Name: Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprenda a isolar e propagar células tumorais circulantes de sangue total de modelo murino de hepatocarcinoma metastático. Esta técnica reprodutível viabiliza pesquisa em metástase e aplicações clínicas potenciais.

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O trabalho no laboratório do Dr. Ogunwobi é apoiado por uma bolsa do Programa de Centros de Pesquisa em Instituições Minoritárias do Instituto Nacional de Saúde das Minorias e Disparidades de Saúde (MD007599) dos Institutos Nacionais de Saúde. O conteúdo deste manuscrito é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIMHD ou do NIH.

Declaração de Ética: Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Hunter College of The City University of New York. 1. Procedimentos Pré-experimento <ol><li> Após a chegada à facilidade animal, inicialmente casa de 3 camundongos BALB / c com uma gaiola com uma cama superior e lascas de madeira filtrada. Certifique-se de que os ratos têm acesso livre à comida, Purina para roedores e água. Roupa de cama e comida devem ser mudadas duas vezes por semana, enquanto as gaiolas devem ser limpas uma vez por semana. </li><li> Induzir a anestesia geral em ratinhos usando um vaporizador de isoflurano, juntamente com oxigénio a uma taxa de fluxo constante de 1 litro por min. O sistema é auto-suficiente e inclui um vaporizador de precisão. </li><li> Posição animal numa caixa de plástico que tem o vaporizador de precisão e de gás / sistema anestésico ligado a ele. Inicialmente definir o vaporizador para 2,5 até animal está inconsciente, altura em que o vaporizador para diminuir 2. </li><li> Naquele tempo, mude olinha de válvulas, selando-a para a caixa e abri-lo para o cone do nariz. </li><li> Mover o animal para a área de preparação, com o cone do nariz colocado adequadamente e ligado (para a manutenção da anestesia). </li><li> Prepare 5 × 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC para implantação por mouse. BNL 1ME A.7R.1 deve crescer num meio (10% de FBS inactivado pelo calor, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-Glutamina) incubar numa placa de cultura de células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de ar e CO 2. </li><li> Com uma seringa tendo uma agulha G 20, o implante 100 ul de PBS contendo 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células de carcinoma hepatocelular rato em um lóbulo do fígado de ratinhos BALB / C para produzir os tumores primários. Pós-implantação, a casa dos camundongos BALB / c em uma gaiola com os mesmos requisitos de casas como pré-implantação. </li><li> No ponto final experimental, evidência clínica de carcinoma hepatocelular é observável uma redução significativa na condição corporalpontuação (geralmente detectada após 4 semanas). Neste ponto, há uma probabilidade de que os tumores primários têm desenvolvido no fígado enquanto os depósitos metastáticos ter se formado nos pulmões. Em seguida, inicia o processo de isolamento e a propagação de células tumorais circulantes. </li></ol> 2. Recolha de Sangue Total para o isolamento de células de tumor circulantes NOTA: devidamente higienizados área de cirurgia e verifique se ele está livre de desordem. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos ou mergulhar em um desinfectante de acordo com a recomendação do fabricante <ol><li> Sacrifício camundongos por eutanásia humanitária no experimental ponto final (evidência clínica de desenvolvimento do tumor). Eutanásia dos ratos deve envolver CO 2 asfixia. Observe a murganhos corretamente para confirmar a anestesia é distribuído corretamente. O dióxido de carbono deve ser libertado lentamente no interior da câmara ao longo de um período de 5 - 10 min, causando paragem respiratória. Siga por sangria intracardíaca e cérvicoal luxação. 5 </li><li> Usar uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 mL para a recolha de sangue total. Heparanize a seringa com 0,01 ml de heparina. Punção da pele com a agulha imediatamente inferior ao xyphisternum a cerca de 45 ° de ângulo. Avance lentamente a agulha para perfurar o coração, e, em seguida, diminuir o ângulo da agulha. Firmemente segurar a agulha e seringa no lugar, e extrair 500 ul - 1.000 l de sangue total do coração. </li><li> Remover a seringa ea agulha e transferir o sangue para um tubo de 1,5 ml livre de pirogénio pré-rotulados. Centrifugar todo o sangue recolhido em 1,5 ml de tubo isento de pirogénios a 1167 xg durante 5 min. NOTA: A centrifugação separa a amostra de sangue em três camadas: a camada inferior ou de hematócrito que consiste em células vermelhas do sangue, uma fina camada intermédia de buffy coat, e uma camada de plasma superior. </li><li> Remover o plasma cuidadosamente por pipetagem e recolhendo-o em um tubo de 1,5 ml pyrogen-livre separado para furthexperimentos de er, tais como detecção de livre de células ácidos nucleicos 7. </li><li> Para o isolamento de células tumorais circulantes (CTCs), recolher o buffy coat em um tubo de 1,5 ml livre de pirogénio separada em preparação para células vermelhas do sangue (RBC) de lise. Isto é necessário para eliminar os glóbulos vermelhos residuais na camada buffy coat. </li></ol> 3. Receita de glóbulos vermelhos (RBC) Tampão de Lise <ol><li> Adicione uma solução de 1 L de tampão de lise dos glóbulos vermelhos. </li><li> Adicione a 500 ml de cloreto de amónio e 500 ml de Tris. Em seguida, misturam para criar uma solução de 1 L de tampão de lise dos glóbulos vermelhos com uma concentração final de 155 mM de cloreto de amónio e 10 mM de Tris. </li><li> Tamponar a solução a um pH de 7,5. Armazenar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos em 2-8 ° C, e levar a RT imediatamente antes do uso. </li></ol> 4. RBC Lise de Brasão Buffy <ol><li> Adicionar 1 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos para o tubo esterilizado de 1,5 mL isenta de pirogénio contendo buffy coat recolhido. </li><li> Misturar o conteúdo do tubo porinvertendo diversas vezes. Incubar os conteúdos misturados do tubo durante 5 min à temperatura ambiente no banco. Centrifugar os conteúdos foram misturados durante 5 min a 1167 x g. </li><li> Após a centrifugação, um sedimento esbranquiçado será obtida. Desprezar o sobrenadante avermelhada devagar e com cuidado em lixívia a 10%, sem qualquer interrupção para o sedimento. Se o sedimento não é esbranquiçado, voltar a fazer os passos 3,1-3,5. Aumentando o tempo de incubação em tampão de lise dos glóbulos vermelhos para 10 - 15 minutos também pode ser útil. </li><li> Com segurança descartar o lixo biológico, uma vez descontaminação de resíduos biológicos em 10% de alvejante está completa após 24 horas. </li></ol> 5. Propagação de Cultura de Células NOTA: As células de tumor de crescimento rápido são tipicamente células de glóbulos brancos que são abundantes na mistura original de células semeadas para o prato. Depois da mudança de forma repetida, e de passagens subsequentes CTC, todas as células brancas do sangue são removidas e uma população relativamente pura de CTC permanece. <ol><li> Depoisdescartando o sobrenadante para 10% de lixívia, lavar o sedimento esbranquiçada em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pelo menos uma vez, e ressuspender em meio de cultura completo para a propagação em cultura de células. </li><li> Depois de lavagem é completado, adicionar 1 ml de meio de cultura BNL 1ME A.7R.1 completo (10% de FBS inactivado pelo calor, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina) ao sedimento e ressuspender o sedimento em meio de cultura. </li><li> Semear o mix novamente suspensas de células em um prato de cultura de células. Incubar a placa de cultura de células a 37 ° C numa incubadora humidificada com ar e 5% de CO 2. </li><li> Mudar o meio de cultura celular a cada dois a três dias. Após cinco a sete dias, CTCs terão aderido à placa de cultura celular e começou a proliferar. Estas células permanecerá viável além de 25 passagens e após repetidos ciclos de congelamento e descongelamento 5. </li></ol> 6. Verificação de carcinoma hepatocelular linha de células tumorais circulantes <ol><li> Execute apolymerase reacção em cadeia (PCR) baseado, para amplificar um único segmento de DNA específica do gene globina do rato β-para confirmar que a nova linhas celulares estabelecidas CTC são células de ratinho, como a linha original é implantado BNL 1ME A.7R.1 HCC. Método foi originalmente descrito e validado por Steube et al. 5,8 </li><li> Realizar imunocoloração para o elemento de resposta específicos de hepatócitos marcador proteína de ligação cAMP como 3-3 (CREB3L3) usando um anticorpo específico. Isso irá confirmar que o romance CTCs estabelecidos são de fato hepatócitos como a linha de células BNL 1ME A.7R.1 original é implantado. 5 </li></ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
<li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Tissue+is+the+issue%22%3A+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastrointestinal+cancer%22%5BJournal%5D)">"Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li>
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<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste estudo, foi descrito como isolar e propagar CTCs do sangue total de um camundongo singênico com CHC. O objetivo deste trabalho é aprimorar os estudos em andamento sobre os mecanismos de metástase do câncer. 
Um fator que contribui para o mau prognóstico de muitos cânceres é a falta de detecção oportuna e consequente disseminação generalizada da malignidade3. As CTCs se originam de cânceres primários e se espalham pela corrente sanguínea para órgãos distantes. Como tal, as CTCs...

A comunidade de pesquisa do câncer sabe da existência de células tumorais circulantes (CTCs) desde que foi observada pela primeira vez por Thomas Ashworth em 18691. Desde então, as CTCs têm se mostrado importantes na metástase tumoral e na progressão da doença2-5. Hoje, os tumores sólidos são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. As CTCs são células raras que se originam de tumores primários e viajam pela corrente sanguínea para diferentes órgãos, dos quais apenas uma pequena fração acaba evoluindo para metástase2-5. Notavelmente, há correlação positiva entre o tamanho do tumor e o número de CTC3,4. 
Uma compreensão da biologia da CTC pode contribuir para a busca de terapia direcionada. Além disso, as CTCs podem ter aplicações diagnósticas. Para alcançar essas aplicações clínicas potenciais, é preciso superar alguns desafios atuais para estudar CTCs. Um desafio está relacionado ao fato de que as CTCs podem estar presentes como células únicas ou como aglomerados e podem até ser capazes de mudar seu fenótipo em resposta ao microambiente sanguíneo2. Além disso, a detecção pode ser muito desafiadora, em parte devido à baixa contagem de CTCs (algumas a centenas por mililitro) entre um bilhão de células hematológicas por mililitro no sangue6. No entanto, nos últimos anos, a pesquisa sobre as potenciais aplicações clínicas das CTCs de cânceres de órgãos sólidos se intensificou.
Apesar desses esforços, os desafios de estudar e compreender o papel das CTCs persistem devido à raridade das CTCs e à inadequação das ferramentas tecnológicas atualmente disponíveis. Apesar desses desafios, o tremendo potencial para aplicações clínicas continua a ser um incentivo para buscar pesquisas sobre o papel das CTCs na metástase do câncer.
Recentemente, tivemos sucesso em isolar e propagar em CTCs de cultura de células de um modelo ortotópico de camundongo singênico de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC)5. O objetivo do presente artigo é descrever em detalhes todos os aspectos da metodologia bem-sucedida. A importância desta metodologia reside no fato de que esta abordagem pode ser modificada para isolar e propagar com sucesso em cultura CTCs humanas, aumentando assim a possibilidade de estudos in vitro da biologia da CTC. 
Existem múltiplas aplicações clínicas potenciais para o uso de CTCs. As CTCs podem ser úteis para prognóstico, monitoramento de resposta, triagem, monitoramento dinâmico de alterações moleculares tumorais e terapia personalizada4. Portanto, uma melhor compreensão da biologia das CTCs tem alto potencial de impacto clínico.

<table><tbody><tr><td>Sal de Heparina Sódica 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tubo Micro 1.5 ml Clear NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1.5 ml&nbsp; Eppendorf Tubos</td></tr><tr><td>Agulha Estéril Disp BD 25 G x 1 in</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G Agulha</td></tr><tr><td>Slp Ponta SRNG 1 ml 200 cada por embalagem</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml ponta de seringa</td></tr><tr><td>Seringa 1 ml leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>Seringa de 1 ml</td></tr><tr><td>VWR Tecido</td> de pinça 6 <td>VWR</td><td>82027-446</td><td>Pinça</td></tr><tr><td>Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct compund 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct compound</td></tr><tr><td>VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Slides</td></tr><tr><td>VWR Vidro de cobertura #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>Tampa de vidro</td></tr><tr><td>VWR Slide Box True North Fm Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>Caixa deslizante</td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>Caneta PAP</td></tr><tr><td>Livre de RNASe e DNAse 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>Tampão de água sem nuclease</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure Grade 500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris</td></tr><tr><td>Buffer Cloreto de amônio ACS Grade 2, 5 Kg</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>Tampão de cloreto de amónio</td></tr><tr><td>Falcon Placa de cultura de tecidos 60 x 15 mm Placa de cultura de tecidos de poliestireno</td><td></td><td>VWR 353002</td><td>Clorox</td></tr><tr><td>Alvejante Germicida, Regular</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox Bleach</td></tr><tr><td>PBS, 1x (solução salina tamponada com fosfato) sem cálcio e magnésio (500 ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp; com 4,5 g/L de glicose e L-glutamina sem piruvato de sódio</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM 1x meio para células BNL 1ME A.7R.1</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Solução de estreptomicina de penicilina, 100x</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>30-002-Cl</td><td>Estreptomicina de penicilina</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75002411</td><td>Centrífuga de 13.000 rpm</td></tr></tbody></table>

isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

A metástase do câncer é a principal causa de mortes associadas ao câncer. Estudos recentes mostraram que as células tumorais circulantes (CTCs) são importantes na metástase do câncer. De fato, o número de CTCs se correlaciona com o tamanho do tumor. Aqui, é fornecida uma descrição detalhada de uma metodologia para isolamento e propagação de CTCs a partir de um modelo singênico de camundongo de carcinoma hepatocelular (CHC) que permite a análise a jusante de mecanismos moleculares potencialmente importantes de metástase tumoral de órgãos sólidos. Este método é eficiente e reprodutível. É uma técnica não invasiva e, portanto, tem potencial para substituir a biópsia invasiva de tecidos de humanos que pode estar associada a complicações. Portanto, o método discutido aqui permite o isolamento e a propagação de CTCs a partir de amostras de sangue total, de modo que possam ser examinadas e caracterizadas. Isso tem potencial para adaptação futura para aplicações clínicas, como diagnóstico e terapia direcionada personalizada.

A metodologia aqui descrita CTC mostrou que pode ser isolado. Os ratos foram sacrificados aos experimental humanamente de ponto final. O processo envolveu asfixia dióxido de carbono, sangria intra-cardíaca e deslocamento cervical. Um esquema de fases principais do processo são ilustrados na Figura 2. As amostras de sangue total coletado por sangria intra-cardíaca foram processados ​​utilizando o protocolo descrito acima. Após o que, a centrifugação foi usada para determinar a camada de ...

As células tumorais circulantes (CTCs) demonstraram desempenhar um papel importante na metástase tumoral. Aqui, um método para o isolamento e propagação de CTCs a partir do sangue total de um modelo de tumor singênico de camundongo de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC) é descrito.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e propagar células tumorais circulantes do sangue total de um modelo de tumor sincrônico em camundongo com metástase de carcinoma hepatocelular. Isso é realizado primeiramente por meio da centrifugação do sangue total coletado dos camundongos e isolamento da camada de buffy coat. Em seguida, as células vermelhas do sangue no buffy coat são lisadas e as células tumorais circulantes são coletadas em um pellet.As células são então lavadas, suspensas em meio de cultura completo e propagadas em cultura celular. As células tumorais de crescimento rápido permanecem viáveis por inúmeras passagens e podem ser verificadas utilizando técnicas moleculares diagnósticas padrão. A importância do isolamento de células tumorais circulantes utilizando nossa técnica é que ela fornece um modelo reprodutível, que pode ser otimizado para uso potencial em um ambiente clínico.Realizando o procedimento comigo estará Michelle Nadu, uma estudante de graduação do nosso laboratório. Para iniciar a coleta, sangue total de um modelo tumoral de Ciea Kamau com metástase de carcinoma hepatocelular, conforme descrito em um J separado de centrífuga vertical. O sangue total coletado a 1.167 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Uma vez separadas em camadas, remova cuidadosamente a camada superior de plasma e transfira-a para um tubo livre de rogen de 1,5 mililitro separado para experimentos adicionais, como a detecção de ácidos nucleicos livres celulares. Em seguida, transfira a camada do buffy coat para um tubo separado de 1,5 mililitro livre de ROGEN em preparação para a lise de hemácias. Isso é necessário para remover as hemácias residuais na camada do buffy coat antes do isolamento de células tumorais circulantes.Inicie preparando uma solução de um litro de tampão de lise de eritrócitos com concentração final de 155 milimolares de cloreto de amônio e 10 milimolares de triss. Ajuste o pH da solução para 7,5. Retire uma alíquota de cerca de dois a quatro mililitros da solução estoque, mistura de tampão de lise de eritrócitos de um litro.Em seguida, adicione um mililitro do tampão de lise de eritrócitos ao tubo contendo o buffy coat coletado. Misture o conteúdo do tubo invertendo-o várias vezes. Incube, então, o tubo por cinco minutos à temperatura ambiente sobre a bancada.Em seguida, centrifugue os conteúdos misturados por cinco minutos a 1.167 ×g. Após a centrifugação, será obtido um precipitado esbranquiçado. Descarte cuidadosa e lentamente o sobrenadante avermelhado em água sanitária a 10%, sem qualquer perturbação do precipitado.Após descartar o sobrenadante, lave o pellet esbranquiçado em um mililitro de PBS. Em seguida, reprecipite as células novamente e re-suspenda-as em meio de cultura completo. Semee as células re-suspensas em uma placa de cultura celular e incube as células a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com ar e 5% de dióxido de carbono.Altere o meio de cultura celular a cada dois ou três dias. Após cinco a sete dias, as células tumorais circulantes terão aderido à placa de cultura celular e começado a proliferar. Para verificar que as células tumorais circulantes do carcinoma hepatocelular foram isoladas corretamente.Realize PCR para um segmento específico do gene da betaglobina de camundongo, conforme descrito e validado por Stu. Em seguida, imunotinja as células com um anticorpo específico para o marcador específico de hepatócitos. Proteína semelhante ao fator de ligação ao elemento responsivo ao AMP cíclico três como três, utilizando técnicas padrão; as imagens apresentadas aqui são representativas de células tumorais circulantes de dois camundongos distintos.Em cultura, a partir de um modelo murino alogênico ortotópico de carcinoma hepatocelular. Células tumorais metastáticas aderem à placa e proliferam rapidamente. Elas podem ser expandidas por mais de 25 passagens e resistem a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.Depois de assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e propagar células tumorais circulares viáveis, bem como caracterizá-las tanto molecular quanto funcionalmente.

isolation-propagation-circulating-tumor-cells-from-mouse-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O vídeo descreve a técnica de injeção intracecal de células cancerígenas para desenvolver um modelo de camundongo ortotópico com tumores altamente uniformes. Portanto, o modelo ortotópico de camundongo permite a simulação realista de metástases, fornecendo uma ferramenta valiosa para estudar as mudanças fenotípicas durante o crescimento e disseminação do tumor.

Injeção de células tumorais intracecais: uma técnica para entregar células cancerígenas para estabelecer o modelo ortotópico de camundongo com câncer colorretal

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar células tumorais circulantes da amostra de sangue total de um modelo de camundongo com tumor colorretal sacrificado. Essas CTCs isoladas podem ser cultivadas e usadas para análise downstream pretendida.

Isolamento CTC de uma amostra de sangue total: um método para obter CTCs de modelo de câncer colorretal murino

A propagação metastática do câncer é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Nós fornecemos uma descrição detalhada da nossa metodologia cirurgia sobrevivência para o estabelecimento de um sistema modelo singï¿½ico rato "paciente-like" orthotopic para o estudo dos mecanismos de metástases em tumores de órgãos sólidos.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

Relatamos um método confiável para isolar e cultivar células endoteliais primárias específicas do tumor a partir de modelos de camundongos geneticamente modificados.

Isolamento e Cultura de Expansão de células endoteliais específicos de tumores

Este manuscrito detalha um método usado para gerar xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de próstata (PDXs) a partir de células tumorais circulantes (CTCs). A geração de modelos PDX a partir de CTCs fornece um modelo experimental alternativo para estudar o câncer de próstata; o tumor mais comumente diagnosticado e uma causa frequente de morte por câncer em homens.

Geração de paciente com câncer de próstata Derivado modelos de xenotransplante de células tumorais circulantes

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

Este protocolo descreve um método reprodutível para a isolação de pilhas preliminares do rabdomiossarcoma do rato, da formação e do tratamento do tumorsphere, e da transplantação do aloenxerto que partem das culturas dos tumorspheres.

Derivação e tratamento de tumorsphere de células tumorais primárias isoladas de rabdomiossarcoma de camundongo

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Um modelo de camundongo tumoral de câmara de janela de dobra cutânea dorsal para microscopia intravital combinada e ressonância magnética na pesquisa translacional do câncer

Aprenda a isolar e propagar células tumorais circulantes de sangue total de modelo murino de hepatocarcinoma metastático. Esta técnica reprodutível viabiliza pesquisa em metástase e aplicações clínicas potenciais.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

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