Simultâneo Ex vivo Teste Funcional de Dois retinas por In vivo Sistema Eletrorretinograma

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função das células de uma retina de camundongo isolada usando um sistema comercial in vivo, eletrorretinograma ou ERG junto com um adaptador ex vivo. Isso é feito dissecando primeiro as retinas de ambos os olhos de um camundongo. O segundo passo é montar o lado fotorreceptor das retinas para cima em um suporte de amostra.

Em seguida, o suporte da amostra é colocado em uma placa de aquecimento no sistema ERG in vivo e conectado à perfusão controlada por gravidade. A etapa final é conectar os eletrodos do suporte da amostra a um amplificador e estimular as retinas com luz para obter respostas ERG. Em última análise, o ERG ex vivo é usado para mostrar como as vias de sinalização mediadas por bastonetes e cones podem ser dissecadas usando farmacologia e protocolos especializados de estimulação de luz.

A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos existentes, como in vivo, ERGs ou gravações de células únicas, é que ela fornece maior relação sinal-ruído gravações mais longas e estáveis, bem como possibilidade de manipulações farmacológicas fáceis e quantitativas. Além disso, este método pode ser usado para rastrear a eficácia e a segurança de medicamentos projetados para tratar doenças da retina em retinas de primatas e doadores humanos Com pelo menos um dia de antecedência, modifique a parte inferior do suporte da amostra colando um pouco de papel de filtro cinza preto na parte superior das cúpulas. Use epóxi de cinco minutos de dois componentes ao longo das bordas das cúpulas e, se necessário, use um microscópio de dissecação Depois que a cola secar, pressione o papel de filtro contra a cúpula.

Será bom por cerca de um mês de gravação. Em seguida, remova o papel e limpe a cúpula com etanol 70%. Agora, para preparar o eletrodo primeiro, preencha os canais do eletrodo com solução de eletrodo.

Tente evitar a introdução de bolhas de ar. Em seguida, aparafuse os eletrodos de pellets nos canais dos eletrodos. Conecte as peças superior e inferior do suporte da amostra com quatro parafusos e preencha as linhas de perfusão com solução de eletrodo.

Em seguida, meça a resistência e a tensão entre os fios dos pares de eletrodos. A resistência deve estar abaixo de 100 quilo ohms e a tensão abaixo de 10 milivolts. Se os canais estiverem livres de bolhas e os eletrodos estiverem em boas condições, despeje 400 a 700 mililitros de meio de perfusão em um frasco de vidro para a perfusão da amostra.

Além disso, despeje 300 mililitros para a dissecção e guarde na geladeira. Em seguida, coloque a tubulação de perfusão no bloco do trocador de calor e coloque o bloco pré-aquecido na placa de aquecimento. Agora enclausure a garrafa com uma tampa que tenha uma entrada de gás e uma entrada de tubo de perfusão.

A entrada de gás deve ser fixada a uma pedra de ar. Coloque o frasco pré-aquecido onde o meio de perfusão será mantido a 37 graus Celsius. Em seguida, prepare as linhas de perfusão preenchendo-as com meios de perfusão para iniciar o fluxo impulsionado pela gravidade em um sistema de ciência ocus.

Coloque o frasco dentro da gaiola de Faraday para minimizar o ruído e use longas linhas de saída de perfusão do suporte da amostra. Posicionadas bem abaixo do nível do suporte da amostra e do frasco de perfusão, protejam essas linhas de saída e conectem a blindagem ao aterramento do amplificador através da gaiola de Faraday. Para evitar o acoplamento do ruído eletromagnético ao sinal ERG, conecte a sonda de temperatura ao aquecimento stage.

Agora, usando reguladores, ajuste o fluxo da solução para três a cinco mililitros por minuto. Por fim, se necessário, introduza carro e gás na solução e ajuste o regulador para um fluxo constante de bolhas da pedra de ar. Comece despejando cerca de 200 mililitros de solução de perfusão fria em uma placa de Petri grande para que toda a parte inferior do suporte da amostra possa ser totalmente imersa.

Eutanásia de um animal criado sob um ciclo de luz escura de 12, 12 horas e depois adaptado ao escuro por seis a 12 horas antes das gravações. Todos os procedimentos a seguir devem ser executados sob luz fraca vermelha ou infravermelha. Depois de isolar cada olho, coloque-os no meio ocular.

Em seguida, transfira um olho para um pequeno pedaço de papel de filtro no papel. Segure-o com uma pinça e faça uma fenda nele aproximadamente no mesmo nível da aura serrata da fenda. Corte ao longo da aura serrata ou em algum lugar mais próximo do equador para remover a córnea e o cristalino.

Em seguida, remova a córnea e as extremidades da lente e transfira a ocular de volta para o meio frio. Repita este mesmo procedimento com o outro olho. Agora trabalhando com uma ocular, faça uma pequena incisão de cima em direção ao nervo óptico.

Mantenha a tesoura entre a retina e a esclera para que a retina permaneça o mais intacta possível. Em seguida, segure a esclera em ambos os lados da incisão usando duas pinças e separe o tecido para desprender a retina. Para isolar a retina, corte o nervo óptico e remova a retina com uma quantidade mínima de contato com sua superfície distal.

Agora, monte as retinas isoladas nas cúpulas do suporte da amostra. Primeiro, mergulhe a parte inferior do suporte da amostra na placa de Petri com as retinas dissecadas. Próximo slide.

O fotorreceptor da retina ou lado convexo para cima sobre a cúpula. Em seguida, levante suavemente o suporte da amostra para que a retina se prenda ao papel de filtro. Em seguida, repita o procedimento para a outra retina.

Agora seque a placa do suporte com cuidado para evitar ruídos de diafonia e desvio de sinal. Depois de secar o suporte, enrosque a parte superior e encha os canais de perfusão com solução de perfusão de uma seringa usando uma agulha. Coloque o porta-amostras próximo ao bloco de troca de calor.

Em seguida, conecte as linhas de perfusão de entrada e saída. Conclua a configuração conectando os eletrodos ao ERG amplifier e conectando a unidade de controle do estimulador ao suporte da amostra. Usando um adaptador Para obter respostas grandes e reutilizáveis, é importante realizar uma dissecção e montagem cuidadosas das retinas, bem como manter uma perfusão estável e sem bolhas acima das retinas Antes de coletar dados.

Aguarde de 10 a 20 minutos para que a temperatura e a função das retinas estabilizem as respostas do flash foram registradas a partir de seis retinas pretas tipo C 57 adaptadas ao escuro usando diferentes soluções de profusão padrão. As formas de onda e cinética de resposta pareceram semelhantes em meios ames e em meios de bloqueios. A sensibilidade dos fotorreceptores Rod também foi semelhante.

Por outro lado, em heaps tamponados com solução de ringer sem resposta de bicarbonato ou carbogênio, as amplitudes foram significativamente menores. A estabilidade do BWA também foi frequentemente comprometida na campainha do heap. A adição de 40 micromolares de A PB removeu eficientemente a onda B positiva.

Isso revelou uma onda negativa grande e lenta que foi atribuída à atividade das células de Mueller, adicionando 100 micromolares de bário abolidos. Este componente revela a resposta fotorreceptora do sinal ERG ex vivo. Este método pode ser combinado com outras ferramentas, como farmacologia e genética, para responder a perguntas sobre os mecanismos moleculares de sinalização da retina e doenças que causam cegueira em mamíferos, incluindo retinas humanas.