Name: Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprenda a isolar leucócitos da decídua humana para estudos de imunologia na interface materno-fetal. Este método preserva marcadores de superfície celular e viabilidade para aplicações subsequentes.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional Kennedy Shriver Eunice de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, NIH / DHHS. Este trabalho também foi apoiado, em parte, pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty (Wayne State University) para suas leituras críticas do manuscrito.

Este protocolo é apropriado para o isolamento de leucócitos dos decídua basal e parietalis decídua em preparação para imunofenotipagem por citometria de fluxo. Além disso, as células isoladas podem ser utilizadas para selecção de células, cultura de células, o isolamento de RNA, e citologia. Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética humana deve ser obtido a partir Comitê de Ética em Pesquisa local e Conselhos de Revisão Institucional. A recolha e utilização de amostras humanas para fins de investigação foram aprovados pelos Conselhos de Revisão Institucional do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) Eunice Kennedy Shriver, Institutos Nacionais de Saúde (NIH), Departamento de Saúde e Serviços Humanos (DHHS , Bethesda, MD, EUA) e Wayne State University (Detroit, MI, EUA). Consentimento informado por escrito foi obtido de todas as mulheres grávidas, antes da colheita de amostras de tecido. NOTA: Ao trabalhar com sangue animal, células, ou de perigoagentes ous como mencionado neste protocolo, é essencial que biossegurança adequado e ações de segurança de laboratório ser seguido. 1. A dissecção das deciduais Tecidos Humanos NOTA: A placa basal é a base por baixo e ligado à placenta e representa a face materna. As membranas corioamnióticas incluem o âmnio e cório. A placa basal inclui os decídua basal e o cório inclui os decídua parietal (Figura 1). <ol><li> Decídua Basalis <ol><li> Dissecar uma parte da placa basal de um cotilédone da placenta (Figuras 1A e 1B). </li><li> Coloque-o sobre uma tábua de corte estéril com as vilosidades da placenta voltadas para cima. O lado que mostra as vilosidades da placenta é geralmente vermelho sangrento com tecido cabeludo na aparência. A placa basal é suave e pálido de cor vermelha. </li><li> Use afiados, tesouras de ponta fina e uma pinça para remover o villtecidos e vasos sanguíneos OUs. Manter o tecido embebido em 1x PBS (Ca2 + - Mg2 + e - livre) durante o processo (Figura 1C). Recolha 2-3 destas peças e lave-os abundantemente com 1x PBS para remover o sangue (Figura 1D). </li></ol></li><li> Decídua parietal <ol><li> Dissecar uma parte das membranas corioamnióticas (aproximadamente 10 cm x 10 cm, Figura 1E). Coloque-o sobre a placa com a chorion voltada para cima. O lado coriônica contém coágulos de sangue e é geralmente luz amarelada na cor. </li><li> Use uma pinça de ponta fina para remover o maior número de coágulos de sangue como possível (Figura 1E). Lavar a membrana em 1x PBS estéril para limpar o excesso de sangue a partir da membrana até que o PBS 1x corre claro. </li><li> Use um raspador de células estéril descartável para raspar suavemente a camada decidual a partir da membrana. Aplicar estéril 1x PBS na membrana ao completar este processo (Figura 1F). Recolher os tecidos deciduais e colocá-los em um tubo de plástico 50 ml com PBS estéril 1x (Figura 1G). </li></ol></li></ol> 2. mecânica desagregação e digestão enzimática <ol><li> Lavar o tecido dissecado do decídua basal (do passo 1.1.3) ou a decídua parietal (a partir do passo 1.2.3) com 1x PBS estéril num tubo de plástico de 50 ml. Recolhe pastilhas de tecido por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante situado acima da pelete de tecido cuidadosamente, sem perturbar o sedimento. NOTA: neste momento, os peletes são muito solta porque contêm células vermelhas do sangue. Se o volume do pelete é de cerca de ou menos de 3 ml, de re-suspender o sedimento em 6 ml de solução de separação celular pré-aquecida a 37 ° C. Se o sedimento é maior do que 3 ml de volume, adicionar mais solução de desprendimento de células (cerca de 2 vezes adicionar the o volume das amostras de tecido). </li><li> Transfira os tecidos homogeneizados (decídua basal + descolamento célula de solução ou decídua parietal + solução separação celular) para um tubo C. </li><li> Colocar o tubo C no Dissociator automática e executar o programa correspondente. NOTA: O programa para a decídua basal é executado por 17 segundos com 668 no total tiros por prazo. O programa para os parietalis decídua é executado por 37 segundos com 235 no total tiros por prazo. Estes programas foram personalizados para isolar leucócitos dos decídua basal ou os parietalis decídua com bom rendimento e viabilidade celular. </li><li> Após a desagregação mecânica dos tecidos, digerir os tecidos com uma solução de separação celular comercialmente disponível, como Accutase; (Um cocktail que contém enzimas proteolíticas e colagenolíticas) durante 45 min a 37 ° C com agitação suave. </li></ol> 3. Isolamento de Leucócitos <ol><li> Após a incubação, adicionar 10 ml de PBS 1x ao Digestion mistura e passá-lo através de um filtro de células 100 mm em um tubo de plástico de 50 ml. Dependendo da viscosidade da mistura de digestão, pode-se precisar de utilizar vários filtros de células para uma mistura. </li><li> Encher o tubo com 1x PBS e centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Remover o PBS 1x acima dos sedimentos celulares cuidadosamente e re-suspender as pelotas com 5 ml de tampão de FACS gelada. NOTA: Para estudar os polimorfonucleares e mononucleares leucócitos juntos, vá para o Passo 6.1; para estudar os leucócitos mononucleares, continue com a Etapa 3.3. </li><li> Adicionar 5 ml de 20% de meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para um tubo de 15 ml de plástico e sobrepor-se lentamente a suspensão de células no topo do meio de gradiente de densidade. Enquanto estratificação da amostra, é importante não misturar a mídia gradiente de densidade com a suspensão de células. </li><li> Centrifugar com um rotor basculante para fora a 500 xg durante 30 min a 4 ° C sem o travão. É muito importante para desativar o freio para evitar misturar as células e lOsing o gradiente. Os leucócitos podem ser encontrados na interface entre o meio de gradiente de densidade e o tampão de SCAF. </li><li> Retirar a camada superior que contém o tampão e detritos de células FACS muito cuidadosamente utilizando uma pipeta. A banda na interface contém as células deciduais mononucleares e uma porção dos leucócitos polimorfonucleares. </li><li> Transferir as células na interface completamente para um novo tubo de plástico de 15 ml. Adicionar, pelo menos, três vezes mais o volume de tampão de FACS. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 5 minutos para peletizar as células. Aspirar o sobrenadante e lava-se as células com tampão de SCAF. Peletizar as células com uma outra centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. NOTA: Para realizar a cultura de células, consulte Passo 4. Para executar separação de células, consulte Passo 5. Para realizar a imunofenotipagem, consulte a Etapa 6. </li></ol> 4. Aplicações - cultura celular <ol><li> Re-suspender as células do Passo 3,7 em 1 ml de meio de cultura RPMI 1640. Contar as células viáveis ​​using contador automático de células ou um hemocitômetro e uma solução de azul de trypan 0,4%. </li><li> Adicionar-se a quantidade de meio de cultura RPMI para fazer uma concentração de células de 1 x 10 6 células / ml. As células estão agora prontos para a cultura. </li></ol> 5. Aplicações - Isolamento de macrófagos para a Cultura celular primária <ol><li> Para isolar CD14 + células, magneticamente marcar as células do passo 3.7 com microesferas de CD14 (20 ul por esferas 10 7 células), incubar durante 15 minutos a 4 C, e CD14 + células separado a partir de outros tipos de células através da aplicação de um campo magnético. Após 2 lavagens com tampão de MACS e remoção do campo magnético, eluir as células CD14 + magneticamente retidos com tampão MACS. </li><li> A seguir à centrifugação, re-suspender as pelotas celulares em meio de cultura RPMI 1640. As células estão prontas para o chapeamento (Figura 2). </li></ol> 6. Aplicações - imunofenotipagem <ol><li> Para usar as células para immunophenotyping, re-suspender as células do Passo 3,7 em 1 ml de 1x PBS. Contar as células viáveis ​​utilizando um contador de células automático ou um hemocitómetro e uma solução de azul de tripano a 0,4%. </li><li> Rotular as células com um corante de viabilidade fixável (Figura 3). Lavar as células duas vezes com tampão FACS e suspender novamente as células em tampão de coloração. Incubar com um bloqueador de FcR durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar anticorpos conjugados com fluorocromos extracelulares. Por exemplo, neste protocolo, usar anti-CD3, anticorpos anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15 e anti-CD56 (Tabela 1). Incubar durante 30 min a 4 ° C, no escuro. </li><li> Após duas lavagens com 1x PBS, as células serão analisados ​​em 500 ul de tampão de coloração utilizando um citómetro de fluxo. Uma representação da estratégia de propagação usados ​​para analisar as subpopulações de leucócitos foram encontrados nos tecidos deciduais é mostrado na Figura 4. </li></ol>

Os autores não divulgam conflitos de interesse.

Caracterização das propriedades funcionais e fenotípicas de leucócitos de infiltração na interface materno-fetal humana é essencial para a compreensão dos mecanismos imunes que levam a desordens gravidez. Diversas técnicas têm sido descritas, a fim de isolar leucócitos da interface materno-fetal humano durante a gravidez 10,14,25,28,37,42,43. No entanto, cada uma destas técnicas é distinto, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos diferentes de dissociação, não especifica quantidade...

A gravidez é caracterizada por três fases distintas: 1 imunológicos) implantação e placentação precoce associada com uma resposta pro-inflamatória (isto é, o implante se assemelha a um &quot;ferida aberta&quot;); 2) o segundo trimestre da gravidez, a maior parte do terceiro trimestre de gravidez quando homeostase imune é alcançada através de um estado predominantemente anti-inflamatório na interface materno-fetal; e 3) o parto, um estado pró-inflamatório 1-7. Células do sistema imunológico desempenha um papel importante na regulação da resposta inflamatória na interface materno-fetal, onde sua abundância e mudança de localização durante toda a gravidez 6-9. Nos seres humanos, a interface materno-fetal representa uma área de contacto directo entre materna (decídua) e fetal (cório ou trofoblasto) tecidos. Esta interface inclui: 1) a decídua parietal que reveste a cavidade uterina não coberta pela placenta e está em justaposiçãopara o córion liso; e 2) os decídua basal, localizados na placa basal da placenta, onde é invadido por trofoblastos intersticiais 10 (Figura 1). A intimidade dessas áreas de contato cria condições para a exposição antigênica fetal à 11-13 sistema imunológico materno. Não surpreendentemente, leucócitos compreender até 30-40% das células deciduais 8,9,14,15 além de células do tipo do estroma e as células glandulares típicos 8,14,16. O papel dos leucócitos na interface materno-fetal engloba vários processos que incluem a limitação da invasão do trofoblasto 17, remodelação das artérias em espiral 18,19, manutenção da tolerância materna 12,20, eo início do trabalho de parto 21-26. Leucócitos de ambos os membros adaptativa e inata do sistema imune, isto é, células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, células NK, e foram identificados em tecidos deciduais, e suasproporções e estado de activação ter sido demonstrado que variam espacialmente e temporalmente ao longo da gestação 6-10,12,14,24,27-30. Perturbações na população e / ou função de leucócitos estão associados com aborto espontâneo 31, pré-eclâmpsia 32, restrição de crescimento intrauterino 32,33, e trabalho de parto prematuro 7,24. Por conseguinte, o estudo das suas características fenotípicas e funcionalidade de leucócitos na interface materno-fetal humano facilitará a elucidação das vias desreguladas em perturbações imunológicas gravidez. Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para determinar o fenótipo e as propriedades funcionais de leucócitos é a citometria de fluxo, a tecnologia que permite a análise quantitativa de vários parâmetros simultaneamente 34-36. Para análise de leucócitos por citometria de fluxo, é necessário o isolamento de leucócitos de uma suspensão de célula única. Por conseguinte, um método para separar Leu infiltrantekocytes a partir da interface materno-fetal é necessária para estudar a sua fenotípica e propriedades funcionais. Vários métodos têm sido descritos para isolar leucócitos a partir da interface materno-fetal humano 10,14,25,27,37-39. Enquanto alguns se aplicam desagregação mecânica 10,25,27,38, outros usam digestão enzimática 37,40 para a dissociação do tecido. Porque desagregação mecânica produz um rendimento mais baixo e reduziu a viabilidade 41, e dissociação enzimática pode afectar a viabilidade celular e a superfície de retenção do marcador 42, o método aqui descrito combina a dissociação mecânica suave com pré-tratamento enzimático para aumentar o rendimento de leucócitos isolados, sem comprometer a viabilidade celular. Uma combinação similar de métodos tem sido demonstrado ser eficaz no isolamento de leucócitos a partir de tecidos deciduais na interface materno-fetal 39. Portanto, o protocolo aqui descrito envolve a mechadesagregação nica com um Dissociator tecido automático que aumenta a consistência, poupando tempo e trabalho quando comparado ao picar tradicional com bisturis, lâminas de barbear opostas, ou tesoura cirúrgica 10,28. O enzima escolhido para a dissociação de tecidos foi Accutase. Ao contrário de colagenase comumente usados ​​43, Dispase 44, e tripsina 45, Accutase (uma solução de desprendimento de células) combina proteolítica geral e as actividades que contribuem para colagenolíticas eficiente dissociação ainda suave 46,47. Depois de dissociação, os leucócitos são enriquecidos da população total das células deciduais por centrifugação em gradiente de densidade. Vários meios de gradiente de densidade foram anteriormente utilizados, o mais comum dos quais são de Percoll (uma suspensão de partículas de sílica coloidal) e Ficoll a 48 (um polímero de sacarose com um peso molecular elevado sintético) 49. A maior eficácia de isolamento por o polímero de sacarose foi previously mostrado 50, e o protocolo descrito aqui ainda prova que esta mídia gradiente de densidade produz uma pureza suficientemente elevada de leucócitos mononucleares. Assim, o protocolo aqui descrito combina a desagregação mecânica do tecido com um tecido Dissociator automática, a digestão enzimática com uma solução de separação celular, e separação de leucócitos com um meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para isolar leucócitos de tecidos deciduais humanas. Este protocolo foi comprovada para preservar os antigénios da superfície das células, juntamente com a viabilidade celular. Os leucócitos isolados podem ser usados ​​em várias aplicações que incluem a imunofenotipagem com a citometria de fluxo e estudos funcionais in vitro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissection</td></tr><tr><td>Ferramentas de dissecação estéreis: tesouras cirúrgicas, pinças e pinças de ponta fina&nbsp;</td><td>Qualquer fornecedor</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Grandes e pequenas placas de Petri</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dissociação</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(solução de desprendimento celular)</td></tr><tr><td>Tubos cônicos estéreis de 2 ml com trava segura</td><td>Qualquer </td><td></td><td></td>fornecedor</tr><tr><td>de tubos de centrífuga cônicos de 50 ml</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtros de células m</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 ml</td><td>Pipetas</td> de transferência de qualquer fornecedor <td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos</td> C de <td>qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>RPMI culture medium 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS e 1% P/S)</td></tr><tr><td>Corrediças de câmara de plástico</td><td>Incubadora</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Classe 100</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Microscópio</td><td>Nexelcom Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Separação de células</td></tr><tr><td>MS colunas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separador de células</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtros de pré-separação</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de trava segura de 15 ml</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão MACS&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,5% de albumina de soro bovino, 2 mM EDTA e 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>FcR Blocking</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>Anti-anticorpos anti-antígeno de superfície celular humana&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Tabela 1)</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD corante de viabilidade</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix buffer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>buffer FACS&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0,1% BSA, 0,05% Azida de Sódio, e 1X PBS, pH=7,4)</td></tr><tr><td>Tampão de coloração&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>solução Trypan Blue 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Mídia de gradiente de densidade de 20% (1.077 + 0.001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Instrumentos Adicionais</td></tr><tr><td>Incubadora com agitador</td><td>Citômetro</td> de fluxo <td>Thermo Scientific MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrífuga BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Sistema de vácuo <td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissociador automático de tecidos&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS Dissociator</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de leucócitos do human interface materno-fetal

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

A gravidez é caracterizada pela infiltração de leucócitos nos tecidos reprodutivos e na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal). Essa interface é o sítio anatômico de contato entre mãe e tecidos fetais; por conseguinte, é um local de acção imunológica durante a gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal de desempenhar um papel central na implantação, manutenção da gravidez, e tempo de entrega. Portanto, caracterizações fenotípicas e funcionais desses leucócitos irá fornecer insights sobre os mecanismos que levam a distúrbios de gravidez. Vários protocolos têm sido descritos, a fim de isolar a partir de leucócitos de infiltração a decídua basal e parietal decidua; no entanto, a falta de coerência nos reagentes, enzimas, e os tempos de incubação torna difícil comparar estes resultados. Descreve-se aqui uma nova abordagem que combina a utilização de Diss mecânicas e enzimáticas suavesociation técnicas para preservar a viabilidade e a integridade dos marcadores extracelulares e intracelulares em leucócitos isolados a partir dos tecidos humanos na interface materno-fetal. Além de imunofenotipagem, cultura de células, e separação de células, as futuras aplicações deste protocolo são numerosos e variados. Seguindo este protocolo, os leucócitos isolados podem ser usados ​​para determinar a metilação do ADN, expressão de genes alvo, em termos de funcionalidade in vitro de leucócitos (isto é, a fagocitose, a citotoxicidade, proliferação de células T, e plasticidade, etc), e a produção de espécies reactivas de oxigénio na interface materno-fetal. Além disso, utilizando o protocolo descrito, este laboratório tem sido capaz de descrever novos e raros leucócitos na interface materno-fetal.

. A dissecção de tecidos humanos na interface materno-fetal (decídua basal e decídua parietal) é mostrado na Figura 1 Este procedimento inclui a dissecção da placa basal, que inclui os decídua basal (Figura 1A - D). A decídua basal é obtido pela remoção da vilosidade placentário (lado fetal) a partir da placa basal (Figura 1C). A parietal decidua é recolhido por raspagem suave da membrana coriónica (Figura 1E - F). A Figura 2</s...

Descrito aqui é um protocolo para isolar e estudar mais detalhadamente os leucócitos infiltrantes da decídua basal e decídua parietalis - a interface materno-fetal humana. Este protocolo mantém a integridade dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, conforme comprovado pela análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar leucócitos do endométrio humano, baus e endométrio paral. Isso é realizado primeiramente dissecando os tecidos endometriais humanos da placenta. Em seguida, o tecido decidual é dissociado por meio de desagregação mecânica e digestão enzimática.Em seguida, a suspensão celular é filtrada utilizando uma peneira celular de 100 micrômetros, lavada com um XPBS e centrifugada a 300 ×g durante cinco minutos a quatro graus Celsius para obter um pellet celular. Por fim, a suspensão celular é aplicada sobre a solução de gradiente de densidade e centrifugada, coletando-se a interface contendo os leucócitos. Em última análise, os leucócitos isolados podem ser utilizados para imunofenotipagem, cultura celular e estudos funcionais.A vantagem cerebral desta técnica ou de métodos existentes, como dissociação mecânica ou digestão enzimática, é que ela combina a desagregação mecânica do tecido com um associador automático de tecidos e digestão temática com Accutase e isolamento de leucócitos utilizando um gradiente de densidade. Este protocolo demonstrou preservar antígenos de superfície celular com viabilidade celular, e suas implicações estendem-se para a compreensão das propriedades funcionais e fenotípicas dos leucócitos infiltrantes na interface materno-fetal, relacionadas à patogênese de complicações pré-natais. A coleta e utilização de amostras humanas para fins de pesquisa foram aprovadas pelos comitês de ética em pesquisa da Eunice Kennedy Shriver, Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano, Institutos Nacionais de Saúde, Departamento de Saúde e Serviços Humanos e da Universidade Wayne State.Obteve-se o consentimento informado por escrito de todas as mulheres grávidas antes da coleta das amostras de tecido. Para começar, o pesquisador dissecará um fragmento da placa basal a partir de uma das bordas do placentário. Coloque-o sobre uma tábua de corte estéril com o vli placentário, que apresentará coloração vermelho-sangue e aparência pilosa, voltado para cima.A placa basal é lisa e de cor vermelho-pálida, mantendo o tecido imerso em XPBS. Use tesoura e pinça de ponta fina e afiada para remover o tecido viloso e os vasos sanguíneos. Colete duas a três porções e use PBS para lavá-las completamente, removendo o sangue. Para isolar o parênquima decidual, dissecar um quadrado de 10 centímetros por 10 centímetros.Coloque-o sobre a placa com o córion, que contém coágulos sanguíneos e geralmente apresenta coloração amarelo-claro, voltado para cima. Em seguida, utilize pinças de ponta fina para remover o maior número possível de coágulos sanguíneos. Depois, com PBS estéril, lave a membrana até que o PBS saia límpido.Usando uma espátula descartável estéril e aplicando PBS sobre a membrana, desprenda suavemente a camada decidual. Colete os tecidos deciduais e coloque-os em um tubo plástico de 50 mililitros com PBS estéril para desagregar mecanicamente a decidua Bali ou a deci paral. Comece usando PBS 1X estéril para lavar o tecido em um tubo de 50 mililitros.Em seguida, centrifugue o tecido a 300 G e temperatura ambiente por cinco minutos. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Em seguida, após ressuspender o tecido e a solução de destacamento de acordo com o protocolo descrito no texto, transfira os tecidos homogeneizados para um tubo C.Coloque o tubo no dissociador automático e execute o programa correspondente após a dissociação com uma solução comercialmente disponível para destacamento celular, como a Accutase, nos tecidos. Incube a 37 graus Celsius com agitação suave por 45 minutos para realizar a digestão. Após a incubação, adicione 10 mililitros de PBS à mistura de digestão e passe-a através de um filtro celular de 100 micrômetros para um tubo de 50 mililitros. Dependendo da aderência, podem ser necessários vários filtros para filtrar uma única digestão.Utilize PBS para preencher o tubo e centrifugue a 300 G e temperatura ambiente por cinco minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante S e utilize cinco mililitros de tampão fax gelado para ressuspender o pellet celular. Para estudar leucócitos mononucleares, adicione cinco mililitros de meio de gradiente de densidade a 20% a um tubo plástico de 15 mililitros.Em seguida, sobreponha lentamente a suspensão celular por cima, tomando cuidado para não permitir que as camadas se misturem, em uma centrífuga com rotor de balanço a 500 G, a quatro graus Celsius e sem freio por 30 minutos; os leucócitos serão encontrados na interface entre o meio de gradiente de densidade e o tampão fax. A seguir, pipete cuidadosamente a camada superior que contém o tampão fax e os detritos celulares. A interface contém as células mononucleares residuais e uma parcela dos leucócitos polimorfonucleares.Transfira esta camada para um novo tubo de 15 mililitros. Adicione pelo menos três volumes de tampão fax ao tubo, em seguida, centrifugue a 300 ×g por cinco minutos. Para pelotizar as células, aspire o sobrenadante S e lave as células com tampão fax uma segunda vez antes de realizar o cultivo celular.Classificação e imunofenotipagem de acordo com o protocolo descrito, esta figura mostra a morfologia de macrófagos isolados coletados do decídua parias em uma gestação a termo utilizando separação magnética de células. Os macrófagos isolados mantêm a capacidade de liberar citocinas após três dias de cultivo. O rendimento de células viáveis isoladas do decídua, baus e decídua paral foi determinado após separação por gradiente de densidade.Utilizando um marcador fixável de viabilidade como mostrado aqui, foi superior a 90% para cada população de células decíduas. É apresentada aqui a estratégia de seleção para análise de leucócitos polimorfonucleares e mononucleares dentro do gate visível, incluindo linfócitos T, neutrófilos, macrófagos, células NK, células T NK e células B. Na gestação a termo, esta figura mostra neutrófilos, macrófagos, linfócitos T e células B provenientes de células residuais isoladas de uma gestação a termo.Por fim, as células NK, NKT e T provenientes das células residuais isoladas de uma gestação a termo são representadas neste conjunto de gráficos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de limpar bem o tecido, para evitar contaminação sanguínea, e manter o tecido e a coquetel enzimático sob observação durante todo o procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

Aqui descrevemos um protocolo para o isolamento de subconjuntos de precursor células B do sangue do cordão umbilical. A quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das células e usadas em ensaios subsequentes utilizando DNA ou RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Descrito aqui é um protocolo para isolar e analisar os leucócitos infiltrantes de tecidos na interface materno-fetal (útero, decídua e placenta) de camundongos. Este protocolo mantém a integridade da maioria dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, incluindo análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Descreve-se aqui métodos para a dissecação de tecidos fetais e maternas de placenta humana, seguido por isolamento e expansão de células estaminais mesenquimais / estroma (MSC) a partir desses tecidos.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Um método simples para estabelecer placentária primária humana (vilosidades) e culturas de órgãos deciduais é descrito. culturas de órgãos vilosidades e deciduais são ferramentas inestimáveis ​​para estudar patogenia na interface materno-fetal humano. A infecção com a bactéria intracelular Listeria monocytogenes facultativos é demonstrada.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Esse protocolo permite a purificação, caracterização e cultivo de trofoblastos extravilosos primários HLA-G+ (EVT) a partir da decídua basal e da membrana coriônica das placentas humanas a termo. Culturas primárias de EVT mantêm a viabilidade por 96 horas, permitindo co-cultura com células imunes maternas comparadas por amostra e subsequente análise citométrica e molecular de fluxo de suas interações.

Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G+ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

Aprenda a isolar leucócitos da decídua humana para estudos de imunologia na interface materno-fetal. Este método preserva marcadores de superfície celular e viabilidade para aplicações subsequentes.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

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