Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato
9 de outubro de 2015
As células tumorais circulantes (CTCs) demonstraram desempenhar um papel importante na metástase tumoral. Aqui, um método para o isolamento e propagação de CTCs a partir do sangue total de um modelo de tumor singênico de camundongo de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC) é descrito.
O objetivo geral deste procedimento é isolar e propagar células tumorais circulantes do sangue total de um modelo de tumor sincrônico em camundongo com metástase de carcinoma hepatocelular. Isso é realizado primeiramente por meio da centrifugação do sangue total coletado dos camundongos e isolamento da camada de buffy coat. Em seguida, as células vermelhas do sangue no buffy coat são lisadas e as células tumorais circulantes são coletadas em um pellet.
As células são então lavadas, suspensas em meio de cultura completo e propagadas em cultura celular. As células tumorais de crescimento rápido permanecem viáveis por inúmeras passagens e podem ser verificadas utilizando técnicas moleculares diagnósticas padrão. A importância do isolamento de células tumorais circulantes utilizando nossa técnica é que ela fornece um modelo reprodutível, que pode ser otimizado para uso potencial em um ambiente clínico.
Realizando o procedimento comigo estará Michelle Nadu, uma estudante de graduação do nosso laboratório. Para iniciar a coleta, sangue total de um modelo tumoral de Ciea Kamau com metástase de carcinoma hepatocelular, conforme descrito em um J separado de centrífuga vertical. O sangue total coletado a 1.167 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Uma vez separadas em camadas, remova cuidadosamente a camada superior de plasma e transfira-a para um tubo livre de rogen de 1,5 mililitro separado para experimentos adicionais, como a detecção de ácidos nucleicos livres celulares. Em seguida, transfira a camada do buffy coat para um tubo separado de 1,5 mililitro livre de ROGEN em preparação para a lise de hemácias. Isso é necessário para remover as hemácias residuais na camada do buffy coat antes do isolamento de células tumorais circulantes.
Inicie preparando uma solução de um litro de tampão de lise de eritrócitos com concentração final de 155 milimolares de cloreto de amônio e 10 milimolares de triss. Ajuste o pH da solução para 7,5. Retire uma alíquota de cerca de dois a quatro mililitros da solução estoque, mistura de tampão de lise de eritrócitos de um litro.
Em seguida, adicione um mililitro do tampão de lise de eritrócitos ao tubo contendo o buffy coat coletado. Misture o conteúdo do tubo invertendo-o várias vezes. Incube, então, o tubo por cinco minutos à temperatura ambiente sobre a bancada.
Em seguida, centrifugue os conteúdos misturados por cinco minutos a 1.167 ×g. Após a centrifugação, será obtido um precipitado esbranquiçado. Descarte cuidadosa e lentamente o sobrenadante avermelhado em água sanitária a 10%, sem qualquer perturbação do precipitado.
Após descartar o sobrenadante, lave o pellet esbranquiçado em um mililitro de PBS. Em seguida, reprecipite as células novamente e re-suspenda-as em meio de cultura completo. Semee as células re-suspensas em uma placa de cultura celular e incube as células a 37 graus Celsius em um incubador umidificado com ar e 5% de dióxido de carbono.
Altere o meio de cultura celular a cada dois ou três dias. Após cinco a sete dias, as células tumorais circulantes terão aderido à placa de cultura celular e começado a proliferar. Para verificar que as células tumorais circulantes do carcinoma hepatocelular foram isoladas corretamente.
Realize PCR para um segmento específico do gene da betaglobina de camundongo, conforme descrito e validado por Stu. Em seguida, imunotinja as células com um anticorpo específico para o marcador específico de hepatócitos. Proteína semelhante ao fator de ligação ao elemento responsivo ao AMP cíclico três como três, utilizando técnicas padrão; as imagens apresentadas aqui são representativas de células tumorais circulantes de dois camundongos distintos.
Em cultura, a partir de um modelo murino alogênico ortotópico de carcinoma hepatocelular. Células tumorais metastáticas aderem à placa e proliferam rapidamente. Elas podem ser expandidas por mais de 25 passagens e resistem a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
Depois de assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e propagar células tumorais circulares viáveis, bem como caracterizá-las tanto molecular quanto funcionalmente.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo descreve um método para isolar e propagar células tumorais circulantes (CTCs) a partir do sangue total de um modelo murino alogênico de metástase de carcinoma hepatocelular (HCC). A técnica tem como objetivo fornecer um modelo reprodutível para possíveis aplicações clínicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Oncologia
- Biologia Celular
- Pesquisa em Metástase
Contexto
- As células tumorais circulantes (CTCs) são cruciais na metástase tumoral.
- O isolamento de CTCs pode auxiliar na compreensão da progressão do câncer.
- Os métodos atuais de isolamento de CTCs podem apresentar falta de reprodutibilidade.
- Este estudo apresenta uma abordagem inovadora utilizando um modelo murino.
Objetivo do Estudo
- Isolar CTCs efetivamente do sangue total.
- Propagar CTCs para pesquisas futuras.
- Estabelecer um modelo que possa ser otimizado para uso clínico.
Métodos Utilizados
- Centrifugação do sangue total para isolar a camada de buffy coat.
- Lise das hemácias para coletar as CTCs em um pellet.
- Lavagem e suspensão das células em meio de cultura completo.
- Propagação das células em cultura celular para avaliação da viabilidade.
Resultados Principais
- As CTCs permanecem viáveis por múltiplas passagens.
- Técnicas padrão de diagnóstico molecular podem verificar as células.
- O método fornece um modelo reprodutível para pesquisa.
- Potencial para otimização em ambientes clínicos.
Conclusões
- A técnica de isolamento é eficaz para CTCs de modelos de CHC.
- Os resultados apoiam pesquisas futuras sobre metástase do câncer.
- Este método poderia aprimorar aplicações clínicas para o tratamento do câncer.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento e a propagação de células tumorais circulantes (CTCs) a partir de sangue total permitem o monitoramento não invasivo da dinâmica tumoral e do potencial metastático em modelos pré-clínicos. Essa abordagem auxilia na validação de alvos ao fornecer uma fonte renovável de células cancerígenas viáveis para estudos mecanicistas e desenvolvimento de ensaios. O método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, permitindo a caracterização funcional das CTCs em condições controladas de cultivo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando CTCs derivadas de um modelo de metástase de CHC alogênico.
- Valor Operacional: Oferece um sistema reprodutível para validação funcional de alvos e esclarecimento de vias.
- Valor Científico: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao permitir a caracterização molecular e funcional de CTCs isoladas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz CTCs propagadas adequadas para preparar sistemas biológicos validados para triagem de ensaios subsequentes.
- Valor Operacional: Garante a padronização do ensaio por meio da viabilidade celular e proliferação consistentes ao longo de múltiplas passagens.
- Valor Científico: Permite medições quantitativas de variáveis dependentes, como taxas de proliferação e expressão de marcadores, para avaliação de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença utilizando CTCs de um modelo murino alogrênico ortotópico de metástase de CHC.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, por meio de culturas de CTCs expansíveis.
- Valor Científico: Facilita estudos de alinhamento de biomarcadores utilizando marcadores específicos de carcinoma hepatocelular validados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes, ao fornecer culturas caracterizadas de CTCs para ensaios funcionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos por meio da confirmação molecular da identidade das CTCs.
- Triagem: Fornece populações celulares prontas para ensaios e reprodutíveis, com métricas quantitativas de crescimento para triagem de compostos.
- Análises: Gera resultados mensuráveis, como adesão, proliferação e expressão de marcadores, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta ao trabalho pré-clínico por meio de linhagens de CTCs que mantêm características específicas do CHC.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de cultura celular reutilizável, aplicável em múltiplos ciclos de estudo e campanhas de testes de compostos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da validação molecular e funcional de CTCs propagadas.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos de isolamento e cultivo.
- Valor Estratégico: Decisões aprimoradas de prosseguir/não prosseguir mediante redução da ambiguidade mecanicista em modelos de metástase.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base em dados funcionais derivados de CTCs.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas de cultura celular, hematologia e biologia molecular.
- Depende de equipamentos de centrifugação, tampões de lise e infraestrutura de cultura estéril.
- Necessita padronização entre equipes para isolamento consistente da camada de buffy coat e lise de hemácias.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes modelos de tumores ou espécies.
- Limitado pela necessidade de etapas de verificação molecular para confirmar a identidade das CTCs após o isolamento.
