Name: Iridium (III) luminescentes Sonda para detecção da proteína maláricos Biomarker proteína rica em histidina-II (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprenda a detectar o biomarcador de malária proteína rica em histidina-II usando uma sonda fosforescente de irídio (III). Este método robusto oferece detecção rápida e específica para diagnósticos melhorados.

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O apoio para este trabalho foi fornecido pela Fundação Bill e Melinda Gates Grandes Desafios em Saúde Global: Desenvolver Tecnologias que Permitem a Avaliação de Múltiplas Condições e Patógenos no Local de Atendimento. K.M.D. foi apoiado por uma Bolsa de Pesquisa de Pós-Graduação da NSF (2012095464).

1. Síntese do Complexo irídio (III) <ol><li> Pesar 53,6 mg (50 umol) de [Ir (ppa) 2 -Cl] 2 e dissolvem-se em 5 ml de cloreto de metileno. Adicionar esta solução para um balão Erlenmeyer de 50 ml equipado com uma barra de agitação. </li><li> Pesar 26,2 mg (100 umol) de AgOTf e dissolvem-se em 5 ml de metanol. </li><li> Adicionar o AgOTf dissolvido para o [Ir (ppa) 2 -Cl] 2 solução e agita-se durante 1 h. Nota: A pasta de cor creme deve resultar. </li><li> Após 1 hora, filtrar a suspensão através de sílica gel para um trago frasco de 25 x 95 mm e evapora-se solvente remanescente utilizando um evaporador rotativo (5-10 min). </li><li> Uma vez que a maior parte do solvente é removido, verificar se um resíduo oleoso amarelo permanece no frasco. A este resíduo, adicionar 1 ml de metanol para re-dissolver o produto e liofilizar de 1-2 dias para se obter o produto sólido amarelo. </li><li> Caracterizar o Ir (ppa) 2 (H2O) 2 + produto (IR1) por H &lt;sup&gt; 1 RMN (em CDCI3), ESI e de UV-Vis, tal como descrito anteriormente. 23 </li></ol> 2. Interações de ir1 com vários ácidos aminados <ol><li> Prepara-se uma solução 2 mM de IR1 em metanol (PM 537,10 g / mol). Vortex para assegurar a dissolução completa do sólido. </li><li> Preparar 100 uM soluções dos seguintes aminoácidos e biomoléculas em salina tamponada com HEPES (HBS HEPES, 100 mM, 137 mM de NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, lie, Lys, Ser, Try, Val. </li><li> Pipetar 100 l de cada um dos aminoácidos em um negro placa de 96 poços. Adicionar 100 ul de HBS para a placa para servir como um espaço em branco. </li><li> Adicionar 2,5 mL da solução 2 mM IR1 a cada amostra e agitar a placa de um agitador de placas durante 10 min. </li><li> Após 10 min, a adquirir espectros de emissão das amostras utilizando um leitor de placas de 96 poços (365 ex / em 400-700). <ol><li> Coloque a placa no instrumento e abra o software leitor de placas de criar uma nova experiência. </li><li> Definir o novo experiment para ler um varrimento de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 365 nm e uma largura de fenda de 9 nm com a óptica na posição superior. </li><li> Leia a emissão de 300-700 nm, com um tamanho de passo de 5 nm. </li><li> Exportar os dados para análise de dados. </li></ol></li><li> Transferir as amostras a uma clara placa de 96 poços e a emissão de imagem utilizando um transiluminador UV. </li></ol> 3. Titulação do IR1 com BNT-II <ol><li> Prepara-se uma solução de reserva 1 mM de BNT-II (MW 8233,6 g / mol) em HBS, bem como uma solução 2 mM de IR1 em metanol. </li><li> A partir da solução estoque, preparar 1 mL de 100 uM BNT-II em HBS. Vortex do tubo de microcentrífuga para assegurar que a amostra é misturada. </li><li> Serialmente diluídas a 100 uM BNT-II pela metade em HBS a uma concentração final de 1,56 uM BNT-II. </li><li> Adiciona-se 100 ul de cada diluição, em triplicado, com HBS servir como um espaço em branco, para as cavidades de uma placa de 96 poços. Para cada amostra, adicionar 2,5 mL de IR1 2 mM. </li><li> Shake a placa durante 10 minutos num agitador de placas. </li><li> Após agitação, a leitura da intensidade de emissão a 510 nm (excitação a 365 nm) utilizando um leitor de placas de 96 poços. <ol><li> Coloque a placa no instrumento e abra o software leitor de placas de criar uma nova experiência. </li><li> Defina a nova experiência de ler um endpoint de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 365 nm de comprimento de onda e emissão de 510 nm. Defina a largura da fenda para ambos os comprimentos de onda para 9nM, com a ótica na posição superior. </li><li> Leia a placa e exportar os dados para análise. </li></ol></li><li> Transferir as amostras a uma clara placa de 96 poços e a imagem de titulação utilizando um transiluminador de UV. </li></ol> 4. Em tempo real Kinetic análise do sistema IR1 / BNT-II Usando Biolayer Interferometria <ol><li> Adicionar 200 ul de tampão de cinética (KB; 1x solução salina tamponada com fosfato com Tween-20 a 0,02%) a 8 poços na primeira coluna de uma preto placa de 96 poços e inserir a placa no sensor de plásticosuporte. Transferir cuidadosamente 8 Ni (II) biossensores NTA à primeira coluna no suporte de plástico de modo a que as pontas são suspensos nas cavidades da memória intermédia. Inserir o suporte de plástico no lado esquerdo do instrumento interferometria. </li><li> Preparar a 2 ml de uma solução de BNT-II em KB 0,5 uM. </li><li> Prepare a 500 ul de uma solução 10 uM de IR1 em KB, e diluir em série por metade para baixo a 0,156 uM em KB. </li><li> Para um novo preto placa de 96 poços, pipeta 200 mL de KB para todos os 8 poços na coluna A e C. </li><li> Na mesma placa, de pipeta 200 uL da solução de 0,5 uM BNT-II para os poços na coluna B. </li><li> Pipetar 200 ul de cada diluição de IR1 em coluna D, começando com KB como a peça em bruto no poço D1. Adicionar as diluições de modo que as cavidades aumentam em concentração IR1 para baixo na coluna. </li><li> Coloque esta placa no instrumento para a direita da placa contendo os sensores pré-molhagem. </li><li> No software biolayer interferometria, criou um Kinet básicaic experimento, definindo as pontas prato, ensaio, e sensores. <ol><li> Para definir a placa, selecione uma coluna na tela, clique com botão direito e escolha a definição adequada para os poços. Selecione &quot;Buffer&quot; para as colunas A e C, &quot;Load&quot; para a coluna B, e &quot;exemplo&quot; para a coluna D. </li><li> Definir o ensaio na próxima aba, adicionando as seguintes etapas (Clique em &quot;Adicionar&quot;): Equilíbrio (Custom), 60 seg; Carregando, 120 segundos; Linha de base, 60 seg; Association, 120 segundos; e dissociação, 300 seg. Selecione o passo de Equilíbrio e clique duas vezes em coluna A. Repita o procedimento para carregar (coluna B), Linha de Base (coluna C), Associação (coluna D), e dissociação (coluna C). Seleccione os sensores de Ni (II) NTA. </li><li> Mover para a próxima guia e confirmar que os sensores estão na coluna A no suporte do sensor de plástico. </li><li> Confirme o experimento é descrito corretamente, insira um nome de arquivo, certifique-se de que &quot;experimento atraso&quot; está marcada, e pressione &quot;Go&quot;. Nota: Devido à natureza automatizado do instrumento, uma vez que o experimento cinética é descrito, os passos ocorrerão como programado. </li></ol></li><li> Uma vez que o prazo cinética é completa, processar os dados no software de processamento fornecido. <ol><li> Dê um duplo clique sobre a pasta com o nome do arquivo de interesse na porção inferior do painel do lado esquerdo. Em seguida, clique duas vezes na pasta correspondente em &quot;Cinética&quot; na parte superior do painel. Mover para a guia Processamento. </li><li> Verifique a caixa de subtração à esquerda para abrir a tela de seleção sensor. Clique com o botão direito sobre o bem A4 e alterar o tipo de bem de Referência Bem. </li><li> Marque a caixa ao lado de Alinhar eixo Y, e garantir a etapa selecionada é da linha de base. Especifique o intervalo de tempo para ser o último de cinco segundos da linha de base (cerca de 55-60 segundos). </li><li> Marque a caixa de Correção Inter-passo e selecione Alinhar a dissociação. Certifique-se de que a caixa de Savitzky-Golay Filtering está marcada e pressione &quot;Processo de dados! ̶1; </li><li> Mover para a guia Análise. Certifique-se de que &quot;Associação e dissociação&quot; é a seleção para as etapas de análise e que o modelo é de 1: 1. Selecione um local, em forma completa e pressione &quot;Curves Fit!&quot; </li><li> Destaque todas as curvas na tabela e clique direito para definir todas as curvas para uma cor. Em seguida, selecione um ajuste (Full) Global, agrupados por cores e Rmax Unlinked por Sensor. Pressione &quot;Curves Fit!&quot; Para obter dados cinéticos globais. </li></ol></li></ol> 5. Na-grânulo Detecção de BNT-II e rcHRP-II com IR1 <ol><li> Prepare 1 ml de cada um de uma solução de BNT-II e II-rcHRP 1 uM em HBS com Tween (HBST; HBS com Tween 20 a 0,025%). </li><li> Diluir em série cada proteína para metade em HBST para uma concentração final de 15,6 nM. </li><li> Pipetar 100 ul de cada diluição em triplicado, para um branco, placa de 96 poços, com diluições em ordem menor para o maior concentração abaixo de uma coluna. </li><li> Pipetar 10 ul de 50 um de Ni (IINTA agarose) partículas magnéticas para cada diluição bem. <ol><li> Vortex do tubo de microcentrífuga contendo as partículas magnéticas após cada pipetagem para garantir que as partículas ficar suspensa. </li></ol></li><li> Colocar a placa num agitador de placas durante 15 min a incubar as amostras com as partículas. </li><li> Após este período de incubação, colocar a placa sobre um íman placa de 96 poços e esperar 30 segundos para as partículas para puxar para fora da solução. </li><li> Usando uma pipeta multicanal, retirar a amostra original e descarte como lixo. Remova a placa do ímã. </li><li> Adicionar 200 ul de HBST para cada cavidade utilizando a pipeta de canais múltiplos. Bombear o tampão de cima e para baixo várias vezes para lavar as partículas magnéticas. </li><li> Coloque a placa de volta para o ímã e esperar 30 segundos para as partículas para puxar para fora da solução. </li><li> Usando a pipeta multicanal, retirar os 200 mL de tampão e descarte como lixo. Remova a placa do ímã. </li><li> Repita os passos 5,8 througH 5,10 duas vezes para completar três lavagens das partículas. </li><li> Adicionar 100 ul de HBST a cada poço contendo as partículas magnéticas seguido por 2,5 mL de IR1 2 mM. </li><li> Incubam-se as partículas com IR1 em um agitador de placas durante 1 hora. </li><li> Após 1 h, ler a intensidade de emissão a 510 nm (excitação a 365 nm) utilizando um leitor de placas de 96 poços. <ol><li> Coloque a placa no instrumento e abra o software leitor de placas de criar uma nova experiência. </li><li> Defina a nova experiência de ler um endpoint de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 365 nm de comprimento de onda e emissão de 510 nm. Defina a largura da fenda para ambos os comprimentos de onda para 9 nm, com a ótica na posição superior. </li><li> Leia a placa e exportar os dados para análise. </li></ol></li><li> Transferir as amostras a uma clara placa de 96 poços e a imagem de titulação utilizando um transiluminador UV. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Como ferramentas de diagnóstico à base de micropartículas vir para a frente de tecnologia moderna de diagnóstico, detecção de biomoléculas alvo directamente sobre a superfície da partícula é uma grande vantagem. Métodos de detecção molecular tradicionais, tais como ELISA e PCR, são vantajosas, na medida em que pode atingir muito baixos limites de detecção 25. No entanto, estes ensaios necessitam de reagentes e protocolos extensas longas. Este ensaio foi concebido para mimetizar as interacções sanduíche de ELISA de tipo sem o tempo e os requisitos de reagente (Figura 5). Além disso, o custo da sonda IR1 por amostra foi estimado em cerca de uma moeda, enquanto que o custo de anticorpos para um ELISA típico é $ 0,20-0,30 por amostra. Uma vez que os métodos descritos acima dependem de uma sonda para a detecção de irídio cyclometalated do biomarcador da malária, esta sonda não seria susceptível a modos de falha comuns a outros métodos de detecção (ou seja. Fluoróforo quenching e degradação anticorpo / enzima). Histidina é único em suas propriedades de ligação de metal. O trabalho delineado tira proveito deste fenómeno, substituindo os anticorpos em um sanduíche típico de ELISA com complexos metálicos contendo. Ni (II) NTA captura rcHRP-II na superfície da partícula e IR1 sinaliza a presença da proteína. O passo mais importante no ensaio é permitir que as partículas magnéticas para misturar com a amostra e a sonda. Numa placa de 96 poços de ELISA, as biomoléculas e reagentes atingir o equilíbrio com a superfície bidimensional do fundo do poço. Partículas magnéticas têm a tendência para assentar a partir da solução, devido à sua densidade de núcleo de óxido de ferro, o que reduziria os locais de ligação disponíveis. Assim, as partículas devem ser misturados durante o tempo de ensaio para garantir a máxima ligação. Ao conceber um reagente para diagnóstico de doenças, deve-se ter em mente a forma de amostra do paciente, bem como a concentração fisiológica do biomarcador. Paraa malária, a concentração de HRP-PF II no sangue de um paciente pode variar a partir de baixo para alto picomolar nanomolar. Embora este ensaio é clinicamente relevante para os níveis mais elevados de infecção, o limite de detecção deve ser melhorada a fim de detectar pacientes assintomáticos com baixo picomolar circulante PF HRP-II. Nos métodos acima descritos, o &quot;switch-on&quot; sinal gerado por IR1 ocorre na presença de histidina. Enquanto o biomarcador da malária é rica em histidina, outras proteínas do soro, tais como albumina do soro humano e glicoproteína rica em histidina, iria provocar uma resposta de sinal com a sonda. Este, por sua vez levar a diagnósticos falso-positivos. Isso faz com que a captura da proteína sobre a superfície da partícula de um passo benéfico, em que a proteína de interesse pode ser rapidamente extraída a partir de uma amostra do paciente. Além disso, projetar uma sonda bifuncional, que os casais uma rica peptídeo histidina a um elemento robusto reconhecimento molecular (ie. Aptamer), Poderia adicionar outra camada de especificidade para o ensaio. O péptido seria carregado com irídio antes do acoplamento para o aptâmero. Nesse projeto, a sonda ir1 estável ainda pode ser utilizado ao conseguir especificidade alvo com o aptâmero. Isto iria permitir a aplicação da sonda para detectar nativa HRP-II numa matriz complexa (isto é. De plasma ou de sangue total) e reduzir os efeitos de ligação não específica. A fim de aumentar ainda mais o sinal de testes de diagnóstico rápidos, o ensaio pode ser incorporado num sistema de electroquimioluminescência (ECL), onde PF HRP-II pode ser detectada no RDTs como uma leitura electroquimica 26. Esta sonda irídio próxima geração iria melhorar muito o nosso ensaio on-talão ELISA para a detecção de biomarcadores de doenças.

Rotulagem e colorimétrico fluorescente é um método importante para a detecção e rastreamento de moléculas bioquímicas e processa 1,2. Os marcadores fluorescentes mais comuns são de baixo peso molecular corantes orgânicos 3,4, mas estas moléculas nem sempre têm propriedades ópticas ideais. Corantes fluorescentes são propensos a fotodegradação, têm, frequentemente, pequenos desvios de Stokes, e pode ter sobreposição de excitação e os espectros de emissão. Rotulagem colorimétrico é muitas vezes conseguida através da utilização de marcadores enzimáticos, que têm um sinal amplificado útil na quantificação imunoensaio 5,6. Estas enzimas também têm os seus inconvenientes, incluindo fotossensibilidade, condições de reação, e vida útil curta substrato. Estas propriedades tendem a exigir imunoensaios e métodos de marcação de proteínas para ser feito sob condições bem controladas utilizando reagentes dispendiosos. Complexos de metais de transição emissivas têm sido explorados como uma abordagem de etiquetagem alternativa for detecção bioquímico. Em particular, cyclometalated Ir (III) foi estudado no contexto de diodos emissores de luz orgânicos (OLEDs) 7-9 oxigénio de detecção 10, 11 catálise, e de proteína / célula coloração 12-14. Alta fotoestabilidade e eficiência quântica fazer esta classe de sondas de um bom candidato para a detecção de biomoléculas 15,16. Foi encontrado que anteriormente cyclometalated complexos Ir (III), sob a forma de [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, liguem irreversivelmente histidina e eliciar uma resposta de sinal azul-verde 12,17. Estes complexos são não-emissiva no estado solvento, mas quando histidina desloca as moléculas de solvente e liga-se ao centro metálico, que libertam um sinal fosforescente intensa após a irradiação com UV de onda longa. Este sinal ocorre apenas após a substituição do ligando, e é o resultado de um estado de tripleto que relaxa de electrões para o estado fundamental, através da activação de metal de transferência de carga ligando (3 MLCT) e transferência centrado ligando (3 LC) Vias 8,15. Estes complexos podem potencialmente ser utilizados como sondas de detecção de proteínas ricas em histidina. Proteínas ricas em histidina e seus níveis de regulação são importantes em muitas doenças, incluindo cirrose hepática, câncer e distúrbios trombótico. 18 Plasmodium falciparum proteína rica em histidina (pfHRP-II), em especial, é um biomarcador bem validado para a infecção pelo parasita da malária. Esta proteína é 67 kDa e contém 34% de histidina, na maior parte dentro característicos AHHAHHAAD repetindo 19 motivos. Essas repetições de histidina pode ligar iões metálicos livres 19 e 20 complexos heme no sangue do hospedeiro. pfHRP-II é comumente detectada em ambientes de baixa renda por meio de testes de diagnóstico rápido imunocromatogrï¿½icas (RDTs), mas estes testes são muitas vezes imprecisas, devido às condições de amostra, baixa concentração de biomarcadores, normas de fabricação pobres, ea degradação do anticorpo 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; sondas fosforescentes à base de metal, tal como o cyclometalated Ir (III), complexos descritos acima são opções atraentes para a detecção de pfHRP-II, devido à sua ligação selectiva de histidina e suas propriedades de solidez e de emissão eficiente. Neste papel, a utilização de [Ir (ppa) 2 (H2O) 2] + (IR1) para detectar BNT-II, um mímico péptido ramificado de pfHRP II-22 é explorado. Cinética desta interacção foram monitorizados em tempo real usando técnicas biolayer interferometria. O ensaio também foi adaptado a um formato de ELISA de tipo sobre-cordão, em que foram obtidos limites nanomolares de detecção. Este ensaio realiza vantagens sobre os tradicionais, pois os testes ELISA pode ser realizada em menos de 2 horas com reagentes isento de anticorpos, em vez de a 4-5 horas e reagentes biológicos necessários com ELISAs típicos.

<table><tbody><tr><td>Dicolortetrakis(2-(2-piridinil)fenil)diirídio(III)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>trifluorometanossulfonato de prata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>Gel de sílica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-Aminoácidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>varia</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II peptídeo</td><td>Sintetizado em casa</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>recombinante HRPII</td><td>Immunology Consultants Laboratory inc.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Placa de polipropileno preto Costar de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Placa de polipropileno branco Costar de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Placa de polipropileno preto Grenier de 96 poços</td><td>VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA partículas magnéticas de agarose</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA sensores de interferometria de biocamada</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octeto Red96 Instrumet de interferometria de biocamada ForteBio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 Leitor de microplacas</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech Transiluminador</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

iridium (iii) luminescentes sonda para detecção da proteína maláricos biomarker proteína rica em histidina-ii

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Este trabalho descreve a síntese de um não-emissiva, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H2O) 2 + (IR1), o que provoca um sinal fosforescente rápida, de longa duração, quando coordenado com um histidine- contendo proteína imobilizada na superfície de uma partícula magnética. Síntese de IR1, com rendimentos elevados, é completa S / N e envolve a cisão do pai cyclometalated Ir (III) de dímero com ponte de cloro em dois equivalentes do complexo solvatado. Para confirmar a especificidade, vários ácidos aminados foram sondadas para a actividade de coordenação, quando adicionados à sonda sintetizada, e apenas histidina induziu uma resposta de sinal. Usando BNT-II, um mímico péptido ramificado do biomarcador da malária proteína rica em histidina (pfHRP-II), a sonda de irídio foi validada como uma ferramenta para a detecção de HRP-II. Têmpera efeitos foram observados na titulação BNT-II / IR1 quando comparado com L-Histidina / IR1, mas estes foram atribuídos a impedimento estérico e triplet têmpera estado. Biolayer interferometria foi utilizado para determinar a cinética em tempo real de interacção de IR1 com BNT-II. Uma vez que o sistema foi optimizado, o limite de detecção de rcHRP-II, utilizando a sonda se verificou ser 12,8 nM em solução. Quando esta proteína foi imobilizada na superfície de uma partícula magnética de agarose de 50 um, o limite de detecção foi de 14,5 nM. O sinal de resposta robusta esta sonda inorgânico, bem como a sua flexibilidade de utilização, em solução ou imobilizados sobre uma superfície, pode prestar-se para uma variedade de aplicações, de utilização de diagnóstico para imagiologia.

Como mostrado na Figura 1, a síntese de a-IR1 solvento complexo envolvido divisão da ponte cloreto no dímero-mãe por precipitação do cloreto na forma de AgCl insolúvel e associação das moléculas de água para o centro metálico. A formação de IR1 foi confirmada por H RMN e uma ESI. Além disso, as bandas de UV-visível característica de transferência de carga do metal e do ligando π π-transições * foram designados para o espectro, validando ainda mais a formação de IR1. Este complexo solvatado exposições sem carácter emissivo quando excitado a 365 nm. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Figura 1:. Síntese e caracterização de IR1 reacção dividindo ponte Cloreto de Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) diiridium (III) para criar o complexo aquo Ir (ppa) 2 (H2O) 2 </sub&gt; + (IR1). Após a adição de L-His para o complexo aquo, em tampão aquoso, o sinal luminescente está ligado. Uma vez que o complexo foi sintetizado e caracterizado, a selectividade de aminoácidos foi analisado, como descrito anteriormente utilizando um análogo de irídio semelhante 17. A Figura 2A mostra que apenas histidina induziu uma resposta de sinal a 510 nm, quando excitado a 365 nm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figura 2: Aminoácido Selectividade e Titulação de IR1 rica em histidina com péptidos (A) Interacção de 200 uM de vários aminoácidos (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) com 50 uM. ir1 em HBS. Varreduras espectrais foram tomadas 400-700 nm a um comprimento de onda de excitação de 365 nm numa placa de 96 poços preta. Sinal em unidades de fluorescência relativas (RFU) de todos os aminoácidos besides histidina (tracejado traço preto) foi insignificante. Concentrações (B) nanomolares de BNT-II (▪) e rcHRP-II (♦) foram titulados com ir1 em HBS. Os péptidos ricos histidina foram incubadas com a sonda durante 15 min em solução antes de ler a emissão a 510 nm após excitação com luz de 365 nm. O limite de detecção foi calculado como o valor de x quando y = 3σ em branco. Este &quot;switch on-&quot; da fosforescência da sonda irídio ocorre porque o estado animado singlet (1 MLCT / 1 LC) do Ir (III) Bioconjugado sofre passagem inter para o trio estado animado (3 MLCT), quando histidina é coordenado ao centro metálico. Esta sonda foi aplicada a BNT-II um peptídeo imitador do biomarcador da malária Plasmodium falciparum proteína rica em histidina (HRP-II PF). Em uma titulação de BNT-II com IR1, uma concentração de resposta do sinal dependente foi observada ( <strong&gt; Figura 2B). HRP-II recombinante (rcHRP-II) também exibiram uma resposta semelhante em solução. Os limites de detecção de BNT-II e rcHRP-II em solução foram 54,8 nM e 12,8 nM, respectivamente. Usando técnicas biolayer de interferometria, a K D de IR1 ligação a BNT-II imobilizado sobre uma superfície de Ni (II) NTA foi encontrado para ser 2,05 uM (Figura 3). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Figura 3: em tempo real Análise Cinética de IR1 com BNT-II Biolayer interferometria para a análise cinética de várias concentrações de IR1 que se ligam a BNT-II na superfície de um sensor de vidro de Ni (II) NTA.. Depois de equilibrar os sensores em KB (Região A), os sensores são carregadas com 0,5 uM BNT-II (região B). Uma vez que o péptido é carregado nos sensores, uma linha de base é estabelecida (região C) antes da medição da associação de IR1 ao BNT-II (Região D). Depoisum período de associação, os sensores são colocados de volta em KB para medir a dissociação (Região E). Todo o processo de análise cinética leva menos de 30 min. Ao fazer a transição a partir de um ensaio à base de solução para uma plataforma de partículas magnéticas, a complexidade adicional da partícula no sistema tinha que ser tidos em conta. Era conhecido de trabalhos anteriores, que essas partículas se ligam de forma eficiente a PF biomarcador malária HRP-II. 24 placas fluorescentes preto funcionou bem para a solução de ensaio descrito acima, mas as placas brancas eram mais adequados para a plataforma de detecção em partículas, como se vê na Figura 4A. Em uma placa branca, a luz é reflectida de volta para a amostra, permitindo assim uma melhor absorção pelo IR1 ligado à superfície da partícula. No ensaio sobre-partícula, o limite de detecção de rcHRP-II foi determinada como sendo de 14,5 nM (Figura 4B). O limite de detecção para rcHRP-II em solução e sobre-cordão foram statiscamente o mesmo com base em um teste t não emparelhado (p = 0,731). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Figura 4:. On-grânulo Detecção de BNT-II e HRP-II (A) diferença entre o sinal detectado a partir IR1 obrigado a BNT-II na superfície de partículas de 50 um de Ni de agarose (II) NTA magnéticos a preto 96- bem placa (linha a cheio) em comparação com uma placa branca de 96 poços (linha a tracejado). As partículas foram excitadas com luz de 365 nm, e a emissão foi medida a 510 nm. (B) A titulação de rcHRP-II imobilizado nas partículas magnéticas e detectado utilizando IR1. O limite de detecção foi calculada como a VAlue de x quando y = 3σ em branco. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Figura 5: Representação esquemática da detecção em grânulo de rcHRP-II com IR1 esquema geral de HRP-II de ligação à superfície de Ni (II) e NTA partículas marcadas com IR1.. As partículas são incubadas com um péptido rico histidina durante 15 min. Após este período de incubação, as partículas foram lavadas com HBST utilizando um íman, de modo a puxar as partículas para fora da solução. Finalmente, o péptido ligado partículas são incubadas com IR1 durante 1 h antes da leitura da emissão a 510 nm após excitação com luz de 365 nm.

Reagentes de detecção robustos são cada vez mais necessários para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico da malária. Uma sonda de irídio (III) foi projetada para emitir sinal luminescente de longa duração na presença de um biomarcador de proteína da malária rico em histidina. A detecção da proteína em solução ou imobilizada em uma partícula magnética oferece flexibilidade na aplicação.

Iridium (III) luminescentes Sonda para detecção da proteína maláricos Biomarker proteína rica em histidina-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar a presença de uma proteína rica em histidina, biomarcadora da malária, em uma amostra, utilizando uma sonda de irídio fosforescente. Isso é realizado primeiramente pela síntese do complexo de irídio ciclometilado. Após uma rápida clivagem da ponte de cloreto do complexo dimérico original, o complexo de irídio ciclometilado pode ser isolado e purificado para uso no ensaio.O segundo passo é validar as interações da sonda com vários aminoácidos para garantir sua especificidade. Para a histamina isoladamente, o sinal fosforescente é ativado apenas na presença de histamina e é observado por espectroscopia de luminescência. Em seguida, como prova de conceito, a sonda de irídio é titulada com um peptídeo que imita o biomarcador da malária, a proteína rica em histidina dois, para determinar os limites de detecção em solução.Além disso, a cinética da interação da sonda com o peptídeo é elucidada utilizando interferometria de biocamada. O passo final consiste em imobilizar a proteína rica em histidina recombinante na superfície de partículas magnéticas de NTA-níquel e avaliar o limite de detecção da proteína utilizando a sonda. Por fim, luminescência e espectroscopia são utilizadas para demonstrar como proteínas podem ser detectadas na superfície de um suporte sólido usando uma nova classe de sondas irídio fosforescentes.As principais vantagens desta técnica em relação a métodos existentes, como a marcação com proteínas fluorescentes e ensaios imunológicos, são a robustez da sonda, sua cinética de associação rápida e a não suscetibilidade ao desbotamento fotossensível. Além disso, esta técnica não exige tempo prolongado, como ocorre nos ensaios imunológicos.As implicações dessa técnica estendem-se ao diagnóstico da infecção por malária. Isso se deve ao alto teor de histidina da proteína biomarcadora da infecção por plasmodium SRO, chamada proteína rica em histidina dois. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando notamos que um artigo havia sido publicado utilizando uma sonda de irídio ciclo-metilada para colorir células vivas.Neste artigo, eles afirmaram que a sonda penetrou na célula viva e iluminou os núcleos ao se ligar às proteínas ricas em hiscina. Dada a natureza do biomarcador mal, a proteína rica em hiscina dois, decidimos utilizar esta sonda para detectar nossa proteína de interesse. A demonstração visual deste método é fundamental devido à complexidade do ensaio e aos inúmeros passos de lavagem e transferência necessários para detectar esta proteína-alvo em partículas. Para começar, pese 53,6 miligramas do dímero de irídio original e dissolva em cinco mililitros de cloreto de metileno.Adicione esta solução a um balão de Lummi de 50 mililitros equipado com um agitador magnético em forma de estrela. Em seguida, pese 26,2 miligramas de FL de prata e dissolva em cinco mililitros de metanol. Adicione o FL de prata dissolvido à solução-mãe do dímero de irídio e agite por uma hora.Deve resultar uma suspensão de cor creme após uma hora; filtre a suspensão através de gel de sílica em um funil. Transfira o produto filtrado para um frasco DRAM de 25 por 95 milímetros e evapore o solvente remanescente usando um evaporador rotativo por cinco a 10 minutos. Uma vez que a maior parte do solvente tenha sido removida, verifique se um resíduo oleoso amarelo permanece no frasco.A este resíduo, adicione um mililitro de metanol para solubilizar o produto. Deixe repousar por um a dois dias para obter um sólido amarelo e caracterize o produto conforme descrito no protocolo do texto para investigar as interações da sonda de irídio com vários aminoácidos. Pipete 100 microlitros de cada solução de aminoácido em uma placa negra de 96 poços.Adicione 100 microlitros do tampão salino ou HBS à placa para servir como branco. Em seguida, adicione 2,5 microlitros da solução preparada do corante de irídio a dois milimolares a cada amostra e agite a placa em um agitador de placas por 10 minutos. Após 10 minutos, adquira os espectros de emissão das amostras utilizando um leitor de placas de 96 poços.Para tanto, coloque a placa no instrumento e abra o software do leitor de placas para configurar um novo experimento. Em seguida, transfira as amostras para uma placa clara de 96 poços e visualize a emissão utilizando um transiluminador UV para realizar a titulação da sonda de irídio com o peptídeo ramificado que imita o biomarcador da malária, a proteína rica em histidina dois BNT dois. Primeiro, prepare uma solução estoque de um milimolar de BNT dois em HBS.Em seguida, dilua seriamente a solução BN T dois conforme descrito no protocolo textual. Adicione 100 microlitros de cada diluição em triplicata, com HBS como branco, aos poços de uma placa de 96 poços; a cada amostra, adicione 2,5 microlitros do sonda de irídio a dois milimolares. Agite a placa por 10 minutos em um agitador de placas; após a agitação, leia a intensidade de emissão em 510 nanômetros utilizando um leitor de placas de 96 poços.Por fim, transfira as amostras para uma placa de 96 poços transparente e registre a imagem da titulação utilizando um transiluminador UV para realizar a análise cinética em tempo real por interferometria de camada biomolecular. Primeiro, adicione 200 microlitros de tampão cinético a oito poços da primeira coluna de uma placa de 96 poços preta. Após inserir a placa no suporte plástico para sensores, transfira cuidadosamente oito biossensores de níquel para a primeira coluna do suporte plástico, de modo que as pontas fiquem suspensas nos poços do tampão.Em seguida, coloque o suporte plástico no lado esquerdo do instrumento de interferometria e transfira, com uma pipeta, 200 microlitros de KB para todos os oito poços das colunas um e três na mesma placa de 96 poços preta. Em seguida, adicione 200 microlitros da solução de BNT dois 0,5 micromolar aos poços da coluna dois. Depois, adicione 200 microlitros de cada diluição da sonda de irídio à coluna quatro, começando com KB como branco no poço A4. Adicione as diluições de modo que as concentrações da sonda de irídio aumentem ao longo da coluna, no sentido descendente.Coloque esta placa no instrumento à direita da placa contendo os sensores pré-umedecidos no software de interferometria de biocamada. Configure um experimento cinético básico definindo o ensaio da placa e as pontas de sensor para definir a placa; clique com o botão direito em uma coluna na tela e escolha a definição apropriada. Para os poços, selecione o tampão.Para as colunas um e três, carregue para a coluna dois e a amostra. Para a coluna quatro, defina o ensaio na próxima guia clicando primeiro em adicionar equilíbrio. Carregamento de 60 segundos e 120 segundos.Associação por 120 segundos e dissociação por 300 segundos. Selecione a etapa de equilíbrio e clique duas vezes na coluna um. Em seguida, faça o mesmo para carregamento na coluna dois, linha de base na coluna três, associação na coluna quatro e dissociação na coluna três.Por fim, selecione os sensores de NTA de níquel. Confirme se o experimento está descrito corretamente. Insira um nome de arquivo.Certifique-se de que o experimento de atraso esteja selecionado e pressione iniciar. Após a conclusão da corrida cinética, processe os dados no software de processamento fornecido para realizar a detecção em partículas magnéticas do BNT dois e do HRP dois recombinante com a sonda de irídio. Prepare uma diluição seriada do BNT dois e do HRP dois recombinante conforme descrito no protocolo textual.Em seguida, pipete 100 microlitros de cada diluição em triplicata em uma placa branca de 96 poços, com as diluições em ordem de menor a maior concentração ao longo de uma coluna; adicione 10 microlitros de partículas magnéticas de níquel NTA de 50 mícrons a cada diluição. Observe que as partículas magnéticas devem permanecer suspensas durante a pipetagem. Caso comecem a sedimentar, misture novamente por pipetagem ou por vortex. Coloque a placa em um agitador de placas por 15 minutos para incubação das amostras com as partículas. Após esse período de incubação, posicione a placa sobre um ímã de 96 poços e aguarde 30 segundos para que as partículas sejam atraídas para fora da solução.Usando uma pipeta multicanal, remova a amostra original e descarte como resíduo após retirar a placa do ímã, adicionando 200 microlitros de HBS com tween ou HBST a cada poço. Com a pipeta multicanal, aspire e dispense o tampão várias vezes para lavar as partículas magnéticas. Coloque a placa de volta sobre o ímã e aguarde 30 segundos para que as partículas se separem da solução.Usando a pipeta multicanal, remova 200 microlitros do tampão e descarte como resíduo. Retire a placa do ímã antes de repetir os passos de lavagem duas vezes para completar três lavagens das partículas. Em seguida, adicione 100 microlitros de HBST a cada poço contendo partículas magnéticas, seguido de 2,5 microlitros da solução do marcador de irídio a dois milimolares.Incube as partículas com a sonda de irídio em um agitador de placa durante uma hora. Após uma hora, leia a intensidade de emissão em 510 nanômetros utilizando um leitor de placas de 96 poços.Após a síntese e caracterização da sonda de irídio ciclometalada, diversos aminoácidos são testados quanto à reatividade com o complexo. Apenas a histidina provoca uma resposta de sinal em unidades de fluorescência relativa após titulação da sonda. Na presença de dois peptídeos contendo histamina em solução, observa-se uma resposta dependente da concentração.Essa resposta pode ser observada aqui sob luz ultravioleta de larga faixa. A interferometria de biocamada para análise cinética de várias concentrações da sonda de irídio ligando-se ao BNT dois na superfície de um níquel. O sensor de vidro NT.A revela que a sonda de irídio possui afinidade na faixa de micromolar pelas peptídeos contendo histidina.O limite de detecção para a proteína rica em histidina utilizando a sonda foi semelhante quando a proteína foi imobilizada na superfície de uma partícula magnética. Assim como em solução, essa marcação da proteína pode ser visualizada na superfície das próprias partículas, uma vez dominada a técnica. Este método pode ser realizado em duas horas, se executado corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado durante as etapas de lavagem e transferência com as partículas magnéticas ligadas à proteína. A remoção da proteína não ligada é essencial para a detecção adequada da P-F-H-R-P dois imobilizada, projetando um elemento de reconhecimento molecular que irá direcionar especificamente a proteína ligada por meio de interações antígeno-anticorpo. Ao mesmo tempo, o uso da sonda de irídio robusta permitirá uma detecção mais sensível e específica das proteínas ligadas à superfície das partículas após seu desenvolvimento.Essa técnica tem o potencial de ser utilizada para abrir caminho para pesquisadores na área de diagnósticos explorarem o uso de reagentes robustos não apenas para a detecção da malária, mas também para outras doenças infecciosas.

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Research

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Química

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Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

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Síntese, Caracterização e Aplicação de Nanoprobes superparamagnéticos de óxido de ferro para detecção de tuberculose extrapulmonar

Este protocolo centra-se na identificação de proteínas que se ligam a fosfatos de inositol ou fosfoinositídeos. Ele usa a cromatografia de afinidade com fosfatos de inositol biotinylated ou fosfoinositídeos que são imobilizados via estreptavidina para agarose ou grânulos magnéticos. Fosfato de inositol ou proteínas de ligação Fosfoinositídeo são identificados por western blotting ou espectrometria de massa.

Identificação de fosfato de inositol ou proteínas Fosfoinositídeo interagindo por cromatografia de afinidade acoplada a Western blot ou espectrometria de massas

O imunoensaio eletroqueiluminescence (ECLIA) é uma nova abordagem para detecção quantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas e exógenamente aplicadas, que produz medições altamente quantitativas, precisas e reprodutíveis com baixo erro intra e interensaio sobre uma ampla gama de trabalho. Aqui, o protocolo para o MeCP2-ECLIA em um formato de 96 poços é descrito.

Um ensaio baseado em eletroquimiluminescência para variantes de proteína MeCP2

O presente protocolo descreve uma operação detalhada de imagem de fluorescência NIR-II em tempo real de um rato usando um dispositivo de imagem óptica NIR-II.

Uma sonda de fluorescência NIR-II brilhante para imagens vasculares e tumorais

Aprenda a detectar o biomarcador de malária proteína rica em histidina-II usando uma sonda fosforescente de irídio (III). Este método robusto oferece detecção rápida e específica para diagnósticos melhorados.

Iridium (III) luminescentes Sonda para detecção da proteína maláricos Biomarker proteína rica em histidina-II

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