Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de Coxiella burnetii mutantes por transposões

O objetivo geral deste procedimento é identificar em grande escala. Os fatores COE implicados nas principais etapas do ciclo infeccioso, incluindo a entrada nas células hospedeiras, geração de um nicho replicativo bacteriano e persistência. Isso é feito primeiro gerando uma biblioteca de comutantes GF PT por transposição na mutagênese.

Em seguida, as células hospedeiras são infectadas com cada mutante isolado. Em seguida, a replicação intracelular de cada mutante é acompanhada em tempo real usando um leitor de microplacas para identificar as mutações mais prejudiciais à infecção por coxiella. Finalmente, as células infectadas por coxiella são analisadas por microscopia automatizada.

Em última análise, a análise automatizada de imagens permite a caracterização morfológica de cada fenótipo obtido para associar cada gene mutado a uma função putativa no ciclo infeccioso da coxiella. Este método pode ajudar a resolver questões-chave no campo das interações patógeno hospedeiro, como a identificação em larga escala dos genes essenciais de um determinado patógeno necessários para interagir com toda a célula e sequestrar suas máquinas moleculares em seu benefício. A demonstração visual deste método é crítica, pois o plaqueamento e o isolamento das colônias COE são difíceis de alcançar.

De fato, o COE forma colônias muito pequenas que precisam ser cuidadosamente extraídas do ACCM macio dois aro. Como esse método pode fornecer informações sobre a infecção do laboratório de coco. Também pode ser aplicado a outras bactérias patogênicas intracelulares, como salmonela, burel, micobactéria, etc.

Depois de transformar coxiella competente com plasmídeos de revestimento de transposon e transposase de acordo com o protocolo de texto, para isolar mutantes individuais, prepare o aros inferior misturando 10 mililitros de 0,5% aros derretido com 10 mililitros de dois X accm, dois em um gabinete de segurança microbiana ou MSC e adicione os antibióticos apropriados imediatamente despeje em uma placa de Petri e deixe esfriar descoberto por 30 minutos e depois secar ao ar por 20 minutos. Para preparar o saco superior aros, misture 1,25 mililitros de dois x accm dois com 0,75 mililitros de água em um tubo de poliestireno de 15 mililitros. Adicione os antibióticos apropriados e incube a 37 graus Celsius.

Em seguida, adicione um a 100 microlitros de cultura bacteriana e vórtice por cinco segundos. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de mistura de aros derretido e despeje imediatamente sobre o aros inferior. Deixe o prato esfriar por 20 minutos.

Coloque a tampa por cima e incube a quatro graus Celsius por 20 minutos para ajudar a solidificar. Em seguida, remova a tampa e seque a placa ao ar por 20 minutos antes de transferir para uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 2,5% de oxigênio por seis a sete dias. Assim que as colônias forem detectáveis, colete-as cortando a ponta de uma ponta de pipeta de um mililitro e usando-a para isolar os tampões contendo colônias únicas.

Em seguida, transferindo-os para os poços de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mililitros de accm dois. Após a preparação de uma curva padrão, de acordo com o protocolo de texto, quantificar cada suspensão bacteriana dispensando cinco microlitros de 10%Triton X 100 por poço. Em uma microplaca de 96 poços com paredes e fundo pretos, adicione 50 microlitros das suspensões bacterianas a cada poço e incube em um agitador de placas por 10 minutos.

À temperatura ambiente, use um tampão XTE para diluir o reagente de quantificação de DNA de fita dupla um a 200 e adicione 55 microlitros do reagente diluído a cada amostra. Na microplaca de 96 poços com um agitador de placas bem misturado antes de incubar no escuro à temperatura ambiente por dois a cinco minutos, meça a fluorescência das amostras usando um leitor de microplacas de fluorescência e filtros para comprimentos de onda de fluoresceína padrão. Para obter o gráfico de concentração de DNA bacteriano, as leituras de fluorescência na curva padrão previamente preparada, dividem a concentração de DNA pela massa do genoma da coxiella para obter a concentração bacteriana.

Expresse os resultados em equivalentes de genoma por mililitro após a realização de PCR de colônia de primer único e sequenciamento de DNA de acordo com o protocolo de texto. Usando o software de análise de sequência, carregue o genoma anotado completo de Coxiella Burnett I 4 93 NM com a função de alinhamento com a referência, carregue e alinhe os resultados da sequência usando a explosão N e determine o local de transposição. Depois de preparar uma suspensão de células Vero de 10 a quinta células por mililitro em meio RPMI, de acordo com o protocolo de texto, dispense 100 microlitros da suspensão em cada poço de uma placa preta de 96 poços com fundo plano e transparente, centrifugue a placa a 400 vezes G e deixe por cinco minutos e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite.

No dia seguinte, caia à temperatura ambiente placas de 96 poços contendo os mutantes de coxiella e dilua 150 microlitros de suspensões bacterianas em 300 microlitros de RPMI sem vermelho de fenol e FBS em uma placa de 96 poços profundos em seguida, remova o meio das células Vero e dispense 100 microlitros por poço de mutantes de coxiella diluídos. Use o poço A como controle negativo e os poços dois e três como controles positivos usando um suporte de placa centrífuga estanque a aerossol centrifugue a placa a 400 vezes G e temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, depois de incubar a placa a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono por duas horas, substitua as bactérias contendo o meio por 100 microlitros por poço de meio RPMI completo fresco por um leitor de microplacas de fluorescência e filtros para fluoresceína.

Meça a fluorescência GFP todos os dias durante sete dias No sétimo dia pós-infecção, remova o meio da placa e substitua-o por 50 microlitros por poço de meio completo fresco contendo uma diluição de um a 1000 de corante fluorescente permeável a células. Incubar as células por 30 a 60 minutos após a incubação, substituir o meio por 50 microlitros por poço de 4%PFA em PBS incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova o tampão contendo PFA antes de usar PBS para lavar os poços três vezes Após remover a lavagem final, dispense 50 microlitros de solução de bloqueio em cada poço e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, substitua a solução de bloqueio por 40 microlitros por poço, uma nova solução de bloqueio e uma diluição de um a 500 anticorpo anti-lâmpada. Depois de incubar em temperatura ambiente por 30 minutos, remova a solução e use uma lavadora de placas para lavar os poços cinco vezes, aplicando 100 microlitros por poço de PBS. Em seguida, adicione 40 microlitros por poço de solução de bloqueio contendo o anticorpo secundário fluorescente apropriado e enganchado 3 3 2 5 8 a cinco microgramas por mililitro.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave as amostras cinco vezes e deixe a lavagem final do PBS nos poços para evitar que sequem. Para realizar a aquisição de imagens, use um microscópio automatizado de epifluorescência equipado com uma objetiva de 20 x e 3 4 88 5 55 e seis canais de 15 nanômetros.

Adquira 21 campos independentes por poço para obter imagens de um mínimo de 5.000 células por amostra. Aplique o foco automático usando o canal de núcleos da célula hospedeira como referência. Por fim, use a análise automatizada de imagens para extrapolar vários recursos relevantes das imagens adquiridas.

Esta figura ilustra 38 transposições em mutantes em 16 pontos ICM Coxe L em Genes e curvas de crescimento que avaliam a viabilidade de mutantes são mostradas aqui. Aqui. As curvas de crescimento intracelular para mutantes de coxiella incubadas com células epiteliais fornecem análise quantitativa dos fenótipos associados à transposição em inserções no genoma da coxiella. Nesta figura, a aquisição automatizada de imagens foi realizada para identificar e caracterizar núcleos de células hospedeiras, contornos celulares, lisossomos e colônias de coxiella.

A correlação de colônias de coxiella com células e lisossomos permite a análise morfológica de vacúolos contendo coxiella. A correlação das colônias de coxiella com os contornos das células hospedeiras permite a análise morfológica das células infectadas. Finalmente, os quatro canais são mesclados.

A área média das colônias de coxiella é plotada em relação ao número de colônias por célula, a fim de identificar mutações que afetam a replicação intracelular da coxiella e/ou a capacidade das bactérias de invadir as células hospedeiras. Mutantes foram observados em três clusters: mutações que afetaram o crescimento intracelular da internalização da coxiella coxiella nas células e fenótipos não significativos. Aqui, a área média das colônias de coxiella é plotada em relação ao número de células hospedeiras que sobrevivem à infecção para identificar mutações que conferem citotoxicidade à coxiella após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de infecções bacterianas explorarem as interações do patógeno hospedeiro em larga escala e identificaram os alvos hospedeiros e bacterianos para o desenvolvimento de novas terapias para combater doenças infecciosas.