Silenciamento de
12 de agosto de 2015
O silenciamento de genes por siRNA representa uma estratégia experimental conveniente para analisar funções biológicas dependentes de BRCA2 com implicações imediatas para entender melhor a biologia do câncer. Um método para silenciar eficientemente o BRCA2, juntamente com o procedimento experimental para detectar e quantificar alterações na expressão da proteína BRCA2 por immunoblotting em linhagens celulares humanas, é apresentado.
O objetivo geral deste procedimento é silenciar a expressão de B RCA dois por meio da transfeção de SIR A. Isso é realizado primeiramente preparando os complexos do reagente de transfeção de SIR a. Em seguida, uma primeira rodada de transfeção é realizada adicionando-se gota a gota os complexos a uma monocamada de células com 80% de confluência. Então, uma segunda rodada de transfeção com SIR a é realizada utilizando uma proporção maior de SIR, A em relação ao reagente de transfeção.
Por fim, as monocamadas celulares são lavadas com PBS frio e as células são lisadas a quatro graus Celsius com um tampão de lise baseado em detergente. Em última instância, a análise por Western blot é utilizada para demonstrar o silenciamento do B RCA A dois ao nível proteico. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite o silenciamento gênico eficiente, bem como a detecção ideal de proteínas de alto peso molecular, como o supressor tumoral B RCA dois. Para começar, após cultivar monocamadas de células epiteliais humanas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em uma câmara umidificada, remova o meio de crescimento e use PBS à temperatura ambiente para lavar as células.
Para destacar as células da placa, adicione dois mililitros de solução de tripsina 0,25% contendo EDTA 0,53 milimolar e incube por três a cinco minutos, dependendo do tipo celular. Neutralize a tripsina adicionando dois mililitros de meio de crescimento completo contendo 10% de FBS antes de transferir as células para um tubo de 15 mililitros. Coloque os tubos em um rotor de rotor oscilante e centrifugue a 320–330 Gs e quatro graus Celsius por três minutos.
Utilize cinco mililitros de meio livre de antibiótico para ressuspender os pellets antes de usar uma câmara de Burker ou sistema automatizado de contagem para quantificar as células. Em seguida, plaque aproximadamente 0,5 a 1 × 10⁶ células em dois mililitros de meio livre de antibiótico em cada poço de placas de seis poços e incube por 24 horas até atingir 80% de confluência. Após a incubação, prossiga com uma primeira rodada de transfeção diluindo seis microlitros de reagente de transfeção específico para irna baseado em lipídeos em 130 microlitros de meio com soro reduzido.
Dilua três microlitros de siRNA a 10 micromolar em 130 microlitros de meio com soro reduzido. Combine o siRNA diluído com um reagente de transfeção diluído e incube por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente. Durante a incubação, remova o meio das células e adicione dois mililitros de meio fresco sem antibióticos.
Pré-aqueça a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione 250 microlitros dos complexos do reagente de transfeção de siRNA a cada poço de células em uma placa de seis poços. Incube então as células em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Após 24 horas, dilua cinco microlitros de irna 10 micromolar em 130 microlitros de meio com soro reduzido e prossiga com uma segunda rodada de transfeção, conforme acabou de ser demonstrado. A alta concentração de sarna na segunda rodada é essencial para obter alta eficiência de silenciamento de B rca. A dois.
Incube as células a 37 graus Celsius por um a dois dias antes da análise, para preparar o lisado celular para análise por eletroforese a seguir à imunodetecção. Prepare tampão de lise fresco de acordo com a receita indicada aqui. Remova o meio das células e adicione dois mililitros por poço de PBS gelado para lavar as células.
Em seguida, remova completamente o PBS da placa e adicione 200 microlitros de tampão de lise gelado a cada poço. Gire suavemente a placa para distribuir uniformemente o tampão de lise e incube em agitador rotativo a quatro graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, utilizando uma espátula para células.
Colete o lisado celular em um tubo de microcentrífuga sobre gelo, centrifugue a 17.900 Gs e quatro graus Celsius por 25 minutos e colete o sobrenadante para realizar análise por imunoblot. Prepare o tampão de corrida diluindo 50 mililitros do tampão de corrida SDS tris-acetato 20x com 950 mililitros de água destilada. Prepare a amostra da seguinte forma.
Adicione 15 microgramas de lisado celular total. Cinco microlitros de tampão amostral quatro vezes contendo sulfato de lítio ESAL pH 8,4, 2 microlitros de DTT 0,5 molar e tampão de lise até um volume total de 20 microlitros. Desnature os amostras a 55 graus Celsius por 10 minutos.
É crucial utilizar essa temperatura, pois a proteína b RCA dois é termossensível. Em seguida, prepare a câmara eletroforética de acordo com as instruções do fabricante. Depois, carregue as amostras juntamente com 10 microlitros de um padrão proteico de alto peso molecular em um gel pré-moldado e realize a eletroforese a 120 volts por cerca de duas horas.
Enquanto isso, prepare o tampão de transferência com 50 mililitros de tampão de transferência 20x, 100 mililitros de metanol a 100% e 850 mililitros de água. Ative a membrana de PVDF mergulhando-a em metanol a 100% por cinco minutos. Enxágue com água destilada e equilibre no tampão de transferência por pelo menos cinco minutos.
Encharque as esponjas do aparelho de transferência em tampão de transferência a quatro graus Celsius até o uso. Interrompa a eletroforese antes que o marcador azul de cinquenta e cinco quilodaltons saia do gel pré-fabricado e monte o sanduíche começando com três esponjas encharcadas em tampão de transferência. Em seguida, um papel de três mm saturado em tampão de transferência.
Em seguida, adicione o gel, depois a membrana de PVDF ativada, seguida por um papel 3M embebido em tampão e, finalmente, três esponjas embebidas. Coloque o empilhamento no aparelho e transfira as proteínas a 350 miliampères por quatro horas a quatro graus Celsius ou a 180 miliampères e quatro graus Celsius durante a noite. Após a transferência, use TBS para lavar a membrana e bloqueie por uma hora com TBST e leite desnatado a 5%.
Em seguida, substitua o tampão por nove mililitros de tampão de leite TBST contendo 30 microlitros de anticorpo policlonal anti-BCA dois de coelho e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Após lavar a membrana três vezes com TBST, por dez minutos cada vez, incube o filtro por uma hora com um microlitro de anticorpo secundário anti-coelho conjugado à peroxidase de rábano-picante diluído em 10 mililitros de tampão de leite TBST. Após lavar a membrana três vezes, realize a imunodetecção quimioluminescente seguindo as instruções do fabricante.
Visualize as bandas em filmes ECL de alta resolução para confirmar a especificidade do B rca. A dois silenciamento. Um irna aleatório foi usado lado a lado com o irna B RCA dois, conforme mostrado aqui. Como mencionado anteriormente, é importante realizar uma segunda rodada de transfeção de irna com uma alta proporção de irna para transfeção, a fim de obter uma alta eficiência de silenciamento do B RCA A dois.
Os resultados aqui mostram a diferença na eficiência de silenciamento ao se usar uma proporção baixa e alta de siRNA para transfeção, dependendo do tipo celular. O tempo mínimo ideal para obter o maior nível de silenciamento gênico pode variar após a segunda rodada de transfeção de siRNA; por exemplo, conforme mostrado nesta figura, 24 horas são suficientes para células tireoidianas NTHY, mas até 48 horas são necessárias para um silenciamento eficiente de B RCA A dois em células prostáticas PNT uma. O silenciamento de B RCA dois é bastante estável até o sétimo dia após a segunda rodada de transfeção. Como mencionado anteriormente, desnaturar os lisados celulares em uma temperatura acima de 55 graus Celsius resulta em até 50% de perda da proteína B RCA A dois.
Neste experimento, examinou-se a sensibilidade de células PNT1A com B RCA A dois silenciado ao inibidor de PARP rucaparib após tratamento de 24 horas com a droga. Observou-se uma diminuição dependente do tempo na proliferação celular em células PNT1A com B RCA A dois esgotado em comparação com os controles. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como silenciar genes que codificam proteínas longas por meio de um CRNA e de como detectar eficientemente seu produto proteico por meio de um procedimento otimizado de imunobloqueio além do BRC A dois.
Esse método pode ser aplicado a muitas outras proteínas grandes desafiadoras, particularmente quando são expressas em níveis muito baixos nas células.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para silenciar a expressão de BRCA2 utilizando transfeção de siRNA em linhagens celulares humanas. O procedimento inclui a preparação de complexos de reagente de transfeção de siRNA e rodadas subsequentes de transfeção, seguidas por Western blot para avaliar os níveis da proteína BRCA2.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Silenciamento gênico
- Biologia do câncer
- Análise de expressão proteica
Contexto
- BRCA2 é um gene supressor de tumor essencial.
- Compreender sua regulação é fundamental para a pesquisa sobre câncer.
- O siRNA oferece uma abordagem direcionada para o silenciamento gênico.
- O Western blotting é um método confiável para detecção de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Silenciar eficientemente a expressão de BRCA2.
- Analisar os efeitos do silenciamento de BRCA2 nos níveis proteicos.
- Aprimorar metodologias para o estudo de genes relacionados ao câncer.
Métodos Utilizados
- Preparação de complexos de reagente de transfeção de siRNA.
- Duas rodadas de transfeção de siRNA em células cultivadas.
- Lavagem das células com PBS após a transfeção.
- Western blot para quantificar a expressão da proteína BRCA2.
Resultados Principais
- Conseguiu-se o silenciamento bem-sucedido de BRCA2.
- O Western blotting confirmou níveis reduzidos da proteína BRCA2.
- O método demonstrou eficiência no silenciamento gênico.
- Proteínas de alto peso molecular foram detectadas de forma eficaz.
Conclusões
- O método de transfeção de siRNA é eficaz para o silenciamento de BRCA2.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão das funções de BRCA2.
- Oferece uma ferramenta valiosa para a pesquisa em biologia do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O silenciamento eficiente de grandes proteínas supressoras de tumor, como a BRCA2, permite a investigação mecanicista de vias de reparo do DNA em modelos celulares humanos. Essa abordagem auxilia na validação de alvos ao estabelecer relações causais entre a perda da BRCA2 e fenótipos celulares relevantes para a descoberta de fármacos oncológicos. O protocolo aborda uma barreira técnica fundamental no estudo de proteínas de alto peso molecular, melhorando a reprodutibilidade em esforços pré-clínicos de desmistificação de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de vias reguladas pelo BRCA2 para esclarecer mecanismos de supressão tumoral em cânceres epiteliais.
- Valor Operacional: Alcança >70% de silenciamento do BRCA2 utilizando proporções otimizadas de transfeção com siRNA, possibilitando avaliação confiável do fenótipo.
- Valor Científico: Facilita a detecção da proteína endógena BRCA2 por desnaturação em baixa temperatura (55°C), preservando a integridade do epítopo para imunoblotagem.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Operacional: O fluxo de trabalho padronizado de transfeção de siRNA em duas etapas melhora a eficiência de transfeção para genes grandes, aumentando a robustez do ensaio.
- Valor Científico: Permite leituras quantitativas por Western blot dos níveis da proteína BRCA2 para correlacionar com resultados funcionais, como a sensibilidade ao inibidor de PARP.
- Valor Operacional: Compatível com lisados de baixa quantidade, permitindo triagem escalonável em campanhas de validação precoce de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona o silenciamento de BRCA2 com o aumento da sensibilidade a inibidores de PARP (por exemplo, rucaparib), apoiando modelos pré-clínicos orientados por biomarcadores.
- Valor Operacional: O knockdown estável por até sete dias após a transfeção permite ensaios fenotípicos de curso temporal em estudos de resposta a medicamentos.
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença, capaz de modelar mutações de perda de função em BRCA2 observadas em tumores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase de biologia de descoberta, permitindo a verificação de hipóteses e a elucidação de vias antes da identificação de compostos promissores e da validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao isolar a função da BRCA2 nas vias de reparo do DNA e estabilidade genômica.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas reprodutíveis ao nível proteico, essenciais para a padronização de ensaios em diferentes linhagens celulares.
- Análises: Gera sinais detectáveis de BRCA2 por meio de imunoblotagem otimizada, permitindo a comparação da eficiência de silenciamento e seus efeitos downstream.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a perda de BRCA2 com a sensibilidade aos inibidores de PARP, alinhando-se a estratégias translacionais de biomarcadores em modelos de câncer de ovário e de mama.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a outras proteínas grandes e de baixa abundância, posicionando-se como uma plataforma reutilizável para classes desafiadoras de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista em fenótipos relacionados ao BRCA2 ao permitir o silenciamento gênico específico e sustentado.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de proporções padronizadas de siRNA e lise em baixa temperatura, minimizando a variabilidade na detecção de proteínas de grande porte.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao validar a dependência do alvo em modelos pré-clínicos antes do investimento em compostos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos na via de reparo do DNA com base em evidências genéticas funcionais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na otimização da transfeção de siRNA e na imunodetecção de proteínas de alto peso molecular.
- Necessita de acesso a reagentes de transfeção, tampões de lise e sistemas de eletroforese compatíveis com a separação de proteínas grandes.
- Exige padronização das proporções entre siRNA e reagente, bem como do tempo de transfeção entre linhagens celulares, para obter silenciamento consistente.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes níveis de expressão de BRCA2 e eficiências de transfeção em diversos modelos epiteliais.
- É limitado pela termossensibilidade da BRCA2, exigindo controle preciso da temperatura durante o preparo das amostras para evitar a perda do epítopo.
