca de 390 kDa), dificuldades técnicas existem para análise bioquímica convencional, incluindo a imunotransferência. Nós relatamos aqui um protocolo otimizado para silenciamento eficiente do BRCA2 em linhas de células epiteliais humanas e para a detecção rápida e bem sucedida de proteína BRCA2 knockdown por immunoblotting análise.

<table><tbody><tr><td>BRCA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003462-00</td><td>SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA</td></tr><tr><td>Ctrl siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>&nbsp; D-001810-10-05</td><td>ON-TARGETplus Reagente</td></tr><tr><td>de RNAiMAX de Lipofectamina Não-alvo para Piscina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/13778075">13778075</a></td><td>Reagente de Transfecção</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I Soro Reduzido Médio</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>Meio para procedimento de transfecção</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetato 3-8% 1,5 mm Gel pré-moldado</td><td>Life Technologies</td><td>EA0378</td><td>Gel para eletroforese de proteínas</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampão de amostra&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>Reagente para eletroforese de proteínas</td></tr><tr><td>NuPAGE Agente redutor de amostras (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0004</td><td>Reagente para eletroforese de proteínas</td></tr><tr><td>NuPAGE Antioxidant</td><td>Life Technologies</td><td>NP0005</td><td>Reagente para eletroforese</td></tr><tr><td>de proteínas HiMark Pre-stained protein standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5699</td><td>Marcador pré-corado para gel eletroforese</td></tr><tr><td>XCell SureLoc Mini-Cell&nbsp; System</td><td>Life Technologies</td><td>EI0002</td><td>Equipamento para eletroforese/transferência de proteínas</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetato SDS Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LA0041</td><td>Reagente para Western blotting</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Reagente Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>para Western blotting</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0006-1</td><td>Reagente para Western blotting</td></tr><tr><td>BRCA2 H-300 anticorpo policlonal de coelho</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8326</td> 1<td>:300 diluição</td></tr><tr><td>Beta-tubulina anticorpo monoclonal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4026-100UL</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70166</td><td>Reagente para Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>Reagente para Western blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico/Femto Substrato Quimioluminescente</td><td>Pierce Thermo Scientific</td><td>34080/34096</td><td>Sistema de Quimioluminescência</td></tr><tr><td>Células PNT1A</td><td>SIGMA Aldrich (para ECACC)</td><td>95012614</td><td>PNT1A humano, epitélio de próstata normal imortalizado com células SV40</td></tr><tr><td>Nthy</td><td>SIGMA Aldrich (para ECACC)</td><td>90011609</td><td>Nthy-ori 3-1 Linha celular humana, células epiteliais foliculares da tireoide</td></tr><tr><td>Proliferação celular Kit I (MTT)</td><td>Kit 11465007001 Roche</td><td></td><td>para ensaios de proliferação celular</td></tr></tbody></table>

silenciamento de<em&gt; brca2</em&gt; identificar funções biológicas regulada-brca2 romance em células humanas de cultura

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

O silenciamento do BRCA2 proteína supressora de tumor e sua detecção por análises bioquímicas convencionais representam um grande desafio técnico, devido ao grande tamanho da proteína BRCA2 humano (cerca de 390 kDa). Relatamos modificações de transfecção e immunoblotting protocolos padrão de siRNA para silenciar BRCA2 e detectar a proteína humana endógena BRCA2, respectivamente, em linhas de células epiteliais humanas. Passos-chave incluem um elevado siRNA à relação de reagente de transfecção e duas rodadas subseqüentes de transfecção siRNA dentro do mesmo experimento. Usando estas e outras modificações introduzidas no protocolo padrão que consistentemente conseguir mais do que 70% silenciamento do gene BRCA2 humano, tal como avaliado por análise de imunotransf erência com anticorpos anti-BRCA2. Além disso, a desnaturação dos lisados ​​celulares a 55 ° C em vez da convencional de 70-100 ° C e outras optimizações técnicas do procedimento de imunotransferência permitir a detecção de proteína intacta, mesmo BRCA2 when quantidades muito pequenas de material de partida estão disponíveis ou quando os níveis de expressão de proteína BRCA2 são muito baixos. Silenciamento eficaz de BRCA2 em células humanas oferece uma estratégia terapêutica valiosa para interromper a função BRCA2 em células intactas com BRCA2, incluindo as células tumorais, para examinar novas vias moleculares e as funções celulares que podem ser afectadas por mutações em tumores BRCA2 patogénicos. Adaptação deste protocolo para silenciamento e análise de outras proteínas &quot;grandes&quot; como BRCA2 eficiente deve ser facilmente alcançável.

Antes de prosseguir com um ensaio biológico / bioquímicas para examinar o efeito de silenciamento BRCA2 em funções celulares, o primeiro passo é para confirmar a especificidade do silenciamento usando um siRNA mexidos (não-alvo siARN) lado a lado com BRCA2 siRNA (Figura 1A ). É importante a realização de um segundo turno de transfecção com o siRNA um elevado rácio de siRNA / transfecção para obter uma elevada eficiência de silenciamento BRCA2. Com efeito, a realização de apenas uma rod...

O silenciamento de genes por siRNA representa uma estratégia experimental conveniente para analisar funções biológicas dependentes de BRCA2 com implicações imediatas para entender melhor a biologia do câncer. Um método para silenciar eficientemente o BRCA2, juntamente com o procedimento experimental para detectar e quantificar alterações na expressão da proteína BRCA2 por immunoblotting em linhagens celulares humanas, é apresentado.

Silenciamento de<em&gt; BRCA2</em&gt; Identificar funções biológicas regulada-BRCA2 romance em células humanas de cultura

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

O objetivo geral deste procedimento é silenciar a expressão de B RCA dois por meio da transfeção de SIR A. Isso é realizado primeiramente preparando os complexos do reagente de transfeção de SIR a. Em seguida, uma primeira rodada de transfeção é realizada adicionando-se gota a gota os complexos a uma monocamada de células com 80% de confluência. Então, uma segunda rodada de transfeção com SIR a é realizada utilizando uma proporção maior de SIR, A em relação ao reagente de transfeção.Por fim, as monocamadas celulares são lavadas com PBS frio e as células são lisadas a quatro graus Celsius com um tampão de lise baseado em detergente. Em última instância, a análise por Western blot é utilizada para demonstrar o silenciamento do B RCA A dois ao nível proteico. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite o silenciamento gênico eficiente, bem como a detecção ideal de proteínas de alto peso molecular, como o supressor tumoral B RCA dois. Para começar, após cultivar monocamadas de células epiteliais humanas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada, remova o meio de crescimento e use PBS à temperatura ambiente para la

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós fornecemos um método para testar variantes BRCA1 em um ensaio de cultura de tecidos com base homóloga de reparação de danos no DNA de recombinação, esgotando proteína BRCA1 endógenos de uma célula usando RNAi e substituindo-o por um mutante ponto BRCA1 que contém uma mudança de codificação.

Identificar os efeitos das mutações BRCA1 em Recombinação Homóloga usando células que expressam BRCA1 tipo selvagem endógena

Molecular sinalização através de estrogênio e microRNAs são fundamentais no desenvolvimento do câncer de mama e de crescimento. O estrogênio ativa os receptores de estrogênio, que são fatores de transcrição. Muitos fatores de transcrição pode regular a expressão de microRNAs e microRNAs regulados por estrogénios podem ser perfilado utilizando diferentes técnicas de larga escala.

Profiling de MicroRNAs estrogênio regulados em células do cancro da mama

O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

Aqui, o monitoramento em tempo real do metabolismo das células tumorais, combinado com um modelo de metástase de membrana corio-alantóide (CAM) de embrião de galinha in vivo, é usado para avaliar novos alvos/agentes anticancerígenos quanto à sua capacidade de sensibilizar células tumorais a quimioterápicos prejudiciais ao DNA.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Identificar novos alvos de medicamentos que fazem a transição de testes pré-clínicos para testes em humanos é uma prioridade científica. Para esse fim, descrevemos aqui uma abordagem genômica funcional para examinar o impacto da depleção de genes em esferóides de linhas de células cancerígenas, que modelam mais apropriadamente cânceres humanos in vivo.

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

Regulamento do ambiente da cromatina é um processo essencial, necessário para a expressão do gene apropriado. Aqui, descrevemos um método para controlar a expressão do gene através do recrutamento de cromatina-modificando máquinas de forma gene-específico e reversível.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Pessoas com mutações BRCA1 têm maior risco de desenvolver câncer, o que garante uma avaliação precisa da função das variantes BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base de citosina mediados pelo CRISPR que permitem a conversão de C:G para T:A direcionada em células vivas.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Este estudo apresenta um sistema CRISPRi duplo direcionado a RNAs longos não codificantes em células de melanoma. Ele permite o knockdown de genes combinatórios e a triagem letal sintética, identificando interações de lncRNA específicas do câncer para possíveis estratégias terapêuticas.

Estratégia de interferência dupla de CRISPR para direcionar interações letais sintéticas entre RNAs não codificantes em células cancerígenas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar células quimioresistentes usando uma abordagem de escalonamento de dose, seguido por uma triagem baseada em CRISPR/Cas9 usando uma biblioteca focada de sgRNA direcionada a modificadores epigenéticos para identificar reguladores da quimiorresistência adquirida. O protocolo também oferece múltiplos pontos de otimização adaptados a modelos celulares quimioresistentes, oferecendo uma estrutura robusta para pesquisadores que investigam mecanismos de...

Exames knockout baseados em CRISPR-Cas9 em todo o epigenoma em células quimioresistentes

Aprenda a silenciar o gene BRCA2 usando siRNA em linhagens celulares humanas. Este método inclui duas rodadas de transfecção e análise por Western blotting para detectar proteínas de alto peso molecular em pesquisas sobre biologia do câncer.

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