Um método para a atividade neural remotamente Silenciando em Roedores Durante fases distintas de Aprendizagem

O objetivo deste procedimento é silenciar temporária e remotamente a atividade neuronal em regiões cerebrais discretas enquanto os animais estão envolvidos em tarefas de aprendizado e memória. Isso é feito carregando primeiro o a a V que contém um receptor projetista e um repórter em uma seringa para infusão. O segundo passo é infundir um a V na região de interesse no cérebro do rato.

Em seguida, a droga biologicamente inerte clozapina e óxido é preparada e injetada sistemicamente no rato. A etapa final é realizar testes comportamentais usando um paradigma de pré-condicionamento sensorial. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência no tecido cerebral do rato é usada para verificar a colocação do receptor projetado.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência comportamental, incluindo, mas não se limitando à regulação da motivação, atenção, aprendizagem e memória Certifique-se de que todas as precauções institucionais para trabalhar com vírus adeno-associados sejam seguidas em todo o vírus usado neste vídeo é classificado como um composto de nível um de biossegurança. Prepare uma solução de alvejante a 10%. A descontaminação é um local de resíduos, uma bega contendo solução de alvejante e uma seringa estéril de 10 microlitros.

No espaço de trabalho, coloque o tubo de microcentrífuga contendo uma alíquota de a a V em um torno de bancada padrão Load, uma seringa de 10 microlitros com pelo menos quatro microlitros de a A v. Certifique-se de que não haja bolhas de ar nos quatro microlitros de uma solução de aa v. Na seringa, descarte o tubo de vírus vazio no copo contendo 10% de alvejante.

Adicione mais 10% de alvejante ao recipiente de resíduos e deixe os resíduos descansar por 30 minutos antes de descartar os resíduos líquidos descontaminados, conforme especificado pelas diretrizes institucionais. Preparar a área cirúrgica colocando papel de bancada absorvente sob o aparelho estereotáxico e num espaço adjacente designado como área específica de tratamento de vírus. Após a indução da anestesia foi de 3% isof, flúor e oxigênio a uma taxa de um litro por minuto.

Raspou o pelo entre os olhos até um pouco atrás das orelhas. Após o barbear, coloque o rato de volta na câmara de indução por três minutos com o rato preso em um aparelho estereotáxico. Cubra os olhos com pomada oftalmática e prepare o local da incisão limpando com Betadine.

Depois de fazer uma incisão na linha média da pele de 2,4 centímetros, sobrepondo o crânio, começando aproximadamente dois milímetros cordal aos olhos, retraia a pele para expor o crânio e, em seguida, limpe o tecido membranoso do crânio até que bgma e lambda estejam claramente visíveis. Depois de garantir que o crânio esteja plano, posicione a broca em bgma, zere as coordenadas e, em seguida, mova a broca para as coordenadas medial, lateral e ântero-posterior desejadas. Faça um furo usando uma broca de 0,9, 0,7 ou 0,5 milímetros.

Defina a bomba de infusão para administrar o vírus a uma taxa de 0,2 microlitros por minuto. Coloque a seringa no braço de perfusão do dispositivo estereotáxico e baixe a seringa até à coordenada desejada. Use a bomba para fornecer a quantidade desejada de vírus após a conclusão da entrega dos vírus.

Deixe a seringa no lugar por 10 minutos para evitar o refluxo para a agulha rastreada, levante lentamente a seringa a uma taxa de cerca de cinco milímetros por minuto. Em seguida, vá para a próxima coordenada e repita o procedimento até que todas as coordenadas tenham sido infundidas com um a v. Após fechar a ferida e fornecer analgesia pós-operatória de acordo com o protocolo aprovado, coloque o rato em uma gaiola limpa com cama, tampa e sinalização adequada.

Quando o rato estiver totalmente recuperado da anestesia, devolva-o à sala de alojamento. Aguarde três ou mais semanas antes de iniciar o teste comportamental para garantir a expressão adequada do receptor projetado. Esta figura mostra as três fases do paradigma de pré-condicionamento sensorial, a fase de pré-condicionamento, a fase de condicionamento e a fase de teste.

A droga projetada, clozapina e óxido ou CNO é usada para silenciar a atividade neural Ao ativar o receptor de design, o CNO pode ser injetado antes de qualquer fase de teste. Aqui, o CNO é injetado 30 minutos antes de cada uma das sessões de pré-condicionamento. Depois de preparar uma nova solução de um miligrama por mililitro de clozapina e óxido, de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo, injete o CNO intraperitoneal na dose de um miligrama por quilograma 30 minutos antes do teste comportamental.

Inicie o código de computador para a sessão comportamental apropriada. Após 30 minutos, coloque os ratos nas câmaras de teste e comece a primeira das 4 sessões de pré-condicionamento de 64 minutos, apresentando aos ratos 12 tentativas misturadas que consistem na entrega de estímulos auditivos e visuais. Em seis das tentativas apresentam um tom do estímulo pré-condição por 10 segundos, seguido imediatamente por uma apresentação de cinco segundos do estímulo de luz intermitente nas outras seis tentativas.

Apresente o ruído branco, o estímulo não exibido sozinho por 10 segundos. Após a conclusão da fase de pré-condicionamento, inicie as sessões de condicionamento, que serão realizadas ao longo de cinco dias consecutivos. Apresente aos ratos oito tentativas que consistem na entrega do estímulo visual, a luz intermitente por cinco segundos, seguida imediatamente pela entrega de 2 pellets de comida de 45 miligramas.

Este tempo inclui intervalos entre tentativas que duram sete minutos quando as sessões de condicionamento são concluídas. Realize a única sessão de teste de 78 minutos, apresentando aos ratos 12 tentativas misturadas que consistem apenas na entrega dos estímulos auditivos. Em seis dos ensaios.

Apresente o estímulo de tom, o estímulo de pré-condição sozinho por 10 segundos. Nas outras seis tentativas, apresente o ruído branco, o estímulo não pareado sozinho por 10 segundos. Após a conclusão da tarefa comportamental, remova imediatamente os ratos das câmaras e devolva-os à colônia de animais.

Analise os dados da fase de condicionamento e teste de acordo com as instruções detalhadas na parte escrita do protocolo. Depois de realizar a imuno-histoquímica direcionada contra o repórter marcado ou a proteína repórter, examine as seções de coloração por microscopia para verificar a localização e expressão do receptor projetado e / ou repórter como esperado Ratos de controle e experimentais aprenderam da mesma forma a Associação Pavloviana entre o estímulo de luz intermitente e o alimento. Durante as sessões de condicionamento.

Nas sessões, ambos os grupos também foram motivados a obter recompensa alimentar durante a sessão de condicionamento. Em contraste, durante a sessão de teste crítico, os ratos experimentais não conseguiram discriminar entre os estímulos auditivos pré-condicionados e não arejados, enquanto os ratos de controle mostram maior comportamento do copo de comida em resposta às apresentações do estímulo pré-condição. Assim, ratos controle, mas não experimentais, mostraram o efeito de pré-condicionamento sensorial.

Esta imagem mostra a verificação histológica da localização de uma infusão de um a v na região de interesse no cérebro do roedor após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem as contribuições de regiões cerebrais específicas e/ou tipos de células para o comportamento complexo in vivo.