Name: Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de Coxiella burnetii mutantes por transposões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprenda a gerar mutantes fluorescentes de Coxiella burnetii por transposon e analisar fenótipos de replicação intracelular em células hospedeiras. Este método automatizado identifica genes essenciais para o ciclo infeccioso.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Avenir/ATIP para Matteo Bonazzi e um Marie Curie CIG (N° 293731) para Eric Martinez. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Robert Heinzen por compartilhar cepas, anticorpos e ferramentas de C. burnetii, Virginie Georget e Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) por sua assistência técnica e análise de dados.

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<li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+screening+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O estudo das interacções hospedeiro / agentes patogénicos tem provado ser um método notável compreender infecções bacterianas e desenvolver estratégias alternativas para combater doenças infecciosas. No entanto, devido à diversidade de estratégias elaboradas por diferentes agentes patogénicos bacterianos, a identificação e caracterização de factores de virulência da bactéria e do hospedeiro vias de sinalização que são alvo de infecções durante representam um verdadeiro desafio. Esta situação exige o desenvolvimento de novas abordagens para a identificação em larga escala de chave host / patógenos centros de interação. O desenvolvimento recente do inovador, de alto rendimento e técnicas de rastreio de alto conteúdo representa um recurso valioso que pode ser adaptado para o estudo de agentes patogénicos bacterianos intracelulares 15. Aqui, usamos o zoonótica bacteriana burnetii patógeno Coxiella como um modelo para desenvolver abordagens de triagem que combinam mutagénese por transposões e ensaios baseados em fluorescência. Importantly, este método de rastreio permite o monitoramento simultâneo de várias etapas do ciclo intracelular Coxiella, proporcionando uma visão global das estratégias desenvolvidas por esta bactéria para invadir, replicar e persistir dentro das células infectadas. A abordagem aqui descrita baseia-se em duas técnicas bem estabelecidas, mutagénese por transposões e ensaios baseados em fluorescência, que têm sido aplicados com sucesso para o estudo de agentes patogénicos bacterianos. Combinando estas técnicas no âmbito das telas de elevado rendimento / alto conteúdo permite-nos avaliar o efeito de um grande número de mutações bacterianas por meio da análise um número muito elevado de eventos (normalmente 15.000 células infectadas por mutações bacterianas são fotografados e analisados). Isso fornece uma análise estatística importante de eventos tais como a invasão bacteriana de células hospedeiras e replicação intracelular, que são, por natureza, sujeito a alta variabilidade. É importante notar que as outras linhas celulares que EPithelial pode ser utilizado para este tipo de rastreio. No entanto, as células epiteliais e planas grandes são adequados para a análise de imagem como organelos celulares hospedeiras são mais fáceis de detectar. Porque a maioria dos microscópios automatizados pode lidar automaticamente um grande número de placas, praticamente não há limites para o número de mutantes que podem ser rastreados simultaneamente. Dependendo do agente patogénico, o utilizador pode privilegiar a utilização de um epifluorescência ou um microscópio confocal. O tempo de aquisição de imagem irá principalmente depender da sensibilidade da câmara do microscópio, com o número de campos adquiridos por poço e sobre o número de canais adquiridos por campo de visão. O usuário pode decidir como ajustar esses fatores para otimizar o protocolo de triagem. Como um exemplo, que trabalhada uma placa de 96 poços / h utilizando as condições indicadas no ponto 5.1. A análise de imagem depende em grande parte da máquina (ou um conjunto de máquinas) utilizado. Nós usamos um 12-core (2 x 3,06 GHz 6-Core), 48 GB RAM estação de trabalho. Esta máquina exige aproximadamente 40 min para analisar imagens obtidas a partir de uma placa. Um aspecto importante a ter em conta no desenvolvimento destes ensaios é a criação de novo (ou a optimização de protocolos existentes) para permitir a manipulação e processamento de um grande número de amostras. Um exemplo típico é o desenvolvimento da colónia única abordagem de PCR primário, o que nos permitiu amplificar rapidamente e fragmentos de sequência de ADN Coxiella contendo o local de inserção de transposão cada, a partir de amostras muito pequenas. Com base na nossa experiência, a polimerase de alta fidelidade tem de ser cuidadosamente seleccionados e testados a fim de obter resultados reprodutíveis. A única limitação desta abordagem podem esconder-se na observação de que, na maioria dos casos, cerca de 30% das amostras processadas não são exploráveis, quer devido ao PCR ou as etapas de sequenciação. No entanto, considerando que o isolamento de novos mutantes por transposões Coxiella não é um passo limitante da velocidade, isto não represenenviou uma questão importante. Do mesmo modo, o desenvolvimento de um ensaio fiável para a quantificação da concentração bacteriana de existências mutantes tem sido a chave para esta abordagem. Devido à tendência de Coxiella para agregar quando em suspensão, a utilização das leituras da densidade óptica não é aplicável para calcular a concentração de culturas e Coxiella a única alternativa existente foi de PCR quantitativa (qPCR). Aqui, a utilização de um agente intercalante de ADN fluorescente etiquetado acelerou significativamente bactérias quantificação. Esta abordagem também pode tomar vantagem da utilização de linhas de células estáveis ​​que expressam marcadores fluorescentes para vários compartimentos intracelulares, dependendo do agente patogénico utilizada. Outro aspecto importante é a utilização de meios de cultura celular isento de vermelho de fenol. Observou-se que este indicador de pH tem uma fluorescência natural que mede o espectro vermelho e verde que satura o sinal gravado no leitor de fluorescência automatizado. Tele estratégia aqui apresentada baseia-se na mutagénese de transposão aleatório. Para os mutantes de interesse, recomendamos validar transposições únicas (e clonalidade) utilizando transferência de Southern e amplificações de PCR do local de inserção do transposão. Além dos equipamentos descritos na seção de protocolo, equipes interessadas em usar a abordagem de triagem aqui apresentado, terá grande vantagem no set up de um banco de dados relacional para coleta de dados, um servidor para armazenamento de dados e uma estação de trabalho para análise de imagem rápida. Mais importante, o método aqui descrito é adequado para o estudo de outros agentes patogénicos bacterianos intracelulares proporcionado um método de mutagénese aleatória existe para o agente patogénico, as linhas celulares podem ser infectadas pelo agente patogénico e este exibe um fenótipo específico durante a infecção.

A bactéria endêmica emergente Coxiella burnetii é responsável por grandes surtos de febre Q, uma zoonose gripal debilitante com graves na saúde eo impacto económico 1. Os principais reservatórios de Coxiella são animais domésticos e de quinta, e estima-se que mais de 90% do gado leiteiro em os EUA realizar C. burnetii 2. Os seres humanos são hospedeiros acidentais que estão infectadas por inalação de aerossóis contaminados. Febre Q humana se manifesta seja como uma doença aguda ou crônica, que pode ter complicações fatais com uma taxa de mortalidade chegar a 65% 1,3. Com uma dose infecciosa de 1 - 10 organismos, Coxiella é o agente patogénico mais infecciosa, conhecida e tem sido investigado como uma potencial arma bio 4. O recente surto explosivo de febre Q nos Países Baixos (2007 - 2010), com os casos crescentes de 182 para mais de 2.000 por ano, se destaca como um exemplo da virulência grave deste patógeno5. A notável eficiência de infecções Coxiella é provável associada com a sua resistência ao estresse ambiental, combinada com a sua adaptação única para as células hospedeiras. Com efeito, Coxiella está presente no ambiente na forma de variantes de pequenas células metabolicamente inactivas (SCV), que são extremamente resistentes a várias condições adversas (dessecação, temperatura, etc.). VCEs são tomadas pelos células fagocíticas através α V β 3 integrinas 6 enquanto a invasão de células não fagocíticas é mediada pela adesão Coxiella / invasão OmpA 7 e um receptor ainda não identificado. Na sequência de captação, Coxiella reside em vacúolos apertadas, positivas para os marcadores endossomais primeiros Rab5 e EEA1 8. Bactérias responder aos endosomal acidificação através da conversão de grandes variantes de células metabolicamente ativas (VCL) e ativar um sistema Dot / Icm tipo 4 secreção (T4SS) 9, Altamente homóloga à de Legionella pneumophila 10. A secreção de effectors Dot / Icm permitir Coxiella para gerar um grande compartimento, LAMP1-positivo ácida contendo enzimas lisossomais activos onde as bactérias podem prosperar e ativamente protegem as células infectadas da apoptose 11. Assim, o ciclo intracelular de Coxiella é controlada pela translocação Dot / Icm-mediada de efectores bacterianas 12, no entanto, os factores microbianas envolvidas na invasão de célula hospedeira, a replicação bacteriana e a disseminação da infecção permanecem em grande parte desconhecida. A combinação de mutagénese de transposões e ensaios baseados em fluorescência, que estão a desenvolver abordagens imparciais para a identificação simultânea de factores bacterianos envolvidos nas principais etapas de infecções Coxiella: 1) internalização dentro das células hospedeiras, 2) replicação intracelular, 3) propagação de célula-a-célula , e 4) de persistência. Até à data, temos selecionados mais de 1.000 mutations em 500 sequências codificantes Coxiella, que nos forneceram com insights sem precedentes sobre as interações patógeno-hospedeiro que regulam Coxiella patogênese 7. De notar que esta abordagem pode ser aplicada ao estudo de outros agentes patogénicos intracelulares que compartilham características da biologia celular com Coxiella.

<table><tbody><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Sigma</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 componente médio Cloreto de</td></tr><tr><td>magnésio</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Sulfato de ferro</td><td>Sigma</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptona</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Casamino ácidos</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td> <td>223050</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Metil-B-ciclodextrina</td><td>Sigma</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>RPMI com glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>RPMI com glutamax, sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>Para cultura de células e infecção</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>GE SH30071 de saúde</td><td></td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>Para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>Para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação 0,1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Para transformação Coxiella</td></tr><tr><td>Trackmates tubos com tampa de rosca</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D com tampa de rosca com código de barras</td></tr><tr><td>Microplaca de 96 poços com paredes e fundo pretos</td><td>Greiner</td><td>655076</td><td>Fundo escuro plano, para quantificação de dsDNA</td></tr><tr><td>Microplaca de PCR de 96 poços</td><td>Biorad</td><td>2239441</td> Placa livre de 96 poços de <td>DNAse / RNAse</td></tr><tr>, <td>949481</td><td>Labcon deepwell</td><td></td><td>Para infecções por mutantes Coxiella</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>Para quantificação de dsDNA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>Para quantificação de dsDNA</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td>Para solteiro PCR para colônia de primer PCR</td></tr><tr><td>Celltracker Red CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>para imagem Anticorpo</td></tr><tr><td>anti-LAMP1</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Para coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>Para imagem</td></tr><tr><td>Imagem Leitor de microplacas de fluorescência Infinite 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio automatizado de epifluorescência Cellomics</td><td>Thermo Científico</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

geração e multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasão e colonização de células hospedeiras por agentes patogénicos bacterianos depender da actividade de um grande número de proteínas procarióticas, definida como factores de virulência, que pode subverter e manipular funções principais hospedeiras. O estudo das interações hospedeiro / agente patogénico é, portanto, extremamente importante compreender infecções bacterianas e desenvolver estratégias alternativas para combater as doenças infecciosas. Esta abordagem, no entanto, requer o desenvolvimento de novos ensaios de alto rendimento para a imparcial, identificação e caracterização automatizado de determinantes de virulência da bactéria. Aqui, nós descrevemos um método para a geração de uma biblioteca mutante marcadas com GFP através de mutagénese de transposões e o desenvolvimento de rastreio de alto conteúdo-abordagens para a identificação simultânea de vários fenótipos associada-transposões. O nosso modelo de trabalho é o agente patogénico bacteriano burnetii Coxiella intracelular, o agente etiológico da febre zoonose Q, que está associada com o SEvere surtos, com o consequente saúde e dos custos económicos. A natureza intracelular obrigatório deste patógeno, até recentemente, severamente prejudicado a identificação de fatores bacterianos envolvidos na interação patógeno anfitrião, fazendo de Coxiella o modelo ideal para a implementação de abordagens de alto rendimento / alto conteúdo.

Após o isolamento de mutantes por transposões, única colónia de iniciadores de PCR é um método robusto, de alto rendimento para identificar o local de inserção de transposões para cada mutante. Esta abordagem deriva de um protocolo típico de PCR aninhada, mas aqui uma única escorva híbrida especificamente e / ou não-especificamente ao ADN molde, dependendo da severidade da temperatura de emparelhamento (Figura 1A). Os produtos de PCR típicas consistem de vários fragmentos de DNA, a maioria dos quais são específicos (Figura 1B). O uso de um iniciador de sequenciação diferentes que emparelha direito a montante da ITR de transposões, e a jusante da sequência reconhecida pelo iniciador de amplificação fornece especificidade para o passo de sequenciação (Figura 1C). Automated software para análise da sequência alinha as sequências obtidas para o genoma Coxiella proporcionando o local exacto de inserções de transposões (Figura 1C). Todas as inserções de transposões pode ser, em seguida, Annotated no genoma Coxiella (Figura 1D). Cada mutante Coxiella é isolado e amplificado em culturas puras ACCM-2 antes ou meio de armazenamento ou de rastreio. A Figura 2 ilustra um exemplo de 38 mutantes por transposões em 16 pontos / genes Coxiella ICM (Figura 2A). Para avaliar a viabilidade de mutantes Coxiella, curvas de crescimento axénicos são obtidos por amostragem culturas bacterianas durante 7 dias após a inoculação e a aplicação do ensaio de concentração de bactérias descrito em 1.5 (Figurie 2B). Mutantes amplificados foram então incubadas com as células epiteliais, em triplicado em placas de 96 cavidades durante 7 dias. Todos os mutantes gerados Coxiella sendo marcado com GFP, as curvas de crescimento intracelulares são obtidos através da medição da intensidade de fluorescência da GFP de todos os poços, a cada 24 horas, e traçando os valores medidos como uma função do tempo (Figura 2C). IntrAs curvas de crescimento acelulares fornecer uma análise quantitativa dos fenótipos associados com cada inserção de transposão no genoma Coxiella. Para adicionar informações qualitativas sobre os mesmos mutantes por transposões, optamos por aquisição de imagem automatizada e análise. Sete dias após a infecção, as placas são fixos, processado por imunofluorescência como descrito em 4 e analisados ​​utilizando um sistema automatizado, microscópio de epifluorescência, conforme descrito no 5. automatizado software de análise de imagem, tais como CellProfiler (Instituto Broad, <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ) processa os canais adquiridos de forma independente e os segmentos identificados objectos de análise comparativa (Figura 3). Isto permite a identificação e caracterização morfológica dos núcleos de células hospedeiras, os contornos celulares, lisossomas e Coxiella colónias (Figura 3 painéis superiores). Correlacionando colônias Coxiella com células e permite que os lisossomos identificatie na análise morfológica específica de Coxiella vacúolos molecular contendo (que são LAMP1 positivo, a Figura 3 painel inferior esquerdo). Correlacionando colônias Coxiella com contornos célula hospedeira permite a identificação e análise morfológica específica de células infectadas (Figura 3 painel central inferior). Finalmente, os quatro canais são mesclados para fins de controle de qualidade e ilustração (Figura 3 painel inferior direito). Os dados obtidos a partir de análise de imagem automatizada pode ser representada graficamente contra o outro para se obter &quot;diagramas de dispersão de multi-fenotípicas&quot;. A título de exemplo, na Figura 4A a área média (em uM 2) de colónias Coxiella é representada em função do número de colónias por células (Figura 4A), a fim de identificar mutações que afectam a replicação intracelular de Coxiella (fenótipo de replicação) e / ou a capacidade das bactérias para invadir as células hospedeiras (internazação fenótipo). A análise estatística foi utilizado para definir as regiões no gráfico de dispersão resultante correspondendo a leve (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenótipos. Os mutantes foram observadas em três grupos principais: as mutações que resultaram em um crescimento intracelular defeituoso de Coxiella foram agrupados na parte mais à esquerda do gráfico (Figura 4A, rosa e pontos vermelhos); mutações que afetaram internalização Coxiella em células foram agrupados na parte inferior do gráfico (Figura 4A, luz e azul escuro pontos) e, finalmente, pontos verdes no mais à direita região da trama correspondem a mutações, resultando em fenótipos não-significativos ( Z-score&gt; -2). É importante ressaltar que os mutantes que não conseguem replicar, mas ainda são capazes de invadir as células hospedeiras, são detectados após 7 dias de infecção como bactérias individuais ou pequenas colónias adjacentes, para sediar núcleos celulares (Figura 4C, segundo painel). Assim, o tamanho de Coxiella &quot;Colosas &quot;será significativamente afectada, mas o número de células infectadas não irá variar, em comparação com as células infectadas pelo WT Coxiella. Pelo contrário, as mutações que afectam a capacidade de Coxiella de invadir células hospedeiras resultar numa diminuição do número de colónias / célula. Quando este número é significativamente inferior a 1, que indica que, em média, há uma diminuição no número total de células infectadas. Em alternativa, a área média (em uM 2) de colónias Coxiella pode ser registada em função do número de células hospedeiras sobreviventes infecção (Figura 4B), para identificar mutações que conferem citotoxicidade para Coxiella (fenótipo citotóxico). Como acima, a análise estatística foi utilizado para definir as regiões no gráfico de dispersão resultante correspondendo a leve (-4 &lt;Z-score ≤ -2) e grave (Z-score ≤ -4) fenótipos. Mais rastreados mutações não afecta significativamente a sobrevivência das células, independentemente da replicação bacteriana dentro hospedeirocélulas (Figura 3B pontos verdes). 37 mutações sobrevivência da célula hospedeira levemente afetado (Figura 3B, pontos de luz vermelha), e 7 mutações foram particularmente prejudicial para sediar a sobrevivência das células (Figura 3B, pontos vermelho escuro). Por favor note que os parâmetros adicionais obtidos pelo processo automatizado de análise de imagem pode ser usada para derivar outras tabelas, de acordo com as necessidades experimentais. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. A sequenciação e anotação dos mutantes por transposões Coxiella (A) colónia único iniciador de PCR é utilizado para amplificar fragmentos de DNA contendo o local de inserção de transposão. Um iniciador de amplificação (AMP) é utilizado tanto como um iniciador específico e não específico, dependendo da severidade da temperatura de recozimento. (B) resultado típico da única colónia de iniciadores de PCR. Cada Reactiem produz um número de fragmentos de tamanho variável, algumas das quais contêm o local de inserção do transposão; alguns outros, são amplificados ao acaso como subprodutos do ciclo de PCR de baixa restringência. (C) O uso de um iniciador de sequenciação (Seq) que hibrida com a sequência de transposões permite a sequenciação dos fragmentos de interesse. Software (D) A análise da seqüência permite a anotação automática de inserções de transposões no genoma bacteriano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2:. Axenic e crescimento intracelular de Coxiella mutantes por transposões (A) Na tela de piloto, temos isolado, sequenciado e rastreados 38 mutantes por transposões em 16 g de núcleoenos o sistema de secreção de pontos / icm Coxiella (indicados a vermelho). (B) A fim de avaliar a viabilidade de cada mutante de transposão, o crescimento de cada isolado em meio de cultura axénica é monitorizado ao longo de 8 dias, utilizando um agente fluorescente intercalante com etiquetas de ADN. (C) Cada mutante é então utilizado para infectar as células epiteliais. Como o transposon possui uma cassete de GFP, o crescimento bacteriano intracelular é monitorado mais de 7 dias de infecção, seguindo as variações de fluorescência da GFP associada à replicação Coxiella, usando um leitor de microplacas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: automatizado de análise de imagem de infecções Coxiella Um auto.Acoplado microscópio de epifluorescência, é utilizado para a imagem 21 posições por poço em triplicado de placas de 96 poços. Os segmentos de software de análise de imagem objetos em cada canais adquiridos para a quantificação e análise. Em todos os casos, os objetos que tocam a fronteira das imagens são excluídos. (A) O canal Hoechst é usado para identificar os núcleos de células hospedeiras (circulado em verde). (B) Estes são utilizados como sementes para identificar os contornos da célula hospedeira no canal Cy3 (a posição dos núcleos é circulado em azul, contornos celulares estão em verde). (C) O canal Cy5 é usado para identificar os compartimentos LAMP1-positivo (circulado em verde); apenas os objetos incluídos nos contornos de células previamente identificadas (em vermelho) são retidas para análise de imagens. (D) O canal de GFP é utilizada para identificar colónias Coxiella (circulado em verde). (E) Correlacionando colônias Coxiella com compartimentos LAMP1-positivo permite a identificação de Coxiella </em&gt; vacúolos molecular contendo (CCVS); apenas os objetos incluídos nos contornos de células previamente identificadas (em verde) são retidas para análise de imagens. (F) correlacionar a colónias Coxiella com contornos celulares permite a identificação de células infectadas (pseudocolored). (G) Imagens adquiridos nos 4 canais de fluorescência (correspondendo a colônias Coxiella (verde), núcleos de células hospedeiras (azul), membrana plasmática da célula hospedeira (cinza), compartimentos LAMP1-positivo (vermelho)) são fundidas e usado para a ilustração e qualidade ao controle. Escala de barras 10 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4: identificação em larga escala de fatores Coxiella envolvidas no host / interagem patógenoíons. (A) A área média (em mm 2) de colônias Coxiella é plotado contra o número relativo de colônias por célula, para identificar de replicação e de internalização fenótipos de interesse. Pontos verdes representam fenótipos que se afastam do WT Coxiella por um Z-score&gt; -2 (não significativa). Rosa e os pontos azuis representam luz de replicação e de internalização fenótipos respectivamente, com um escore Z entre -2 e -4 (fenótipos leves). Vermelho e pontos azuis escuras representam fenótipos com uma ≤ Z-score (-4 fenótipos fortes). (B) A área média (em uM 2) de colónias Coxiella foi representada graficamente em função do número total de células (infectados e não infectados) que sobreviveram 7 dias após a infecção para calcular o efeito citotóxico resultante de inserções de transposões. Pontos verdes representam fenótipos que se afastam do WT Coxiella por um Z-score&gt; -2 (não significativa). Pontos cor de rosa representam citotóxica phenotypes com um Z-score entre -2 e -4 (fenótipos leve). Pontos vermelhos representam fenótipos citotóxicos com uma ≤ Z-score (-4 fenótipos fortes). As setas indicam os mutantes ilustrados pela letra minúscula correspondente em C. (C) Imagens representativas de replicação, internalização e fenótipos citotóxicos. Em todos os casos, os núcleos de células hospedeiras estão em vermelho, Coxiella colónias estão a verde. Escala de barras de 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar em larga escala os fatores COE implicados nas etapas-chave do ciclo infeccioso, incluindo a entrada nas células hospedeiras, a geração de um nicho replicativo bacteriano e a persistência. Isso é realizado primeiramente gerando uma biblioteca de mutantes duplos GF PT por meio de mutagênese por transposição.Em seguida, as células hospedeiras são infectadas com cada mutante isolado. Então, a replicação intracelular de cada mutante é acompanhada em tempo real utilizando um leitor de microplacas, com o objetivo de identificar as mutações que mais prejudicam a infecção por Coxiella. Por fim, as células infectadas por Coxiella são analisadas por microscopia automatizada.Por fim, a análise automatizada de imagens permite a caracterização morfológica de cada fenótipo obtido, associando cada gene mutado a uma função putativa no ciclo infeccioso de Coxiella. Este método pode ajudar a abordar questões fundamentais no campo das interações entre patógenos e hospedeiros, como a identificação em larga escala dos genes essenciais de um determinado patógeno necessários para interagir com a célula inteira e sequestrar suas maquinarias moleculares em seu benefício. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o plaqueamento e o isolamento de colônias de COE são difíceis de realizar.De fato, o COE forma colônias muito pequenas que precisam ser cuidadosamente extraídas do ACCM macio em duas semanas. Como este método pode fornecer informações sobre infecções por bactérias cocais. Ele também pode ser aplicado a outras bactérias patogênicas intracelulares, como *Salmonella*, *Burel*, *Mycobacterium*, entre outras.Após transformar células competentes de Coxiella com plasmídeos revestidos de transposon e transposase conforme o protocolo descrito, para isolar mutantes individuais, prepare o ágar inferior misturando 10 mililitros de ágar derretido a 0,5% com 10 mililitros de ACCM 2X em uma cabine de segurança microbiana (CSM) e adicione imediatamente os antibióticos apropriados, despeje imediatamente em uma placa de Petri e deixe esfriar descoberta por 30 minutos e, em seguida, seque ao ar por 20 minutos. Para preparar o ágar superior, misture 1,25 mililitros de ACCM 2X com 0,75 mililitros de água em um tubo de poliestireno de 15 mililitros. Adicione os antibióticos apropriados e incube a 37 graus Celsius.Em seguida, adicione de um a 100 microlitros de cultura bacteriana e vortex por cinco segundos. Depois, adicione 0,5 mililitros da mistura de aros derretida e despeje imediatamente sobre o aros inferior. Deixe a placa esfriar por 20 minutos.Cole a tampa e incube a quatro graus Celsius por 20 minutos para auxiliar na solidificação. Em seguida, remova a tampa e seque a placa ao ar por 20 minutos antes de transferi-la para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 2,5% de oxigênio por seis a sete dias. Assim que as colônias forem detectáveis, colete-as cortando a extremidade da ponteira de um micropipetador de um mililitro e utilizando-a para isolar tampões contendo colônias individuais.Em seguida, transfira-as para os poços de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mililitros de accm dois. Após preparar uma curva padrão, de acordo com o protocolo descrito no texto, quantifique cada suspensão bacteriana dispensando cinco microlitros de Triton X 100 a 10% por poço. Em uma microplaca de 96 poços com paredes e fundo pretos, adicione 50 microlitros das suspensões bacterianas a cada poço e incube em agitador de placa durante 10 minutos.À temperatura ambiente, utilize um tampão XTE para diluir o reagente de quantificação de DNA de cadeia dupla na proporção de 1 para 200 e adicione 55 microlitros do reagente diluído a cada amostra. Na placa de microplaca de 96 poços, agite bem com um agitador de placa antes de incubar no escuro à temperatura ambiente por dois a cinco minutos. Meça a fluorescência das amostras utilizando um leitor de microplaca com fluorescência e filtros para comprimentos de onda padrão de fluoresceína. Para obter o gráfico da concentração de DNA bacteriano, utilize as leituras de fluorescência na curva padrão previamente preparada e divida a concentração de DNA pela massa do genoma de Coxiella para obter a concentração bacteriana.Expresse os resultados em equivalentes genômicos por mililitro após realizar a PCR de colônia com um único par de primers e o sequenciamento de DNA de acordo com o protocolo descrito no texto. Utilizando um software de análise de sequência, carregue o genoma completo anotado de Coxiella Burnett I 4 93 NM um com a função de alinhamento ao genoma de referência, carregue e alinhe os resultados das sequências utilizando o blast N e determine o sítio de transposição. Após preparar uma suspensão de células Vero de 10 à quinta células por mililitro em meio RPMI, de acordo com o protocolo descrito no texto, distribua 100 microlitros da suspensão em cada poço de uma placa de 96 poços preta com fundo plano e transparente, centrifugue a placa a 400 vezes G por cinco minutos e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite.No dia seguinte, transfira à temperatura ambiente placas de 96 poços contendo os mutantes de Coxiella e dilua 150 microlitros de suspensões bacterianas em 300 microlitros de RPMI sem vermelho de fenol e FBS em uma placa de 96 poços com poços profundos. Em seguida, remova o meio das células Vero e distribua 100 microlitros por poço dos mutantes de Coxiella diluídos. Utilize o poço A1 como controle negativo e os poços A2 e A3 como controles positivos. Usando um suporte para placa hermético contra aerossóis, centrifugue a placa a 400 × g e temperatura ambiente por 10 minutos. Após isso, incube a placa a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono por duas horas. Substitua então o meio contendo as bactérias por 100 microlitros por poço de meio RPMI completo fresco e leia em um leitor de microplacas com fluorescência e filtros para fluoresceína.Meça a fluorescência de GFP diariamente durante sete dias. No sétimo dia após a infecção, remova o meio da placa e substitua por 50 microlitros por poço de meio completo fresco contendo uma diluição de um para 1000 de corante fluorescente permeável à célula. Incube as células por 30 a 60 minutos; após a incubação, substitua o meio por 50 microlitros por poço de PFA 4% em PBS e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova o tampão contendo PFA antes de usar PBS para lavar os poços três vezes. Após a remoção da última lavagem, adicione 50 microlitros de solução bloqueadora a cada poço e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.Em seguida, substitua a solução bloqueadora por 40 microlitros por poço, uma solução bloqueadora fresca e uma diluição de 1 para 500 do anticorpo anti-LAMP1. Após incubação à temperatura ambiente por 30 minutos, remova a solução e utilize um lavador de placas para lavar os poços cinco vezes, aplicando 100 microlitros por poço de PBS. Em seguida, adicione 40 microlitros por poço da solução bloqueadora contendo o anticorpo secundário fluorescente apropriado e HOOK3 3 2 5 8 a cinco microgramas por mililitro.Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar as amostras cinco vezes e deixar a lavagem final com PBS nos poços para evitar que sequem. Para realizar a aquisição de imagens, utilizar um microscópio automatizado de fluorescência de epifluorescência equipado com uma objetiva de 20 x e canais de 3 4 88 5 55 e seis 15 nanômetros.Adquira 21 campos independentes por poço para imaginar um mínimo de 5.000 células por amostra. Aplique o foco automático utilizando o canal dos núcleos das células hospedeiras como referência. Finalmente, utilize análise automatizada de imagens para extrapolar uma série de características relevantes das imagens adquiridas.Esta figura ilustra 38 transposições em mutantes no ponto 16 ICM Coxe L em genes. Curvas de crescimento que avaliam a viabilidade de mutantes são mostradas aqui. Curvas de crescimento intracelular para mutantes de Coxiella incubados com células epiteliais fornecem uma análise quantitativa dos fenótipos associados às inserções de transposição no genoma de Coxiella. Nesta figura, a aquisição automatizada de imagens foi realizada para identificar e caracterizar núcleos celulares do hospedeiro, contornos celulares, lisossomos e colônias de Coxiella.A correlação entre colônias de Coxiella e células e lisossomos permite a análise morfológica de vacúolos contendo Coxiella. A correlação entre colônias de Coxiella e contornos de células hospedeiras permite a análise morfológica de células infectadas. Por fim, os quatro canais são combinados.A área média das colônias de Coxiella é representada graficamente em função do número de colônias por célula, a fim de identificar mutações que afetem a replicação intracelular da Coxiella e/ou a capacidade das bactérias de invadir células hospedeiras. Os mutantes foram observados em três grupos: mutações que afetaram o crescimento intracelular da Coxiella, a internalização da Coxiella nas células e fenótipos não significativos. Aqui, a área média das colônias de Coxiella é representada graficamente em função do número de células hospedeiras sobreviventes à infecção, para identificar mutações que confiram citotoxicidade à Coxiella após seu desenvolvimento.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de infecções bacterianas explorarem as interações entre hospedeiro e patógeno em larga escala, e identificou alvos do hospedeiro e bacterianos para o desenvolvimento de novas terapias contra doenças infecciosas.

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Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

Este vídeo demonstra um método para avaliar o crescimento intracelular de mutantes de Coxiella marcados com GFP dentro de células epiteliais cultivadas. O fenótipo mutante é visualizado por meio de imunocoloração e microscopia de epifluorescência, permitindo o estudo do efeito da mutação no crescimento intracelular.

Avaliação do crescimento intracelular de mutantes de Coxiella em células eucarióticas

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Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

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Abordagem genética para a frente para descobrir genes de resistência a estresse em ratos - Uma tela de alta capacidade em células ES

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Aprenda a gerar mutantes fluorescentes de Coxiella burnetii por transposon e analisar fenótipos de replicação intracelular em células hospedeiras. Este método automatizado identifica genes essenciais para o ciclo infeccioso.

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