Name: Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a silenciar atividade neural remotamente em regiões cerebrais específicas de roedores durante tarefas de aprendizado e memória. Este método utiliza farmacogenética para investigar mecanismos neurais subjacentes ao comportamento.

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Agradecemos aos autores de Robinson et al. 12, para suas contribuições para o manuscrito do qual este protocolo é parcialmente derivado.

O uso de animais são aprovados pelo Oberlin College Animal Care Institucional e Use comissão e estão em conformidade com o Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 21. 1. Preparação para perfusão Viral Nota: Este protocolo usa BSL-1 precauções. Ao empregar BSL-2 precauções, um jaleco descartáveis, luvas, sapato cobre, proteções oculares e um respirador de partículas (tipo N95) são obrigatórios. Todos os indivíduos manipulação BSL-2 compostos devem ser testados para caber um respirador de partículas por uma agência de saúde pública local. Consulte Lowery &amp; Majewska (2010) 22 para obter detalhes adicionais sobre manuseio e armazenamento de vetores virais. <ol><li> Após a primeira utilização, alíquota e armazenar vírus não utilizado em 20 microtubos ul para evitar congelamento e descongelamento repetido. </li><li> Preparar a superfície de trabalho através da remoção de quaisquer objectos desnecessários e esterilizar a superfície com etanol a 70%. Prepara-se uma 1Solução de água sanitária 0% de descontaminação de resíduos AAV. Coloque um copo cheio de solução de lixívia e uma seringa de 10 mL estéril, para a superfície de trabalho. Coloque o tubo de microcentrífuga com o AAV em um recipiente com gelo picado durante a configuração. </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga com o vírus em uma morsa padrão. Carregar uma seringa de 10 mL com, pelo menos, 4 ul de AAV. Ter cuidado para não dobrar a ponta da seringa contra a parte inferior do tubo de microcentrífuga durante o carregamento. Certifique-se de que não existem bolhas de ar nos 4 ul de solução de AAV na seringa. </li><li> Descarte o tubo de vírus vazio no copo contendo 10% de alvejante. Armazenar as porções não utilizadas do vírus, tal como especificado pelo fornecedor. </li><li> Adicione água sanitária adicional de 10% para o recipiente de resíduos, e permitir que os resíduos que se sentar por 30 minutos antes de descartar os resíduos líquidos descontaminado. </li><li> Elimine todos os equipamentos de proteção e resíduos de plástico em um recipiente de risco biológico como instruído por diretrizes institucionais. Decontaminate qualquer equipamento ou superfícies que entraram em contato com o vírus usando 10% de alvejante. </li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Prepare a área cirúrgica através da colocação de papel absorvente banco sob o aparelho estereotáxico e em um espaço adjacente designada como uma área de manipulação de vírus específico. <ol><li> Coloque um recipiente de resíduos de lixívia a 10% na área de controle de vírus dedicado perto do aparelho cirúrgico. </li></ol></li><li> Induzir um nível constante de anestesia e preparar o rato para a cirurgia. <ol><li> Colocar o rato dentro de uma câmara de indução que contém uma mistura de gás isofluorano (gama de 1 a 3%) e de oxigénio (100% a cerca de 1 l / min) até que haja uma perda de consciência e falta de movimento intencional bruto. Manter a anestesia de isoflurano durante o procedimento cirúrgico. </li><li> Após 6 anestesia profunda é atingida, raspar o rato a partir de entre os olhos para um pouco atrás das orelhas. </li><li> Coloque o rato de volta para a câmara de indução para umadicional 1-3 min. </li><li> Certifique-se de que o sistema de anestesia isoflurano está ligado ao cone de nariz da cirurgia estereotáxica. Abrir a torneira de passagem no tubo de isoflurano para iniciar o fluxo de isoflurano para o stereotax. Manter o isoflurano e oxigênio nos níveis acima especificados. </li><li> Coloque o rato em um aparelho estereotáxico, assegurando a boca para a barra de mordida e garantir os bares de ouvido. </li><li> Aplique lubrificante ocular para os olhos e betadine ao local cirúrgico antes da incisão. </li></ol></li><li> Adicione uma incisão na linha média 2,4 centímetros da pele na superfície dorsal do crânio começando cerca de 2 mm caudal para os olhos. Retrair a pele para expor o crânio. Periodicamente incutir 0,9% de solução salina estéril nas margens do sítio cirúrgico para evitar tecidos de secagem. </li><li> Tecido membranoso claro desde o crânio até bregma e lambda são claramente visíveis. </li><li> Certifique-se de que o crânio é nível medindo as coordenadas dorso-ventral embregma e a lambda. Ajuste o dispositivo estereotáxico de acordo até coordenadas dorso-ventral na bregma e lambda diferem por não mais de 0,04 mm. </li><li> Neste momento, reduzir o gás isoflurano para entre 2 e 2,5%. </li><li> Retorne a broca para bregma, Rezero as coordenadas e depois mover a broca para a desejada medial-lateral e ântero-posterior de coordenadas. </li><li> Perfurar um furo na parte de coordenadas usando uma broca de 0,9 milímetros, uma vez que produz um orifício de tamanho apropriado para uma infusão de 28 g de uma seringa. </li><li> Definir a bomba de infusão para distribuir o vírus, a uma taxa de 0,2 mL / min. Colocar a seringa no braço do dispositivo estereotáxico infusão e diminuir a seringa no desejado de coordenadas. Fornecer a quantidade desejada de vírus (gama 0,1-0,8 uL). Por exemplo, proporcionar 0,8 ul de AAV ao longo de 4 min. Nota: realizar estudos piloto para determinar o volume ideal de infusão e a propagação típica de vírus em cada região de interesse. <ol><li> Após a entrega do vírus é complete deixar a seringa no lugar durante 10 minutos para evitar o refluxo para o tracto da agulha. Lentamente levantar a seringa a uma taxa de cerca de 5 mm / min. Repita até que todas as coordenadas foram infundidos com AAV. </li></ol></li><li> Fechar a ferida usando grampos cirúrgicos e casaco a ferida com pomada antibiótica tópica. </li><li> Siga as orientações institucionais para o manejo da dor pós-operatória. </li><li> Colocar o rato em uma gaiola com cama, uma tampa e sinalização adequada e retornar o rato para a instalação para animais. <ol><li> Se trabalhar sob BSL-2 precauções, recolher roupas de cama para a quantidade de tempo (geralmente 48-72 horas) especificado por diretrizes institucionais. Coloque roupas de cama em um recipiente de resíduos de risco biológico. </li><li> Elimine todos os materiais contaminados com AAV, tal como especificado pelas diretrizes para a sua eliminação segura. </li></ol></li></ol> 3. Aparelho Comportamental Nota: O aparelho de pré-condicionamento sensorial composto por um condicionamento operante padrão Chamber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) com um piso de grade de aço inoxidável, duas paredes laterais de acrílico e duas paredes de metal. <ol><li> Montar um 2,8 W luz sobre uma das paredes de alumínio para servir como a luz da casa e como o estímulo visual quando brilhou a 2 Hz. Montar um alto-falante na câmara para entregar os estímulos auditivos (a 10 seg, 1500 Hz, 78 dB e um tom puro 10 seg 78 dB de ruído branco). <ol><li> Use um comedouro para entregar 45 mg pelotas do alimento para o copo do alimento. Dentro do copo do alimento, fotocélulas infravermelhos detectar o tempo total gasto no copo do alimento antes, durante e após as apresentações dos estímulos e recompensas alimentares. </li><li> Casa das câmaras em armários de atenuação de som (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) equipados com exaustores (~ 68 dB). </li><li> Use um computador PC com software Med Associates para controlar a câmara operante e adquirir os dados. Durante as sessões Condicionado, recolher dados sobre o tempo total gasto com a cabeça no copo do alimento durante presentação do estímulo de luz (5 seg época) e durante a apresentação da recompensa alimentar (5 seg época). Durante a sessão de teste, recolher dados sobre o tempo total gasto no copo do alimento em resposta a apresentações dos estímulos auditivos (10 seg época início, quando os estímulos auditivos são terminadas). </li></ol></li></ol> 4. Visão geral da Pré-condicionamento sensorial Paradigm <ol><li> Após a recuperação da cirurgia, gradualmente restringir comida os ratos a 85% do seu peso corporal alimentar livre. Consulte o pessoal veterinário para um paradigma de restrição alimentar adequado. Nota: O 3-fase paradigma de pré-condicionamento sensorial está ilustrado na Figura 2. </li><li> Sessões de pré-condicionamento (fase 1; Diariamente sessões de treinamento mínimo de 64 conduzida por 4 dias consecutivos): <ol><li> Ratos presentes com 12 ensaios misturados que consistem em entrega de estímulos auditivos e visuais. Incluir intervalos inter-julgamento que média de 4,5 min (intervalo de 4,0 a 5,0 min) depois de cada umapresentação uditory. </li><li> Em 6 dos ensaios, presente um tom (de estímulo pré-condicionado) para 10 seg, seguido imediatamente por uma apresentação de 5 segundos a luz intermitente de estímulo. </li><li> Nos outros 6 ensaios, apresentar o ruído branco (estímulo não pareado) sozinho por 10 s. </li></ol></li><li> Sessões de condicionamento (Fase 2; diário sessões de treinamento mínimo de 64 realizados por 5 dias consecutivos): <ol><li> Presente ratos com oito ensaios que consistem de entrega do estímulo visual (a luz intermitente de estímulo) durante 5 segundos imediatamente seguido por entrega de dois pellets de alimentos 45 mg. Incluir intervalos inter-julgamento que média 7 min (intervalo de 6,0 a 8,0 min) depois de cada tentativa. Ocasionalmente ratos necessitam de mais de 5 sessões de condicionamento que aprender a associação comida leve. </li></ol></li><li> Teste de Sessão (Fase 3; uma única sessão de 78 min): <ol><li> Apresentar os ratos com 12 ensaios misturados que consistem de entrega dos estímulos auditivos sozinho. Incluir intervalos inter-julgamento que AVEraiva 4,5 min (intervalo de 4,0 a 5,0 min) após cada apresentação auditiva. </li><li> Em 6 dos ensaios, apresentar o estímulo tom (o estímulo pré-condicionados) sozinho por 10 s. </li><li> Nos outros 6 ensaios, apresentar o ruído branco (o estímulo não pareado) sozinho por 10 s. </li></ol></li><li> Contrabalançar os estímulos ao completar o estudo com uma segunda série de ratos que recebem o ruído branco como o estímulo pré-condicionado eo tom como o estímulo não pareado. </li></ol> 5. farmacológica e comportamental Procedimento <ol><li> Ligue a energia para o aparelho comportamental e carregar o código Med-PC para a sessão comportamental adequado. Fios e programar o aparelho comportamental de tal modo que os fãs que são montados nos armários de som atenuando ligar quando o poder está ligado. </li><li> Para preparar um / ml solução 1 mg de clozapina N-óxido (CNO), pesar 5,0 mg de CNO em um tubo de 15 ml e adicionar 5 ml de água estéril ou 5 ml de 0,9% estéril saline. Vortex até que a solução é clara. <ol><li> Se a CNO não se dissolve em solução ou se soluções mais concentradas de CNO são desejado adicionar um agente solubilizante, tal como DMSO 23. Especificamente, para preparar uma solução 1 mg / ml de CNO com 0,5% de DMSO, pesar 5,0 mg de CNO e adicionar 25 ul de DMSO para um tubo de 15 ml. Flick suavemente assegurar que o conteúdo permaneça na base do tubo. Quando a solução torna-se claro, adicionar 5 ml de água estéril ou 5 ml de solução salina estéril a 0,9%. Mais informações sobre a preparação de soluções de CNO estão disponíveis na página do recurso DREADD wiki 25. </li><li> Prepara-se uma nova solução CNO cada dia em que é administrada. </li></ol></li><li> Injectar o CNO intraperitonealmente a uma dose de 1 mg / kg, aproximadamente, 30 minutos antes do teste comportamental. Por exemplo, injectar uma ratazana de 200 g, com 0,2 ml da solução de CNO 1 mg / ml. O curso dose e do tempo de administração CNO foram selecionados com base em relatórios publicados anteriormente 2,12.<ol><li> Injectar CNO 30 minutos antes de cada sessão de pré-condicionamento (Fase 1; total de 4 dias de injecções) administrar o veículo, mas antes de todas as sessões subsequentes comportamentais. </li></ol></li><li> Depois de 30 minutos, colocar os ratos dentro das câmaras de ensaio de comportamento e iniciar o código de computador para a sessão de comportamento apropriado. </li><li> Após a conclusão da tarefa comportamental, retire imediatamente os ratos das câmaras e retornar os ratos para a colônia animal. </li></ol> 6. As análises dos dados comportamentais Nota: A variável dependente para todas as sessões de comportamento é a quantidade de tempo que a cabeça do rato está dentro do copo do alimento, como detectado pela interrupção das fotocélulas infravermelhos no copo do alimento. Os dados (em segundos) são recolhidos e registados pelo software de computador. <ol><li> Não conduzir análises sobre os dados gerados durante a fase de pré-condicionamento. </li><li> Para as sessões de condicionamento: analisar a cada um dos ratosbilidade de aprender a associação alimentos leves, comparando o comportamento copo do alimento durante a apresentação do estímulo visual entre os 5 sessões comportamentais. Especificamente, calcule o tempo médio gasto no copo do alimento durante a época luz 5 segundos para cada um dos oito ensaios / sessão (ou seja, uma média de oito ensaios que são cada 5 segundos de duração / rato). Compare controlo média e os valores experimentais para cada um dos cinco sessões por dia (ver Figura 3A). <ol><li> Analisar a motivação dos ratos para obter recompensa alimentar, comparando o comportamento copo do alimento durante a entrega da recompensa alimentar (5 seg época) entre os cinco sessões comportamentais usando o mesmo cálculo, conforme especificado para a 5 seg luz época acima. Estes valores irão ser consistentemente mais elevados do que aqueles adquiridos durante a apresentação do estímulo visual (ver Figura 3B). </li></ol></li><li> Para a sessão de testes: calcular um rácio de discriminação que descreve o comportamento copo do alimento dos ratos em resposta a presentations de cada estímulo auditivo. <ol><li> Especificamente, para cada rato, dividir o tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações do estímulo sensorial pré-condicionado (ou seja, o tom) pela soma do tempo médio gasto no copo do alimento após cada uma das seis apresentações da estímulo sensorial pré-condicionada (isto é, o tom de estímulo) mais a média do tempo total gasto no copo do alimento após cada uma das seis formas de apresentação do estímulo não emparelhado (isto é, o estímulo de ruído branco). Cada epoch é de 10 seg de duração. Nota: A pontuação de discriminação de 0,5 ou superior demonstra que os ratos aprenderam as associações inerentes ao paradigma pré-condicionamento sensorial. </li></ol></li></ol> 7. Verificação de AAV Colocação e Expressão <ol><li> Anestesiar e perfundir os ratos transcardialmente usando 4% de paraformaldeído. Devido à utilização de marcadores fluorescentes, não exceder um tempo pós-fixação de 2 horas a minimize perda de antigenicidade e para preservar o sinal fluorescente. </li><li> Desidratar cérebros perfundidos, transferindo-os para um frasco de cérebro contendo 30 ml de uma solução de sacarose a 20% em solução salina de fosfato tamponada (1x) para um mínimo de 2 dias, ou até que o cérebro afunda para o fundo do frasco cérebro. </li><li> Usar um micrótomo deslizante congelamento para fazer secções cerebrais coronais (20-40 um) ao longo de toda a extensão rostro-caudal da região de interesse. </li><li> Realizar imunohistoquímica dirigidos contra o receptor com etiquetas ou a proteína repórter para determinar a localização e a expressão do receptor de design e / ou repórter 12. Um protocolo de coloração imuno-histoquímica é fornecido na página de recursos DREADD wiki 25. </li><li> Monte as secções em lâminas SuperFrost-plus e lamela usando 100-200 mL de um meio de montagem aquoso. </li><li> Realizar a microscopia de fluorescência em tecido cerebral para verificar o posicionamento de AAV e a expressão da proteína 12,24.</li>
</ol>

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<li>Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlates+of+compensatory+collateral+sprouting+by+aminergic+and+cholinergic+afferents+in+the+hippocampal+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation.</a> Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve como aplicar uma abordagem farmacogenética (DREADD) para investigar como uma região específica do cérebro contribui para uma tarefa de aprendizagem complexo multi-fase. Com a capacidade de silenciar temporariamente e remotamente a atividade neural em regiões cerebrais distintas em toda as fases de aprendizagem, essa combinação de abordagens fornece uma plataforma para investigar uma ampla gama de comportamentos, incluindo formas mais sutis ou mascarados de aprendizagem. No exemplo descrito neste ...

Um emocionante desafio dentro do campo de neurociência comportamental é determinar os substratos neurais de comportamentos complexos. Um certo número de técnicas, tais como lesões permanentes, a inactivação do cérebro através de implantes temporários cânulas e Optogenetics foram utilizados para identificar as contribuições de regiões cerebrais discretas de subcomponentes de comportamentos complexos. Embora estas abordagens informar a nossa compreensão da especificidade regional durante a aprendizagem, cada técnica não é sem limitações. Especificamente, lesões permanentes são tipicamente conduzida antes do teste comportamental, assim os seus efeitos estão presentes ao longo da duração do paradigma. Canulação estudos que envolvem a apresentação de um inactivador neural de curto prazo (por exemplo, tetrodotoxina) pode produzir danos substanciais para o tecido cerebral e podem induzir o stress em indivíduos apenas antes do teste comportamental. Além disso, a inactivação por meio de punção é limitada à região de tecido que envolve oponta da cânula. Por último, enquanto optogenética oferece uma gama de flexibilidade para o controle temporal da actividade em regiões específicas do cérebro, que é o custo proibitivo e tecnicamente exigente. Essas limitações podem ser superadas através de uma abordagem farmacogenética (designer-receptores activados Exclusivamente-a-Designer-Drogas, DREADDs) 1,2. Mais importante, embora o conceito de farmacogenética é sofisticada, a execução da técnica é simples. Similar aos métodos cirúrgicos estereotáxicas tradicionais que envolvem a infusão de uma toxina (por exemplo, o NMDA, ácido iboténico) em regiões cerebrais discretas, esta técnica envolve a infusão de um vírus adeno-associado (AAV) que contém um fragmento de ADN para um inibidor do receptor modificado acoplado a proteína G (hM4Di; o receptor designer) para a região de interesse de roedores laboratoriais padrão (ver Figura 1). O vector viral também contém um repórter fluorescente (mcitrine). Uma vez incorporados nopara as células, o desenhador do receptor (e proteína repórter) são maximamente expressa três semanas pós-infusão ~ e pode ser activada selectivamente para 2-5 horas por administração sistémica da droga desenhador de outra forma biologicamente inerte, clozapina-N-óxido (CNO) 1 , 3. Porque o experimentador é dotado de controle temporal preciso, ainda remota sobre a atividade neural em regiões específicas do cérebro, farmacogenética combina muito bem com paradigmas comportamentais que são realizados em várias fases. Neste exemplo, a contribuição do córtex retrosplenial (RSC) ao estímulo-estímulo de aprendizagem é comparado com o seu papel na aprendizagem pavloviano, porém essa combinação de abordagens é bem adequado para qualquer número de questões que buscam identificar regiões do cérebro como específica contribuir para comportamento complexo. Além disso, embora não descritos no presente protocolo, virais e abordagens transgénicas podem ser usadas para atingir células de tipo específico DREADD expressão 2. Como is inerente em paradigmas comportamentais que envolvem tipos farmacológicos e / ou outras das manipulações experimentais, uma análise cuidadosa do desenho experimental e análise quantitativa subsequente é necessário quando se utiliza a abordagem DREADD. Experimentadores novas para a abordagem DREADD são encaminhados para uma avaliação abrangente da tecnologia atual DREADD 2. Cada dia, os organismos aprender sobre novos estímulos e eventos e seus relacionamentos entre si. Mesmo em um ambiente familiar, tais como casa, é rápido para detectar alterações nas relações entre estímulos, porque essas alterações podem ser preditivos de eventos significativos. Tal estímulo-estímulo (isto é, relacional) aprendizagem envolve a conjunção de vários estímulos e, tradicionalmente, tem sido associada com o hipocampo, que reside centralmente dentro do lobo temporal medial 4. No entanto, o hipocampo não existe nem actuar isoladamente; regiões corticais, tanto dentro como foralateral do lóbulo temporal medial fornecer informação sensorial crítica para a formação do hipocampo 5-7. Os estudos tradicionais permanentes lesão fornecem evidências convincentes para o envolvimento de um número de regiões corticais (por exemplo, os córtices retrosplï¿½icos, postrhinal e entorrinal) na aprendizagem dependente do hipocampo, mas são limitados em sua capacidade de discernir o papel de uma determinada região durante as fases discretas de 8-10 aprendizagem. O presente protocolo testa a hipótese de que a RSC é necessária para a aprendizagem estímulo-estímulo ao silenciar a RSC durante uma única fase de um 3-fase de pré-condicionamento sensorial paradigma 11,12. Resumidamente, os ratos recebem uma infusão de AAV que contém o receptor de design e ~ 3 semanas mais tarde são administrados a droga Designer (CNO) 30 minutos antes do início do teste de comportamento. No presente protocolo, os ratos experimentais receber CNO durante a primeira fase de testes (quando lear estímulo-estímuloning ocorre) e eles recebem veículo durante os próximos 2 fases de testes. Para controlar os efeitos involuntários de CNO no comportamento, infundir ratos com o receptor designer (hM4Di) e injetar com veículo em vez de CNO. Para dar conta de efeitos gerais de infusão viral e expressão do receptor, infundir um vírus de controle que não contém o receptor designer e administrar CNO. Um número de diferentes serotipos de AAV são utilizadas para entregar material genético. Os actuais orientações NIH para a pesquisa envolvendo recombinante ou moléculas sintéticas que mantém AAV (todos os serotipos) e construções de AAV recombinantes ou sintéticos, em que o transgene não codifica um produto de gene ou potencialmente carcinogénicos ou uma molécula de toxina e são produzidos na ausência de um vírus auxiliar, exigem precauções BSL-1 (Apêndice B-1. Risco do Grupo 1 (RG1) agentes) 13. Uma série de avaliações referentes à estrutura de AAV, utilidade e segurança estão disponíveis 14,15. Notavelmente, embora, Devido a preocupações relativas a possíveis reprodutivos 16,17 e mecanismos potenciais cancerígenos 18-20 em roedores, algumas instituições exigem o uso de BSL-2 precauções quando se trabalha com AAV. Verifique a BSL apropriado antes de usar, consultando os comitês de supervisão em instituições individuais em que a investigação será conduzida, os Centros de Controle de Doenças e as Diretrizes do NIH para a pesquisa envolvendo moléculas de DNA recombinante 13 ao usar vetores virais para manipulação genética nos Estados Unidos. Protecção individual, de formação investigador, contenção vetor, descontaminação, eliminação de materiais descontaminados, e pós-injeção de animais requisitos habitacionais são especificados por estas orientações. Além disso, consultar e siga apropriado Institutional Animal Care e Use as orientações do comitê ou orientações do comitê de supervisão institucionais equivalentes para garantir o manuseio seguro, administração e alienação de AAV.

<table><tbody><tr><td>Macho, ratos Long Evans, 55-60 dias de idade</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8 / hSyn-HA-hM4D (Gi) -IRES-mCitrine</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Cuidado: Este é um composto BSL-1</td></tr><tr><td>rAAV8 / hSyn-GFP</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Cuidado: Este é um composto BSL-1</td></tr><tr><td>Clozapina-N-óxido R</td><td>& D Systems</td><td>4936-10</td><td>Tampa de Gaiola de Rato de Drogas Designer</td></tr><tr><td>(policarbonato)</td><td>Design Alternativo&nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>Usado para cobrir gaiolas de animais 48-72 hr após a infusão</td></tr><tr><td>Papel de filtro (substituição)</td> <td>Design alternativo</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>Papel de filtro que acompanha tampas de gaiola</td></tr><tr><td>Morsa de mesa</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>Para segurar tubos de microcentrífuga contendo AAV no capô</td></tr><tr><td>Sacos de lixo de risco biológico</td><td>Grampos</td><td>113444</td><td>Revestimentos de risco biológico Medline</td></tr><tr><td>Lata de lixo de risco biológico</td><td></td><td></td> Amazon.com <td>United Solutions Lixeira retangular com rodas de 34 galões com alça de gancho e trava</td></tr><tr><td>Isoflurano, 100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>Anestésico</td></tr><tr><td>Estereotáxico duplo para pequenos animais com console de leitura de display digital</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 942</td><td>Equipamento cirúrgico</td></tr><tr><td>Barras auriculares sem ruptura, conjunto de 2 (rato)</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 955</td><td>Equipamento cirúrgico</td></tr><tr><td>Máscara de anestesia (rato)</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 906</td><td>Equipamento cirúrgico</td></tr><tr><td>A broca estereotáxica de alta velocidade inclui controlador de motor de mesa, pedal, peça de mão, suporte de peça de mão estereotáxica</td><td>David Kopf</td><td>Modelo 1474</td><td>Equipamento cirúrgico</td></tr><tr><td>Microdrill fress, 0.9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>Fornecimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Bomba de seringa automatizada com controlador micro4</td><td>David Kopf</td><td>Modelo UMP3-1</td><td>Equipamento cirúrgico</td></tr><tr><td>Lâmina de cerâmica destacável pró-animal kit clipper</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>Fornecimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Limpador de pele Betadine</td><td>Perdue Products LP</td><td>67618-149-04</td><td>Fornecimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Pomada antiobiótica tripla</td><td>Medline Supply</td><td>53329-087-01</td><td>Fornecimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Puralube pomada veterinária</td><td>Somente Suprimento Veterinário</td><td>17033-211-38</td><td>Fornecimento cirúrgico</td></tr><tr><td>Dino-lite</td><td>Microscópio</td><td>AD7013MTL</td><td>Uma alternativa ao escopo de dissecação tradicional</td></tr><tr><td>Dino-lite suporte de mesa rígido</td><td>Microscópio</td><td>MS36B</td><td>Equipamento cirúrgico</td></tr><tr><td>28 G 10 &mu; l seringa</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>Equipamento cirúrgico</td></tr><tr><td>Cubículo de atenuação de som MDF extra alto</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' L x 22" A x 16" P</td></tr><tr><td>Câmara de teste modular extra alta</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Piso de grade de aço inoxidável</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>Equipamento</td></tr> <tr><td>comportamentalLuz da casa</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>Usado como luz da casa e luz de estímulo</td></tr><tr><td>Dispensador modular de pellets</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Receptáculo de pellets, tipo copo</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Detector de entrada de cabeça para rato</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-254-CB</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Pellets de alimentos de precisão sem poeira, 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>Alimentação comportamental</td></tr><tr><td>Alto-falante de gaiola para câmara de rato</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Gerador de áudio programável</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Pacote Smart ctrl 8 entrada/16 saída</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Gabinete de mesa grande e fonte de alimentação</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Pacote de interface PCI</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>MED Intel core computador pkg com monitor X Pro de 19"</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>Equipamento comportamental</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (grannular), 1 kg</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>19210</td><td>Perigo: cancerígeno, pesagem no capô</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de coelho (HA-Tag)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3724S</td><td>Reagente de histologia</td></tr><tr><td>XP Anticorpo monoclonal de coelho (GFP)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2956S</td><td>Reagente de histologia</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4412S</td><td>Histology supplies</td></tr><tr><td>Superfrost plus slides</td><td>VWR international</td><td>483111-703</td><td>Suprimentos de histologia</td></tr></tbody></table>

um método para a atividade neural remotamente silenciando em roedores durante fases distintas de aprendizagem

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Este protocolo descreve como silenciar temporariamente e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os animais estão envolvidos em tarefas de aprendizagem e memória. A abordagem combina farmacogenética (Designer-Receptores-exclusivamente-Activated-a-Designer-Drogas) com um paradigma comportamental (pré-condicionamento sensorial) que se destina a distinguir entre diferentes formas de aprendizagem. Especificamente, a entrega mediada por vírus é utilizado para expressar um receptor geneticamente modificado inibidora acoplado a proteína G (o Designer receptor) para uma região do cérebro discreta no roedor. Três semanas mais tarde, quando os níveis de expressão do receptor desenhador são elevados, um agente farmacológico (Designer fármaco) é administrado sistemicamente 30 min antes de uma sessão comportamental específica. A droga tem afinidade para o receptor de design e, portanto, resulta na inibição de neurónios que expressam o receptor do desenhador, mas caso contrário, é biologicamente inerte. A região do cérebro permanece silenciado por 2-5 hr (depenDing da dose e via de administração). Após a conclusão do paradigma comportamental, tecido do cérebro é avaliada para a colocação correcta e expressão do receptor. Esta abordagem é particularmente útil para determinar a contribuição de regiões cerebrais individuais para os componentes específicos do comportamento e pode ser usado em qualquer número de paradigmas comportamentais.

Os resultados comportamentais Após a conclusão da experiência, a eficácia da inactivação temporária específica da região deve ser avaliada quantitativamente e qualitativamente. O presente exemplo envolve uma fase paradigma comportamental-3 (pré-condicionamento sensorial), em que a CNO foi administrada para atenuar a actividade neural no RSC durante as sessões de pré-condicionamento para testar a hipótese de que o CER é necessário para a formação de associações entre estímulos neutro 12.</s...

Este protocolo descreve como silenciar temporária e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os ratos estão envolvidos em tarefas de aprendizado e memória. A abordagem combina farmacogenética (Designer-Receptors-Exclusivamente-Ativados-por-Designer-Drugs) com um paradigma comportamental (pré-condicionamento sensorial) que é projetado para distinguir entre diferentes componentes de aprendizagem.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

O objetivo deste procedimento é silenciar temporária e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os animais realizam tarefas de aprendizado e memória. Isso é realizado primeiramente carregando um V a a que contém um receptor projetado e um marcador em uma seringa para infusão. O segundo passo é infundir um V a a na região de interesse no cérebro do rato.Em seguida, o fármaco sintético biologicamente inerte clozapina e óxido é preparado e injetado sistemicamente na rata. O passo final consiste em realizar testes comportamentais utilizando um paradigma de pré-condicionamento sensorial. Por fim, a microscopia de imunofluorescência em tecido cerebral de rato é utilizada para verificar a colocação do receptor sintético.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência comportamental, incluindo, mas não se limitando a, regulação da motivação, atenção, aprendizado e memória. Certifique-se de que todas as precauções institucionais para o trabalho com vírus adeno-associados sejam seguidas durante todo o procedimento; o vírus utilizado neste vídeo é classificado como um composto de nível biosseguro um. Prepare uma solução de água sanitária a 10%. Para a descontaminação de resíduos de vírus, providencie um local apropriado, um recipiente contendo solução de água sanitária e uma seringa estéril de 10 microlitros.No espaço de trabalho, coloque o tubo de microcentrífuga contendo uma alíquota de a a V em uma morsa de bancada padrão. Carregue uma seringa de 10 microlitros com pelo menos quatro microlitros de a A v. Certifique-se de que não haja bolhas de ar na solução de quatro microlitros de a a v. Na seringa, descarte o tubo vazio de vírus no béquer contendo água sanitária a 10%.Adicione mais 10% de água sanitária ao recipiente de resíduos e deixe o material repousar por 30 minutos antes de descartar o resíduo líquido descontaminado conforme especificado pelas diretrizes institucionais. Prepare a área cirúrgica colocando papel absorvente sobre a bancada sob o aparelho estereotáxico e em um espaço adjacente designado como área dedicada ao manuseio de vírus. Após induzir anestesia com 3% de isoflurano, flúor e oxigênio a uma taxa de um litro por minuto.Raspou o pelo da região entre os olhos até um pouco atrás das orelhas. Após a depilação, coloque o rato novamente na câmara de indução por três minutos com o animal fixado em um aparelho estereotáxico. Cubra os olhos com pomada oftálmica e prepare o local da incisão limpando com Betadine.Após fazer uma incisão mediana de 2,4 centímetros na pele, sobreposto ao crânio, iniciando aproximadamente dois milímetros cranialmente aos olhos, retrair a pele para expor o crânio e, em seguida, remover o tecido membranoso do crânio até que bgma e lambda sejam claramente visíveis. Após garantir que o crânio esteja plano, posicionar a broca em bgma, zerar as coordenadas e, então, mover a broca para as coordenadas medial, lateral e ântero-posterior desejadas. Fazer um orifício utilizando uma broca de 0,9, 0,7 ou 0,5 milímetro.Configure a bomba de infusão para administrar o vírus a uma taxa de 0,2 microlitros por minuto. Coloque a seringa no braço de infusão do aparelho estereotáxico e posicione a seringa na coordenada desejada. Utilize a bomba para administrar a quantidade desejada de vírus após a conclusão da entrega dos vírus.Deixe a seringa no lugar por 10 minutos para prevenir refluxo para dentro da agulha; eleve lentamente a seringa a uma taxa de cerca de cinco milímetros por minuto. Em seguida, desloque-se para a próxima coordenada e repita o procedimento até que todas as coordenadas tenham sido infundidas com a a v. Após fechar a ferida e administrar analgesia pós-operatória de acordo com o protocolo aprovado, coloque o rato em uma gaiola limpa com forração, tampa e sinalização adequada.Quando o rato estiver totalmente recuperado da anestesia, devolva-o à sala de alojamento. Aguarde três semanas ou mais antes de iniciar os testes comportamentais para garantir uma expressão adequada do receptor projetado. Esta figura mostra as três fases do paradigma de pré-condicionamento sensorial: a fase de pré-condicionamento, a fase de condicionamento e a fase de teste.O fármaco projetado, clozapina e óxido ou CNO, é usado para silenciar a atividade neural ao ativar o receptor projetado. O CNO pode ser injetado antes de qualquer fase do teste. Aqui, o CNO é injetado 30 minutos antes de cada sessão de condicionamento prévio. Após o preparo de uma solução fresca de um miligrama por mililitro de clozapina e óxido, de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo, injete o CNO por via intraperitoneal na dose de um miligrama por quilograma 30 minutos antes do teste comportamental.Inicie o código do computador para a sessão comportamental apropriada. Após decorridos 30 minutos, coloque as ratas nas câmaras de teste e inicie a primeira das 4 sessões de pré-condicionamento de 64 minutos, apresentando às ratas 12 ensaios intercalados que consistem na entrega de estímulos auditivos e visuais. Em seis dos ensaios, apresente um tom, o estímulo pré-condicionante, por 10 segundos, seguido imediatamente por uma apresentação de cinco segundos do estímulo de luz piscante nos outros seis ensaios.Apresente o ruído branco, o estímulo não condicionado isoladamente, por 10 segundos. Após a conclusão da fase de pré-condicionamento, inicie as sessões de condicionamento, que serão realizadas durante cinco dias consecutivos. Apresente aos ratos oito ensaios que consistem na apresentação do estímulo visual, a luz piscante por cinco segundos, seguida imediatamente pela entrega de 2 pelotas alimentares de 45 miligramas.Neste momento, inclua intervalos entre ensaios que totalizem sete minutos quando as sessões de condicionamento forem concluídas. Realize a única sessão de teste de 78 minutos apresentando aos ratos 12 ensaios intercalados que consistem na apresentação dos estímulos auditivos isoladamente. Em seis dos ensaios.Apresente o estímulo sonoro, o estímulo de pré-condicionamento isolado, durante 10 segundos. Nos outros seis ensaios, apresente o ruído branco, o estímulo não pareado isolado, durante 10 segundos. Após a conclusão da tarefa comportamental, remova imediatamente os ratos das câmaras e retorne-os à colônia animal.Analise os dados das fases de condicionamento e teste de acordo com as instruções detalhadas na parte escrita do protocolo. Após realizar a imunohistoquímica direcionada contra o marcador ou a proteína repórter, examine as lâminas coradas por microscopia para determinar a localização e expressão do receptor projetado e/ou do repórter conforme esperado. Ratos de controle e experimentais aprenderam de forma semelhante a associação clássica entre o estímulo luminoso intermitente e o alimento durante as sessões de condicionamento.Nas sessões, ambos os grupos também foram motivados a obter recompensa alimentar durante a sessão de condicionamento. Em contraste, durante a sessão crítica de teste, os ratos experimentais não conseguiram discriminar entre os estímulos auditivos pré-condicionados e os não condicionados, enquanto os ratos controle exibiram maior comportamento na copa de alimento em resposta às apresentações do estímulo pré-condicionado. Assim, apenas os ratos controle, e não os experimentais, demonstraram o efeito de pré-condicionamento sensorial.Esta imagem mostra a verificação histológica da localização de uma infusão intraventricular na região de interesse no cérebro de roedor após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de neurociência explorassem as contribuições de regiões cerebrais específicas e/ou tipos celulares para comportamentos complexos in vivo.

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Neste relatório, nós apresentamos um sistema totalmente automatizado e altamente versátil, capaz de, simultaneamente, testar multi-cognitivas comportamentos e registro das atividades neuronais para roedores.

Um sistema totalmente automatizado e altamente versátil para testes de várias funções cognitivas e registro das atividades neuronais em roedores

Coloque um filhote neonatal anestesiado em uma almofada de aquecimento.Desinfete o couro cabeludo com etanol.Encha uma seringa com uma solução viral contendo vírus adeno-associados que carregam o gene para um receptor inibitório ativado por drogas e um corante de rastreamento.Alinhe a ponta da seringa com a cabeça do filhote e injete lentamente o vírus no cérebro para uma distribuição uniforme.Permita que o filhote se recupere.Durante a incubação, as partículas virais entram nos neurônios e...

Silenciamento quimiogenético da atividade neuronal em um camundongo neonatal

Fonte: Lai, J., et al. Registro eletrofisiológico simultâneo e microinjeções de agentes inibitórios no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra uma técnica baseada em microinjeção para registro e inibição neuronal simultânea no colículo superior de ratos. O procedimento envolve direcionamento estereotáxico, perfuração do crânio e a inserção de um injetor, que fornece um neurotransmissor inibitório enquanto registra a atividade neuronal. A estimulação da luz evoca potenciais...

Inibição da atividade neuronal e sua detecção usando eletrofisiologia em um rato

Um protocolo totalmente automatizado para roedor condicionamento operante é proposto. O protocolo se baseia em controle temporal precisa de eventos comportamentais para investigar até que ponto os experimentos influências deste controle neural atividade subjacente de integração sensório-motora e controle cognitivo.

Um totalmente automatizada Roedor Condicionado Protocolo para Sensorimotor Integração e Experimentos controle cognitivo

Aprender novas associações estímulo-resposta envolve uma ampla gama de processos neurais que são em última análise, refletem na mudança de pico de saída de neurônios individuais. Aqui nós descrevemos um protocolo de comportamento que permite o registro contínuo da atividade de um único neurônio enquanto que os animais adquirem, extinguir, e readquirir uma resposta condicionada em uma única sessão experimental.

Registro do potencial de ação simples Neurônios &#39;de livremente mover Pombos em três estágios da aprendizagem

Aqui, criamos uma pipeta de vidro com funções duplas: inibição de estruturas cerebrais profundas por microinjeções de drogas e monitoramento em tempo real de seus efeitos por meio de registros eletrofisiológicos simultâneos.

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Shuttle-box aprendizagem evasão está bem estabelecida em neurociência comportamental. Este protocolo descreve como shuttle-box aprendizagem em roedores pode ser combinado com microstimulation site-specific elétrica intracortical (ICMS) e crônica simultânea em gravações vivo como uma ferramenta para estudar vários aspectos da aprendizagem e percepção.

Combinado Shuttle-Box Formação com eletrofisiológica Cortex Gravação e Estimulação como Ferramenta para o Estudo de Percepção e Aprendizagem

Estimulação do nervo vago (VNS) emergiu como uma ferramenta para induzir plasticidade sináptica alvejado na parte frontal do cérebro para modificar uma série de comportamentos. Este protocolo descreve como implementar VNS para facilitar a consolidação da memória de extinção do medo.

Estimulação do nervo vago como uma ferramenta para induzir plasticidade em Pathways relevantes para a Aprendizagem Extinção

Apresentamos métodos para a construção de eletrodos para registrar simultaneamente a atividade neural extracelular e liberar múltiplas substâncias neuroativas nas proximidades dos locais de registro em camundongos acordados. Esta técnica permite a análise detalhada de entradas sinápticas locais putativas para o neurônio de interesse.

Extracelular Gravação de Neuronal Atividade Combinado com Microiontophoretic aplicação de substâncias neuroativos em Ratos Awake

A concepção e montagem de microdrives no registros eletrofisiológicos in vivo de sinais do cérebro do rato é descrito. Anexando pacotes de microeletrodos para portadores de driveable resistentes, estas técnicas permitem gravações neurais de longo prazo e estável. O design leve permite o desempenho comportamental irrestrito pelo animal após a implantação da unidade.

Construção de Matrizes Microdrive para gravações Neurais crônica na Awake Mice comportam

Aprenda a silenciar atividade neural remotamente em regiões cerebrais específicas de roedores durante tarefas de aprendizado e memória. Este método utiliza farmacogenética para investigar mecanismos neurais subjacentes ao comportamento.

Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

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