Name: Simultâneo Ex vivo Teste Funcional de Dois retinas por In vivo Sistema Eletrorretinograma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a realizar eletroretinograma ex vivo em retinas isoladas de camundongo para estudar fisiologia retiniana e vias de sinalização de bastonetes e cones. Este método oferece maior relação sinal-ruído e possibilita manipulações farmacológicas quantitativas.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenções EY019312 e EY021126 (VJK), EY002687 ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais na Universidade de Washington, e pela Research para prevenir a cegueira.

Todos os protocolos experimentais foram de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Estudos de Animais institucional na Universidade de Washington. 1. Preparação de perfusão e Porta-amostra <ol><li> Preparar a solução de perfusão para a retina fresco no dia da experiência. Use água destilada e deionizada. Use um dos três seguintes soluções. <ol><li> Prepara-bicarbonato contendo &#39;solução (1 L): 1 garrafa de Ames Ames meios e 1,9 g de NaHCO 3, </li><li> Preparar a solução de Locke (em mM): 112,5 de NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 de CaCl2, 10,0 de HEPES, 20,0 NaHCO3, 3,0 Na succinato, 0,5 Na glutamato, 0,02 de EDTA e 10,0 de glucose, 0,1% de vitaminas MEM e amino ácidos </li><li> Preparar solução de Ringer tamponada com HEPES (em mM): 133,3 de NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl2, 1,0 de CaCl2, 10,0 de glucose, 0,01 de EDTA, 12,0 HEPES, pHajustado para 7,5 com ~ 5,8 mL de NaOH 1 M, adicionar 0,72 g / L de meio de cultura de Leibovitz L-15. Use 20 - 50 pM de DL-AP4 e 50 - 100? M BaCl2 para isolar a resposta de fotorreceptores com qualquer meio de perfusão. </li></ol></li><li> Preparar a solução de eléctrodos de 28 (em mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, MgCl2 2,4, CaCl2 1,2, HEPES 3, 0,01 de EDTA e ajustar o pH a 7,4-7,5 com NaOH. Eléctrodo solução pode ser armazenada à temperatura ambiente durante vários meses. </li><li> Preparar e testar o suporte da amostra. <ol><li> Cole papel de filtro preto / cinza em cima das cúpulas da parte inferior do suporte da amostra (ver Figura 1A). Espalhe de dois componentes de cola epóxi 5 min cuidadosamente em torno dos bordos das partes superiores planas das cúpulas. Se necessário, faça-o sob dissecção microscópio. </li><li> Aguarde até que a cola estiver quase seco (cerca de 4 min) e pressione o filtro de papel nas cúpulas usando um item de plano. Papel de filtro de cola, pelo menos, um dia antes da experiência. Opapel de filtro pode ser utilizada várias vezes, mas deve ser substituído após um mês de gravações. Use etanol a 70% para limpar cuidadosamente cúpulas de qualquer resíduo de cola antes de instalar o papel de substituição. </li><li> Preencha os canais de eletrodos com uma solução de eletrodo tentando evitar as bolhas de ar e parafuso eletrodos de pelotização fechados com um adaptador de rosca para os canais de eletrodo (ver figuras 1A e B). Ligar as peças superior e inferior do suporte da amostra com quatro parafusos e encher as linhas de perfusão com solução de eléctrodo. </li><li> Medir a resistência e tensão entre os condutores de cada par de eléctrodos usando um multímetro (Figura 1B). A resistência deve ser inferior a 100 Ωk ea tensão abaixo de 10 mV se os canais estão sem bolhas e os eletrodos estão em boas condições. </li></ol></li><li> Pour 400-700 ml de meio de perfusão no frasco de vidro. Separadas mais 300 ml para ser utilizada na dissecção das retinas e srasgou-o em uma geladeira. Definir a tubagem de perfusão no bloco permutador de calor e colocar o bloco de pré-aquecido sobre a placa de aquecimento (ver Figura 1D). </li><li> Coloque o frasco com uma tampa que tem ligações para o CO 2 / O 2 gás (se Ames ou Locke é usado) e para a tubagem de perfusão (ver Figura 1D). Pré-aqueça o frasco com a mídia para 37 ° C e coloque-o sobre a placa de aquecimento ou na parte superior da unidade de estímulo de luz no banho-maria regulado para 37-39 o C 17. <ol><li> Primeiro as linhas de perfusão, preenchendo-as com meios de perfusão para iniciar o fluxo orientado a gravidade. <ol><li> No sistema LKC, colocar a garrafa no topo da unidade estimulador 17 para proporcionar um escoamento gravitacional significativa que é, então, ajustado por reguladores de caudal sem ser influenciado pelo nível de redução da solução de perfusão na garrafa durante a experiência. </li><li> No sistema Ocuscience, coloque o perfusion garrafa no interior da gaiola de Faraday, de modo a minimizar o ruído e colocar linhas de saída longo de perfusão de suporte da amostra (ver passo 2.8) bem abaixo do nível do suporte da amostra (e do frasco de perfusão) para aumentar a movimentação gravitacional da solução. Proteger essas linhas de saída e ligue a blindagem à terra do amplificador para impedir o acoplamento do ruído eletromagnético ao sinal ERG. </li></ol></li></ol></li><li> Ajustar a perfusão de 3-5 ml / min usando reguladores de caudal. Conecte-se 5% de CO2 / 95% de O 2 de gás de um cilindro com regulador apropriado e ajustar a taxa de fluxo para garantir borbulhamento constante da mídia na garrafa através de uma pedra de ar. </li></ol> Preparação 2. Amostra <ol><li> Montar instrumentos de dissecção limpas e nítidas incluindo microtesoura reta de lâmina, um ou dois 45 o pinças, lâmina de barbear e um pedaço retangular de papel de filtro. </li><li> Despeje cerca de 200 ml de perfu friosion solução numa placa de Petri grande, de modo que toda a parte inferior do suporte de amostra (incluindo as cúpulas) pode ser imersa na solução. Este passo torna-se importante ao montar as retinas sobre as cúpulas (veja o passo 2.6). Embora algumas soluções foram desenvolvidas para ser saturada com carbogéneo (5% de CO2 / 95% de O 2), isto não é essencial para os fins de dissecação e não foi feito nas experiências descritas aqui. </li><li> Para uma experiência típica, manter os animais em 12/12 horas escuro ciclo de luz / escuridão e-adaptá-los para 6-12 horas antes das gravações. Eutanásia do animal por inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical sob luz vermelha ofuscante e fazer todas as seguintes operações sob luz vermelha ou IR dim (usar por exemplo, filtro vermelho na frente da fonte de luz do microscópio). <ol><li> Puxe os olhos para fora usando uma pinça e colocá-los na mídia. Coloque um olho de cada vez em um pequeno pedaço de papel (por exemplo, alguns papel de filtro regular) e fazer comoiluminado é aproximadamente o nível de ora serrata, mantendo o olho com uma pinça (isto é feito fora da solução aqui). </li></ol></li><li> O corte ao longo da ora serrata (ou mais perto do equador do olho) com microtesouras e remover a córnea e da lente. Coloque o copo olho na mídia frio na grande placa de Petri e repita o mesmo procedimento com o outro olho. </li><li> Corte de uma pequena incisão da parte superior da taça dos olhos no sentido do nervo óptico, mantendo a tesoura entre a retina e esclera, a fim de manter a retina como intacta quanto possível. Aderência da esclerótica de ambos os lados da incisão usando duas pinças e puxar as pinças longe um do outro para separar a retina. <ol><li> Cortar o nervo óptico e tentar isolar a retina com uma quantidade mínima de contacto físico com a superfície distai. RPE, na sua maioria separar automaticamente a partir da retina durante o processo de dissecção. É mais importante para evitar a perturbação mecânica da retina do que para realizar odissecção rapidamente, em geral, as retinas podem ser incubadas pelo menos 30 minutos na solução, sem efeitos significativos sobre as propriedades de resposta. </li></ol></li><li> Monte as retinas sobre as cúpulas de suporte para amostra (Figura 1C). Mergulhe a parte inferior do suporte da amostra na placa de Petri com as retinas dissecadas. Deslize da retina, fotorreceptores lado (a superfície convexa da retina isolado) para cima, por cima da cúpula e levantar o suporte da amostra, de modo que a retina atribui no papel de filtro. Repetir o procedimento para o outro retina. </li><li> Secar a placa suporte com cuidado para evitar interferência elétrica entre as retinas, bem como o ruído eo sinal de manobra. O suporte de amostras tem anéis de vedação em torno das cúpulas parte do fundo para impedir que a solução derrame entre a parte inferior e superior das peças do suporte, bem como para ajudar o isolamento eléctrico dos fotorreceptores e células ganglionares lados das retinas individuais. Fixe a parte superior do suporte com os quatro parafusos (ver Figura 1B) e encher os canais de perfusão com solução de perfusão utilizando uma seringa e uma agulha. </li><li> Transferir o porta-espécime ao lado do bloco do permutador de calor e conectar as linhas de entrada e saída de perfusão para o suporte da amostra (Figura 1D). Ligar os eléctrodos ao amplificador ERG (top eletrodos ligar para o chão / menos pino no amplificador) e anexar a unidade estimulador / controle sobre o suporte da amostra usando um adaptador ou deslizar a almofada de aquecimento na unidade estimulador dependendo de qual in vivo ERG sistema é utilizado. </li></ol> 3. Gravações <ol><li> Configurar as definições do amplificador e de estímulo usando o software do sistema in vivo. Defina a freqüência de aquisição a um valor entre 1 e 10 kHz e filtragem passa-baixo a 300 Hz. Não usar a filtragem passa-alta. Use 60 Hz (ou 50 Hz na Europa) entalhe filtro, se necessário. </li><li> Ficha de linha de base sem estimulação luminosa e sagacidadeh estimulação dim (eg., luz verde de -35 dB ou 0,3 mCd sm-2) para testar a boa conexão elétrica entre os eletrodos e amostra retina. Espera 10-20 min antes de iniciar a recolha de dados de modo a que a temperatura e a função da retina alcançar um estado estável. <ol><li> Escolha parâmetros de estímulo de acordo com qualquer experiência específica e comece a coleta de dados. Por exemplo, usar a luz verde de -40 até 0 dB ou de 0,1 até 1000 mCd sm -2 para uma família de resposta escotópica. Use cerca de 2 a 3 unidades de log mais brilhante flashes em gravações fotópicas onde hastes têm de ser suprimida pela luz de fundo (3-30 Cdm -2) ou um flash sonda (sm cerca de 1,3 -2 Cd = 1 dB, veja a Figura 3). </li><li> No entanto, lembre-se que os valores exatos de intensidade de luz pode ser um pouco dependente de sua calibração do sistema e as condições experimentais. Como uma regra geral, as intensidades da escala para baixo por 5-10 vezes, em comparação com in vivo </em&gt; gravações ao usar luz verde 17. Uma tampa preta com aberturas acima retinas (incluído no sistema adaptador comercial) pode ser usada para reduzir a dispersão de luz no suporte de amostras e facilitar estimulação homogénea e igual de ambas as retinas pela esfera Ganzfeld da comercial em sistemas in vivo. NOTA: Para gravações de retina de adaptação ao escuro, as intensidades de flashes de teste utilizadas numa experiência de branqueamento típico apenas uma fracção insignificante do pigmento, de modo que a falta de regeneração orientada para o EPR não é um problema. Além disso, foi anteriormente demonstrado que a regeneração cone de pigmento podem ainda ter lugar na retina isolada através do ciclo visual célula Müller 20. </li></ol></li><li> Como experiências durar tipicamente de 30 minutos até várias horas, monitorizar a deriva da linha de base, o nível de ruído e estabilidade de resposta durante a experiência como alterações na estes podem indicar problemas técnicos. NOTA: Aumento ou diminuição de ruídoamplitudes de resposta d pode indicar bolhas de ar nos canais de perfusão ou eletrodos, muito baixa ou alta temperatura, a solução de vazamento / derramamento ou deslocamento da retina. </li></ol> 4. Limpeza <ol><li> Retire o suporte da amostra a partir das linhas de perfusão, abra-o e lave as retinas do papel de filtro. Retirar os eléctrodos e lavá-los com água destilada (não use etanol). Limpar o suporte de amostras (incluindo os canais de perfusão) com etanol e / ou água destilada. Tubo de perfusão Lave cuidadosamente com etanol&gt; 70%. </li><li> Lavar o frasco de perfusão com água destilada (não use detergentes). O etanol pode também ser usado para limpar o frasco. </li></ol>

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Universidade de Washington em St. Louis tem um acordo de licença com Xenotec, Inc. e pode receber royalties da venda do adaptador ex vivo.

<html> Nós demonstramos aqui os passos críticos para a obtenção de alta qualidade ex gravações vivo ERG simultaneamente a partir de duas rato retinas isoladas usando componentes in vivo do sistema ERG juntamente com um adaptador vivo ex ERG. Neste estudo, ambas as retinas perfundidos a partir do animal com a mesma solução (ou Ames, Locke ou riscas) mas também é possível perfundir cada retina com uma solução diferente, por exemplo, para fins de teste de drogas. Os passos mais i...

Electrorretinograma (ERG) é uma técnica bem estabelecida que pode ser utilizado para registar a actividade eléctrica da retina desencadeadas pela luz. O sinal é gerado principalmente ERG por mudanças de tensão provocadas por correntes radiais (ao longo do eixo dos fotorreceptores e células bipolares) que flui no espaço extracelular resistiva da retina. O primeiro sinal ERG foi gravado em 1865 por Holmgren a partir da superfície de um olho de peixe 1. Einthoven e Jolly 1908 2 dividido a resposta do ERG ao aparecimento de luz em três ondas diferentes, denominado A, B, e C-ondas, que são agora conhecidos, principalmente, para reflectir a actividade de fotorreceptores, em células bipolares, e epitélio pigmentado células, respectivamente 3-8. ERG pode ser gravado a partir dos olhos de animais anestesiados ou humanos (in vivo), de olho preparação isolada 9, em frente isolado retina intacta (ex vivo) ou através 3,10-15 camadas da retina específicas com microeletrodos (localERG) 4,16. Destes, in vivo ERG é atualmente o método mais utilizado para avaliar a função da retina. É uma técnica não invasiva que pode ser utilizada para fins de diagnóstico ou para seguir a progressão das doenças da retina em animais ou pacientes. No entanto, in vivo registos de ERG produzir um sinal complexo com vários componentes sobrepostos, muitas vezes contaminados por ruído extraocular fisiológico (por exemplo, a respiração e da actividade cardíaca). ERG local pode ser utilizado para gravar o sinal através de camadas específicas da retina, mas é mais invasiva e tem uma menor relação de sinal-para-ruído (SNR) em relação a outras configurações de gravação ERG. ERG local também é tecnicamente exigente e requer equipamento caro (por exemplo, microscópio e micromanipuladores). Transretinal ERG do intacta, isolado retina (ex vivo ERG) oferece um compromisso entre os métodos in vivo e ERG locais permitindo estável e higgravações h SNR de retinas intactas de animais ou seres humanos 17. Recentemente, este método tem sido utilizado com êxito para estudar a função de fotorreceptores cone e da haste em mamíferos, primatas e humanos retinas 18-20. Além disso, devido à ausência de epitélio pigmentar da retina ex vivo, o componente do sinal de ERG c-onda positiva é removida e um componente lento PIII negativos proeminentes é revelado nas gravações ex vivo. O componente PIII lenta tem sido demonstrado que se originam a partir da actividade de células da glia de Müller na retina 21-23. Assim, método ex vivo ERG também poderia ser usado para estudar as células Müller na retina intacta. Vários estudos também demonstraram que os registos de ERG ex vivo pode ser usada para medir a concentração de agentes farmacológicos em torno da retina 24 e testar a segurança e eficácia de drogas 25-27. Comercial múltipla em sistemas in vivo estão disponíveis eusado em muitos laboratórios que não têm necessariamente extensa experiência eletrofisiologia. Em contraste, ex vivo dispositivos não estavam disponíveis até recentemente 17 e, como resultado muito poucos laboratórios estão actualmente a tirar partido desta poderosa técnica. Seria benéfico para fazer gravações ex vivo ERG disponível para mais laboratórios, a fim de aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiologia da retina e patologia, e para desenvolver novas terapias para doenças ofuscante. Nós demonstramos aqui um dispositivo simples e acessíveis ex vivo ERG 17 e mostram como ele pode ser utilizado em combinação com vários sistemas in vivo ERG disponíveis comercialmente para gravar e sinalização mediada rod- de cone (a- e b-ondas) e a função de células de Müller (retardar PIII) de íntegras do tipo selvagem do rato retinas.

<table><tbody><tr><td>In vivo Sistema ERG</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td></tr><tr><td>In vivo Sistema ERG</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex adaptador vivo</td><td>adaptador OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp; idCategory=27">Pode usar qualquer marca</a></td></tr><tr><td>emissor de IR</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler Escopos de Visão Noturna</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Produto de grau militar.</td></tr><tr><td>Filtro vermelho</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>Pode ser usado em vez do sistema IR</td></tr><tr><td>Luz vermelha</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Dumont pinças #</td>5 <td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Pode usar qualquer marca</a></td></tr><tr><td>medidor de pH e eletrodo</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Pode usar qualquer marca</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Pode usar qualquer marca</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M solução</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M solução</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Sal dissódico de ácido succínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Pode usar qualquer</td></tr><tr><td>marca Leibovitz meio de cultura L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>Pode usar qualquer marca</td></tr><tr><td>de vitaminas MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO2</td></tr></tbody></table>

simultâneo<em&gt; ex vivo</em&gt; teste funcional de dois retinas por<em&gt; in vivo</em&gt; sistema eletrorretinograma

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Um sinal de eletrorretinograma (ERG) in vivo é composto por vários componentes sobrepostos originados de diferentes tipos de células da retina, bem como ruído de fontes extra-retinianas. Ex vivo O ERG fornece um método eficiente para dissecar a função das células da retina diretamente de uma retina isolada intacta de animais ou olhos de doadores. Além disso, o ERG ex vivo pode ser usado para testar a eficácia e segurança de potenciais agentes terapêuticos no tecido da retina de animais ou humanos. Mostramos aqui como os sistemas ERG in vivo disponíveis comercialmente podem ser usados para realizar gravações de ERG ex vivo a partir de retinas isoladas de camundongos. Combinamos as unidades de estimulação de luz, eletrônicas e de aquecimento de um sistema in vivo padrão com suporte de amostra personalizado, sistema de perfusão controlado por gravidade e blindagem contra ruído eletromagnético para gravar sinais ERG ex vivo de baixo ruído simultaneamente de duas retinas com o software de aquisição incluído no mercado in vivo Sistemas. Além disso, demonstramos como usar esse método em combinação com tratamentos farmacológicos que removem componentes específicos do ERG para dissecar a função de certos tipos de células da retina.

Foram registrados respostas de flash a partir do tipo selvagem de adaptação ao escuro (WT) C57BL / 6 de rato retinas seguindo os protocolos experimentais descritos acima e ilustrados na Figura 1, usando diferentes soluções para perfusão padrão (Figura 2). As formas de onda de resposta e cinética, bem como sensibilidade dos bastonetes apareceu semelhante em Ames e mídia de Locke (Figura 2A e B). Por outro lado, sob a solução de Ringer tamponada com HEPES...

Ex vivo O ERG pode ser usado para registrar a atividade elétrica das células da retina diretamente de retinas intactas isoladas de animais ou humanos. Demonstramos aqui como os sistemas ERG in vivo comuns podem ser adaptados para gravações de ERG ex vivo, a fim de dissecar a atividade elétrica das células da retina.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função de células provenientes de uma retina isolada de camundongo utilizando um sistema comercial in vivo de eletroretinograma, ou ERG, juntamente com um adaptador ex vivo. Isso é realizado primeiramente pela dissecação das retinas de ambos os olhos de um camundongo. O segundo passo consiste em montar as retinas com o lado dos fotorreceptores voltado para cima em um suporte de espécime.Em seguida, o suporte do espécime é colocado sobre uma placa aquecedora no sistema ERG in vivo e conectado à perfusão controlada por gravidade. O passo final é conectar os eletrodos do suporte do espécime a um amplificador e estimular as retinas com luz para obter respostas ERG. Em última análise, o ERG ex vivo é utilizado para demonstrar como as vias de sinalização mediadas por bastonetes e cones podem ser dissecadas usando farmacologia e protocolos especializados de estimulação luminosa.A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos existentes, como registros in vivo, ERGs ou gravações de células isoladas, é que ela fornece maior relação sinal-ruído, gravações mais longas e mais estáveis, além da possibilidade de manipulações farmacológicas fáceis e quantitativas. Além disso, este método pode ser utilizado para avaliar a eficácia e segurança de fármacos destinados ao tratamento de doenças da retina em retinas de primatas e de doadores humanos. Com pelo menos um dia de antecedência, modifique a parte inferior do suporte da amostra colando um papel filtro preto-acinzentado na parte superior das cúpulas. Utilize epóxi bifásico de cinco minutos ao longo das bordas das cúpulas e, se necessário, use um microscópio de dissecação. Após a secagem da cola, pressione o papel filtro contra a cúpula para aplaná-lo.Ele será adequado para cerca de um mês de gravação. Em seguida, remova o papel e limpe a cúpula com etanol 70%. Agora, para preparar primeiramente o eletrodo, preencha os canais do eletrodo com solução para eletrodo.Tente evitar a introdução de bolhas de ar. Em seguida, parafuse os eletrodos em pellet nos canais dos eletrodos. Conecte as partes superior e inferior do suporte da amostra com quatro parafusos e preencha as linhas de perfusão com a solução eletrolítica.Em seguida, meça a resistência e a tensão entre os terminais dos pares de eletrodos. A resistência deve estar abaixo de 100 kiloohms e a tensão abaixo de 10 milivolts. Se os canais estiverem livres de bolhas e os eletrodos estiverem em boas condições, despeje agora 400 a 700 mililitros de meio de perfusão em um frasco de vidro para a perfusão da amostra.Além disso, despeje 300 mililitros para a dissecação e armazene na geladeira. Em seguida, passe o tubo de perfusão pelo bloco do trocador de calor e coloque o bloco pré-aquecido sobre a placa de aquecimento. Agora, feche o frasco com uma tampa que tenha uma entrada para gás e uma entrada para o tubo de perfusão.A entrada de gás deve ser conectada a uma pedra difusora. Coloque o frasco pré-aquecido onde o meio de perfusão será mantido a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare as linhas de perfusão preenchendo-as com meio de perfusão para iniciar o fluxo por gravidade em um sistema ocus science.Coloque o frasco dentro da gaiola de Faraday para minimizar o ruído e use longas linhas de saída de perfusão provenientes do suporte do espécime. Posicione bem abaixo do nível do suporte do espécime e do frasco de perfusão, protegendo essas linhas de saída, e conecte o blindagem ao terra do amplificador através da gaiola de Faraday. Para evitar o acoplamento do ruído eletromagnético ao sinal de ERG, fixe a sonda de temperatura ao estágio de aquecimento.Agora, utilizando reguladores, ajuste o fluxo da solução para três a cinco mililitros por minuto. Por fim, se necessário, introduza ar e gás na solução e ajuste o regulador para obter um fluxo constante de bolhas provenientes da pedra difusora. Comece despejando cerca de 200 mililitros de solução de perfusão fria em uma placa de Petri grande, de modo que a parte inferior inteira do suporte do espécime possa ficar completamente imersa.Eutanize um animal criado em ciclo claro-escuro de 12 horas e, em seguida, adapte-o à escuridão por seis a 12 horas antes das gravações. Todos os procedimentos a seguir devem ser realizados sob luz vermelha fraca ou luz infravermelha. Após isolar cada olho, coloque-os no meio para olho.Em seguida, transfira um olho para um pequeno pedaço de papel de filtro sobre o papel. Segure-o com pin&ccedil;as e corte uma fenda nele, aproximadamente no mesmo n&iacute;vel da ora serrata a partir da fenda. Corte ao longo da ora serrata ou em algum ponto mais pr&oacute;ximo do equador para remover a c&oacute;rnea e o cristalino.Em seguida, remova a córnea e as extremidades do cristalino e transfira a cúpula ocular de volta para o meio frio. Repita este mesmo procedimento com o outro olho. Agora, trabalhando com uma cúpula ocular, faça uma pequena incisão do topo em direção ao nervo óptico.Mantenha a tesoura entre a retina e a esclera para que a retina permaneça o mais intacta possível. Em seguida, segure a esclera em ambos os lados da incisão usando duas pinças e puxe o tecido para separar a retina. Para isolar a retina, corte o nervo óptico e remova a retina com o mínimo de contato possível com sua superfície distal.Agora, monte as retinas isoladas nas cúpulas do suporte do espécime. Primeiro, imerja a parte inferior do suporte do espécime na placa de Petri com as retinas dissecadas. Próximo slide.O fotorreceptor da retina ou lado convexo voltado para cima sobre a cúpula. Em seguida, levante suavemente o suporte do espécime para que a retina adere ao papel filtro. Repita então o procedimento para a outra retina.Agora seque cuidadosamente a placa suporte para evitar ruídos de crosstalk e desvio de sinal. Após secar o suporte, parafuse a parte superior e preencha os canais de perfusão com solução de perfusão a partir de uma seringa utilizando uma agulha. Coloque o suporte do espécime ao lado do bloco de troca térmica.Em seguida, conecte as linhas de perfusão de entrada e saída. Complete a montagem conectando os eletrodos ao amplificador de ERG e fixando a unidade de controle do estimulador ao suporte do espécime. Usando um adaptador Para obter respostas grandes e reutilizáveis, é importante realizar uma dissecação e montagem cuidadosas das retinas, bem como manter uma perfusão estável e livre de bolhas acima das retinas antes da coleta de dados.Aguarde de 10 a 20 minutos para que a temperatura e a função da retina se estabilizem. As respostas ao flash foram registradas de retinas escuras adaptadas do tipo selvagem C57 black six utilizando diferentes soluções padrão de perfusão. As formas de onda e a cinética das respostas pareceram semelhantes no meio Ames e no meio Locke. A sensibilidade dos fotorreceptores bastão também foi semelhante.Por outro lado, em soluções de Ringer tampadas sem bicarbonato ou resposta a carbogênio, as amplitudes foram significativamente menores. A estabilidade da onda B também foi frequentemente comprometida no Ringer de heap. A adição de 40 micromolares de A PB removeu eficientemente a onda B positiva.Isso revelou uma onda negativa lenta e de grande amplitude que tem sido atribuída à atividade das células de Müller; a adição de 100 micromolares de bário aboliu esse componente, revelando a resposta dos fotorreceptores no sinal de ERG ex vivo. Este método pode ser combinado com outras ferramentas, como farmacologia e genética, para responder perguntas sobre os mecanismos moleculares da sinalização retiniana e das doenças que causam cegueira em retinas de mamíferos, incluindo humanos.

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O desenvolvimento do eletrorretinograma multifocal (mfERG) é um avanço importante no diagnóstico e caracterização de retinopatia. Eletrorretinograma multifocal são uma média aritmética de uma aproximação de um onda-b. Programas de software pode derivar ERGs de mais de uma centena de áreas da retina em poucos minutos por olho. Escotomas e disfunção da retina podem ser mapeadas e quantificadas.

Eletrorretinograma multifocal

Nós descrevemos um método relativamente simples de transretinal eletrorretinograma (ERG) para a obtenção de gravações photoresponses haste e cone da retina do rato intacto. Esta abordagem tira vantagem do bloco de transmissão sináptica de fotorreceptores para isolar as suas respostas de luz e gravar os usando eléctrodos de campo colocados através da retina plana montado isolado.

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Este vídeo demonstra como registrar o eletrorretinograma (ERG) e o potencial evocado visual (VEP) em um rato consciente. O rato, com eletrodos implantados cirurgicamente, é primeiro adaptado ao escuro. Após a aplicação de gotas dilatadoras, o animal é colocado em uma contenção e posicionado em uma tigela Ganzfeld. Os sinais ERG e VEP são então registrados.

Registro do Eletrorretinograma e do Potencial Evocado Visual em um Rato

O eletrorretinograma (ERG) é um potencial elétrico gerado pela retina em resposta à luz. Este artigo descreve como usar o ERG para avaliar a função retiniana, em ratos adaptados ao escuro, e como ele pode ser usado para avaliar uma intervenção neuroprotetora, no presente caso o pré-condicionamento isquêmico remoto.

Usando o Eletrorretinograma na Avaliação da Função na Roedor Retina e os efeitos protetores do remoto Limb Pré-Condicionamento Isquêmico

Este protocolo descreve a medição simultânea do eletrorretinograma e dos potenciais evocados visuais em ratos anestesiados.

Gravação simultânea de Eletrorretinografia e potenciais evocados visuais em ratos anestesiados

Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.

Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato

Aderir aos padrões internacionais e manter a adaptação escura da retina são fundamentais para adquirir respostas válidas de eletroretinograma em campo integral no diagnóstico e manejo de doenças herdadas da retina. Um protocolo prático usando uma sala escura portátil é fornecido para obter eletroretinograma de campo inteiro para bebês e crianças sob sedação ou anestesia geral no ambiente da sala de cirurgia.

Gravação de eletroretinograma para bebês e crianças sob anestesia para alcançar adaptação escura ideal e padrões internacionais

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

A modificação do equipamento de matriz de multieletrodos ou patch clamp existente torna o eletrorretinograma ex vivo mais amplamente acessível. Métodos aprimorados para registrar e manter respostas à luz ex vivo facilitam o estudo da função fotorreceptora e das células ON-bipolar na retina saudável, modelos animais de doenças oculares e retinas de doadores humanos.

Otimizando a configuração e as condições do eletrorretinograma ex vivo para estudar a função da retina em olhos pequenos e grandes

Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.

Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Aprenda a realizar eletroretinograma ex vivo em retinas isoladas de camundongo para estudar fisiologia retiniana e vias de sinalização de bastonetes e cones. Este método oferece maior relação sinal-ruído e possibilita manipulações farmacológicas quantitativas.

Simultâneo

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