Name: Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda a isolar leucócitos de tecidos murinos na interface materno-fetal usando digestão enzimática e gradiente de soro fetal. Este método preserva marcadores de superfície para análise por citometria de fluxo.

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NGL foi apoiado pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) para sua leitura crítica do manuscrito.

Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética animal deve ser dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local e os institucionais Review Boards. Ao trabalhar com sangue animal, células ou agentes perigosos, como mencionado neste protocolo, as ações de biossegurança e segurança laboratoriais adequadas devem ser seguidas. 1. Rato Manuseio e Recolha de Tecidos <ol><li> Prepara-se uma estação de trabalho estéreis e obter ferramentas estéreis para a recolha de tecido. Essas ferramentas incluem tesouras grandes e pequenas cirúrgicas, fórceps, e pinças de ponta fina. Incluem pequenas placas de Petri marcadas com os nomes apropriados de tecidos, cheio com solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS) (3-5 ml) equilibrada à temperatura ambiente (20-22 ° C). Também incluem uma grande placa de Petri, não marcado, encheu-se com solução de PBS 1x (10 - 15 mL). </li><li> Eutanásia um ratinho grávida (10,5-19,0 ​​dias pós-coitum (DPC) ou antes da entrega) utilizando dióxido de carbono (CO 2). Para garantir que o rato é sacrificado, use a técnica de deslocamento cervical. Nota: Antes de 10,5 dpc, é difícil separar manualmente os tecidos deciduais dos tecidos uterinos. Se o isolamento de leucócitos deciduais não é necessária, a partir de leucócitos nos tecidos uterinos dos ratos não grávidas ou aqueles de ratinhos a &lt;10,5 dpc pode também ser realizada seguindo este protocolo. </li><li> Utilizando um par de tesouras cirúrgicas esterilizadas, remover completamente a porção abdominal inferior da pele e do tecido muscular. Com uma pinça, afastar todos os outros órgãos até o útero e os ovários são visíveis. Com o útero ainda ligado, utilizar a pinça para se mover para fora da cavidade peritoneal (Figura 1A). </li><li> Localize os ovários distais à junção oviduto e uterotubal de cada corno uterino. Usando as pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na junção uterotubal e separar os cornos uterinos do mesentério contendo os vasos uterinos; então,consumos específicos no colo do útero para separar os cornos uterinos da cavidade peritoneal (Figura 1B). </li><li> Com pequenas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão entre o colo do útero e o segmento inferior dos cornos uterinos. Deixar ligada uma porção do colo do útero durante este processo (Figura 1C) para evitar a abertura do corno uterino. </li><li> Mergulhar os cornos uterinos (incluindo colo do útero) num grande prato de Petri cheio com solução de PBS 1x (10 - 15 ml) para hidratar os locais de implantação. </li><li> Enquanto ainda imersos em solução de PBS 1x, aparar qualquer gordura dos cornos uterinos com as pequenas tesouras cirúrgicas. Manter os tecidos imersos em solução de PBS 1x toda a dissecção. </li><li> Segurando os cornos uterinos no lugar com a pinça, retire um dos locais de implantação do útero com um corte transversal através da região inter-implantação, utilizando as pequenas tesouras cirúrgicas (Figura 1D). O local da implantação contém o feto, rodeado pelamembrana corioalantï¿½ca, e uterina, decidual, e os tecidos placentários. </li><li> Usando fórceps, segure o local no lugar e fazer uma pequena incisão na parede uterina adjacente à placenta e tecidos deciduais (Figura 1E). Guarnição em torno do perímetro da placenta / decídua até que estas se separar tanto a parede uterina e da membrana corioalantóica que inclui o feto (Figura 1F). </li><li> Remover a placenta e tecidos deciduais ligados e coloque em solução PBS 1x (3-5 ml; veja o passo 1.12). </li><li> Inserir o feto rodeado pela membrana corioalantóica ligado aos tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL). A hidratação destes tecidos vai facilitar a separação da membrana corioalantóica da parede uterina (ver passo 1.14). </li><li> Usando um par de pinças de ponta fina, delicadamente descascar o tecido decidual (camada branca-acinzentada) a partir da superfície placentária. Execute estapasso com cuidado para manter a integridade da placenta e tecidos deciduais (Figura 1G). </li><li> Coloque a placenta e tecidos deciduais em duas placas de Petri marcadas separadamente cheios com uma solução de PBS 1x (3-5 mL de cada). </li><li> Remova cuidadosamente a parede uterina da membrana corioalantï¿½ca com uma pinça de ponta fina. Estes são os tecidos uterinos. </li><li> Colocar os tecidos uterinos em uma placa de Petri com solução de PBS 1x (3-5 mL). </li><li> Repita os passos 1.8 a 1.15 até que todos os locais de implantação foram processadas. </li><li> Recolha diversos uterino, decidual, e tecidos da placenta para melhorar o rendimento das células durante a digestão enzimática. A quantidade de tecidos depende do tamanho da ninhada; no entanto, o isolamento de leucócitos requer&gt; 2 peças de tecido. Nota: Para informações mais detalhadas sobre a dissecação dos locais de implantação em diferentes dias gestacionais, visualizar as imagens encontradas no capítulo dois do Guia para investigatiem 42 de rato Gravidez. </li></ol> 2. uterina, Decidual, e Placentário dissociação Tissue <ol><li> Rotular vários estéreis 2 ml tubos cónicos com o nome do tecido adequado, e colocar num frasco com 1000 ml de solução enzimática em gelo. </li><li> A partir da placa de Petri com solução de PBS 1x, transferem dois pedaços (100-150 mg) de uterina, decidual, ou tecidos da placenta para um tubo de 2 ml rotulados cónica. </li><li> Adicione 500 ml de solução enzimática frio em cada 2 ml tubo cônico. </li><li> Com uma tesoura fina estéreis, começam a dissociar o tecido imerso na solução enzimática até que seja finamente picados. Ao longo do tempo, a suspensão irá desenvolver uma aparência leitosa. Este passo não deve ser superior a mais de 2 minutos para evitar o excesso de manipulação da amostra. </li><li> Uma vez que o tecido foi dissociado, adicionar um extra de 500 mL de solução enzimática frio para a 2 ml tubo cônico. </li><li> Colocar o tubo cónico de 2 ml em gelo. </li><li> Repita os passos 2.2 a 2.6 com todos os tecidos até que todos os tecidos foram processados. </li><li> Transferir todos os 2 ml de tubos cónicos com tecido homogeneizado (tecido moído + solução enzimática) amostras do gelo em uma incubadora a 37 ° C e realizar uma agitao orbital suave (80 rpm). Incubar durante 30 - 35 min. Certifique-se de que a temperatura da incubadora é estabilizado antes do início do tempo de incubação. </li><li> Após a incubação, remove os 2 ml de tubos cónicos com tecidos dissociada da incubadora e colocá-los em gelo para evitar mais digestão. </li><li> Rotular estéreis de 50 ml tubos cônicos de acordo com o tipo de tecido. Retire as tampas e substituí-los com um filtro de células estéril (100 tamanho de poro). </li><li> Pour os tecidos dissociados do 2 ml de tubos cónicos de células através do filtro, utilizando ~ 20 ml de solução de PBS 1x. Os fragmentos de tecido permanece no filtro de células e a suspensão de células passarão através dela. </li><li> Lava-se a ditecidos ssociated no filtro celular de 2 - 3 vezes com 20 ml de solução de 1x PBS utilizando uma pipeta de transferência. </li><li> Lave os vazios 2 ml tubos cônicos com solução PBS 1x (1 ml) e despeje o conteúdo através dos filtros celulares. </li><li> Retire os filtros celulares de 50 ml tubos cônicos e substituir as tampas. Centrifugar os tubos a 1250 xg durante 10 minutos a 4 ºC. </li><li> Cuidadosamente, aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. O sedimento celular contém os leucócitos e células do estroma isoladas. </li><li> Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de meio de cultura RPMI sem soro fetal bovino (FBS). Misture delicadamente. Não use vortex. </li><li> Adicionar 500 uL de SBF puro para um tubo de poliestireno de 5 ml de plástico e sobrepor-se lentamente a suspensão de células. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 1100 xg, sem o travão à TA para sedimentar as células viáveis ​​quando os restos celulares são retidos na interface PBS / FBS. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem tocar no sedimento celular. O cell pastilha contém principalmente células viáveis. </li><li> Opcionalmente: Para concentrar as células mononucleares, usar uma solução de polissacárido saturada de 20%, como descrito abaixo. <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 1000 uL de meio de cultura RPMI sem FBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de polissacárido saturada de 20% para um tubo de plástico de poliestireno de 5 ml e sobrepor-se lentamente a suspensão de células no topo desta solução, de acordo com as instruções do fabricante. Enquanto a disposição em camadas da amostra, evitar a mistura da solução de polissacárido saturada de 20% com a suspensão de células. </li><li> Centrifugar com um rotor basculante para fora a 500 xg durante 30 min à TA sem travão. É muito importante para desativar o freio para evitar misturar as células e perder o gradiente. As células mononucleares podem ser encontrados na interface entre a solução de polissacárido saturada a 20% e a solução de PBS 1x. </li><li> Aspirar e desprezar o sobrenadante. O sedimento de células contém principalmente células mononucleares. Nãote: Para realizar a coloração de viabilidade e coloração intracelular, consulte a etapa 3. Para realizar a imunofenotipagem, consulte a etapa 4. Para realizar a coloração de viabilidade e coloração extracelular somente, veja o passo 5. Para executar uma cultura de células de leucócitos isolados, consulte o passo 6. Para executar separação de células magnéticas, consulte a etapa 7. </li></ol></li></ol> 3. a coloração de viabilidade para Células fixável <ol><li> Ressuspender o sedimento de células em 1,100 ml de solução de PBS 1x. Misturar suavemente usando uma micro-pipeta. </li><li> Transferir 100 ul da suspensão de células para um tubo de plástico de 5 ml de poliestireno. Adicionar 400 ul da solução 1x PBS para o tubo de polistireno de 5 ml. Este tubo é um controlo de tecido auto-fluorescência. Armazenar a 4 ° C até o passo 3.5. </li><li> Transferir os restantes 1.000 ul da suspensão de células para um novo tubo de 5 ml de poliestireno plástico. Adicionar 1 mL do corante de viabilidade e homogeneizar suavemente. Incubar durante 30 minutos no escuro a 4 ºC. </li><li> Após a incubação, adicionar 1000 &amp; #181; l de solução de PBS 1x. Misture delicadamente com a mão. </li><li> Centrifugar ambos os tubos de poliestireno de 5 ml de plástico (as etapas 3.2 e 3.3) a 1250 xg durante 10 min a 4 ºC. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Nota: O sedimento de células (passo 3.3) vai ser usado no passo 4. O sedimento de células (passo 3.2) vai servir como um controlo para o tecido auto-fluorescência. </li></ol> 4. A imunofenotipagem <ol><li> Ressuspender o sedimento celular em 50 ul de anti-ratinho de CD16 / CD32 (diluído 1: 100 em tampão de SCAF [BSA a 0,1%, azida de sódio a 0,05%, solução de 1X PBS, pH 7,4]). Misturar suavemente a suspensão de células. Não use o vórtice. </li><li> Incubar a suspensão de células no tubo de polistireno de 5 ml no escuro a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Após a incubação, adicionar 50 ul de cada anticorpo monoclonal anti-leucócito reagir com os marcadores de superfície celular ou extracelular anticorpo de controlo de isotipo coincidente (diluições de anticorpos deve ser validado). Por exemplo, para analisar as sub-populações de leucócitos, usar anti-Moutilizar os anticorpos que reagem com os seguintes marcadores de superfície de células de leucócitos: CD45, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, CD8 e (Tabela 1). </li><li> Uma vez que os anticorpos contra marcadores extracelulares foram adicionados a 5 mL do tubo de poliestireno de plástico, mistura suavemente. Incubar no escuro durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Durante esta incubação, preparar e pré-aquecer a solução de tampão de fixação (diluída com água desionizada, 1: 5) a 37 ° C, se necessário. Mantenha o tampão a 37 ºC no escuro até que seu uso é necessário. </li><li> Após 30 min de incubação, adicionar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo plástico de poliestireno e misturar suavemente. Este passo é necessário para lavar as células e remover qualquer excesso de anticorpo não ligado. </li><li> Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Nota: Se a coloração intracelular não é necessário, ver passo 5. Se a coloração intracelular é necessário, efectuar a permeabilização e intracelularcoloração ular aqui, e então prosseguir com a fixação (passo 4.8). </li><li> Adicionar 500 ul da solução tampão de fixação pré-aquecido ao sedimento de células e incuba-se no escuro durante 10 min a 37 ºC. </li><li> Dispensar 500 ul de tampão de FACS na 5 ml tubo de poliestireno plástico. Misture delicadamente. </li><li> Centrifugar as amostras a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de FACS para cada amostra. Estas amostras podem agora ser analisadas por citometria de fluxo. Adquirir as amostras imediatamente para obter melhores resultados. </li></ol> 5. a coloração de viabilidade de células unfixable <ol><li> Depois de imunofenotipagem extracelular, ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de FACS. </li><li> Adicionar 1 ml de 4 &#39;, dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, a 200 ng / ml) imediatamente antes de adquirir a amostra. </li><li> Visualizar as amostras dentro de 1-2 minutos após a adição de DAPI utilizando um citómetro de fluxo. </li></ol><ol><li> Prepare uma estação de trabalho sob uma coifa estéril. Pré-aquecer o meio de cultura RPMI a 37 ° C usando um banho de água. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1000 ul de tampão de FACS para contagem das células. </li><li> Contar o número de células viáveis ​​utilizando um contador de células automático ou hemocitómetro e solução de azul de tripano a 0,4%, seguindo as instruções do fabricante. Grave a contagem total de células vivas. </li><li> Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min para remover o tampão de SCAF. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de meio de cultura RPMI pré-aquecido por pipetagem suave de 2 a 3 vezes. </li><li> Placa o número desejado de células em um filtro estéril placa de 24 poços e incuba-se a 37 ° C. O tempo de incubação será determinada pela questão de pesquisa. </li></ol> 7. Magnetic Seleção celular <ol><li> Configurar uma estação de trabalho limpo, com os seguintes materiais: Colunas MS, separadores de células magnética, 15tubos cónicos de 30 ml uM filtros de pré-separação, e um multi-suporte. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão de MACS (0,5% de BSA, EDTA 2 mM, solução de 1x PBS, pH 7,2). </li><li> Usando um contador de células automático ou hemocitï¿½etro e 0,4% de solução de azul de tripano, contar e registrar a contagem total de células vivas. </li><li> Centrifugar as células a 1250 xg, a 4 ° C durante 10 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante. Adicionar mais 500 ul de tampão MACS. </li><li> Avance para realizar a separação magnética seguindo as recomendações do fabricante. </li><li> Determinar a pureza por citometria de fluxo ou microscopia. </li></ol>

Os autores revelam que não há conflitos de interesse.

A coleta de dados consistentes que registra as características fenotípicas e abundância de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial para a compreensão da patogênese das complicações relacionadas com a gravidez. Foram descritas várias técnicas que facilitam o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal durante a gravidez 31,38,39,43-46. No entanto, cada técnica é diferente, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos d...

Tolerância imunológica em gestação é um período em que ocorrem alterações distintas dentro do sistema imunológico da mãe. Estas mudanças permitem que a mãe de tolerar o feto, um enxerto alogênico semi-1. O feto expressa complexo principal de histocompatibilidade paterna (MHC) 2, e as células fetais têm sido encontrados na circulação materna 3; Contudo, o feto não seja rejeitada 4,5. Este enigma não é totalmente compreendido. A hipótese mais recente indica que a tolerância materno-fetal é criado durante o coito e fecundação 6,7 e mantido para manter uma gravidez completa 8-10. A repartição deste tolerância materno-fetal é considerado um mecanismo de doença durante os estágios precoces e tardios da gravidez 10-16. Tolerância materno-fetal envolve a participação de várias sub-populações de leucócitos, incluindo células T (células T reguladoras, células Th1, as células Th2 e células Th17), macrophages, neutrófilos, células mastro, células NK e células NKT, células dendríticas e células B, que a mudança em densidade e localização ao longo da gravidez 15,17-19. Tolerância materno-fetal é enriquecido na interface materno-fetal 20 - o local anatómico em que o sistema imune da mãe interage com os antigénios fetais 20,21. A interface materno-fetal é criado durante a placentação quando as células dos trofoblastos fetais extravilosas invadir a mucosa uterina 22-24. No lado fetal desta interface, as membranas que envolvem o feto criar uma superfície epitelial especializado dentro da placenta, e as células de trofoblasto controlar a troca de nutrientes através do seu contacto directo com o sangue materno 22. No lado materno da interface, a decídua recruta uma piscina heterogénea de leucócitos nos ratinhos que respondem por 30% a 50% de todas as células deciduais. Além de sua participação na Materntolerância imunológica al, estas células são principais contribuintes para diferentes processos durante a gravidez, por exemplo., a proteção do trato reprodutivo de infecções, fecundação, implantação do embrião 7,25, angiogênese decidual 26, remodelação vascular 24,27, a invasão do trofoblasto 28, placentária desenvolvimento 24,25, e, em última análise, o trabalho de parto 15,17. Por conseguinte, o estudo dos leucócitos envolvidas na tolerância materno-fetal é essencial para a elucidação da patogénese de complicações relacionadas com a gravidez. Embora a utilização de imuno-histoquímica e imunofluorescência gerou dados para a visualização directa e localização de uterina, decidual, ou leucócitos da placenta 29,30, análise de citometria de fluxo revelou mais subconjuntos específicos de leucócitos em cada um destes tecidos 31,32. Além disso, citometria de fluxo foi utilizada para determinar a densidade e a proporção de maternal-fetal interface de leucócitos 33 e expressão níveis de proteínas extracelulares e intracelulares 8-10,34. Análise citométrica de fluxo de leucócitos na interface materno-fetal requer uma suspensão de célula única. A fim de isolar leucócitos infiltrantes do decidual, útero, placenta e tecidos, dois métodos de dissociação de tecidos têm sido usados: mecânica e enzimática. Os dois métodos permitem a separação de leucócitos infiltrados a partir da matriz extracelular (ECM) desses tecidos. Dissociação enzimática tecido é superior à dissociação mecânica do tecido, uma vez que permite uma maior produção de leucócitos associada com danos-cisalhamento-força inferior a 35. Consequentemente, a dissociação do tecido mecânico exige a agregação tecidos 36, que podem aumentar a variabilidade ea heterogeneidade das amostras. No entanto, a dissociação mecânica pode ser a escolha quando o antigénio de interesse pode ser alterada por dissociação enzimática ou quando a funcionalidade da célulaS de interesse devem ser preservados (por exemplo., a citotoxicidade de células NK) 35. O uso da proteólise com enzimas específicas para degradar a ECM elimina os rendimentos baixos observados com dissociação mecânica. Vários estudos têm relatado o uso de tripsina 32, colagenase 37, DNase 31, Dispase 38, e cocktails comerciais de várias enzimas 32,39. No entanto, a natureza e concentração de enzimas diferentes e a duração da digestão deve ser cuidadosamente definida e validada, a fim de garantir a manutenção da integridade dos epitopos antigénicos de superfície celular necessárias para a imunofenotipagem. As várias estruturas de superfície são diferencialmente sensíveis à destruição por enzimas diferentes, com algumas enzimas, como a tripsina, sendo notório para a decapagem de epitopos de superfície de leucócitos reconhecidos por muitos anticorpos monoclonais. Aqui introduzido é um método que utiliza um proteolytic e coquetel enzimático colagenolítica, chamado Accutase. Esta solução enzimática é suficientemente suave enquanto ainda eficaz na distinção entre tecidos murinos na interface materno-fetal, e não requer a adição de outros reagentes ou soro de dissociação para terminar a reacção de dissociação. Além disso, ela está pronta para uso imediato e, embora o tempo de dissociação deve ser validado, é mais robusta do que as enzimas acima mencionadas 40,41. A utilização de uma combinação de ambos os tipos de desagregação do tecido melhora a qualidade e quantidade de células obtidas; assim, vários estudos têm implementado o uso combinado de dissociação mecânica e enzimática com resultados satisfatórios 31,32,37. O protocolo aqui descrito foi estabelecido e validado no nosso laboratório; utiliza uma combinação de uma dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta. Este protocolo permite o estudo de isolamento e mais deos leucócitos que se infiltram nos tecidos murinos na interface materno-fetal (útero, decidua, e placenta). O protocolo seguinte também mantém a integridade dos marcadores da superfície das células e rendimentos de células viáveis ​​suficientes para aplicações a jusante, como demonstrado por análise de citometria de fluxo. Finalmente, este protocolo mantém a consistência da preparação de células para análise e comparação dos diferentes tecidos de murino que compõem a interface materno-fetal.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Magentic Cell Separation</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m filtros de pré-separação</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Preparação laboratorial</td> <td>(0,5% de albumina de soro bovino, 2mM EDTA e 1x PBS, pH 7,2)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Solução enzimática Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos extracelulares anti-camundongo</td><td>BD Bioscences / eBiosciences</td><td></td> <td> Tabela 1 </td></tr> <tr><td>Azida de sódio</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CORANTE DE VIABILIDADE VIVO/MORTO Life</td><td>Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão de fixação</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>Preparação laboratorial</td><td>0,1% BSA, 0,05% azida sódica, 1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Solução azul de tripano 0,4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instrumentos Adicionais</td></tr><tr><td>Incubadora com agitador</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td><td></td><td></td> de vácuo <td>construído em laboratório</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubadora 3307</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>51221035 de precisão</td> Contador <td>de</td><td></td></tr><tr><td>células</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Contador</td><td></td>de células automatizado</tr><tr><td>Microscópios ópticos e de fluorescência</td><td>Zeiss e Olympus</td><td>Zeiss LSM780 e Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Tolerância imunológica durante a gravidez requer que o sistema imunológico da mãe sofre alterações distintas, a fim de aceitar e nutrir o feto em desenvolvimento. Essa tolerância é iniciada durante o coito, estabelecida durante a fecundação e implantação, e mantida durante toda a gravidez. Mediadores celulares e moleculares activas de tolerância materno-fetal são enriquecidas no local de contacto entre os tecidos fetal e materno, conhecida como a interface materno-fetal, o que inclui a placenta e o útero e tecidos deciduais. Esta interface é composto de células do estroma e os leucócitos que se infiltram, e as suas características fenotípicas e abundância alterar no decorrer da gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal incluem neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células mastro, células T, células B, células NK, células NKT e que em conjunto, criam o micro-ambiente local que sustenta a gravidez. Um desequilíbrio entre essas células ou qualquer inappropriate alteração nos seus fenótipos é considerado um mecanismo de doença na gravidez. Portanto, o estudo de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial, a fim de elucidar os mecanismos imunológicos que levam a complicações relacionadas com a gravidez. Descreve-se aqui um protocolo que utiliza uma combinação de dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta com um cocktail enzimática proteolítica e colagenolítica para isolar os leucócitos que se infiltram nos tecidos de murino na interface materno-fetal. Este protocolo permite o isolamento de um elevado número de leucócitos viáveis ​​(&gt; 70%) com propriedades antigénicas e funcionais suficientemente conservadas. Os leucócitos isolados podem então ser analisados ​​por várias técnicas, incluindo imunofenotipagem, separação de células, imagiologia, immunoblotting, a expressão do mRNA, cultura de células, e em ensaios funcionais in vitro tais como reacções de leucócitos mistos, proliferação ou ensaios de citotoxicidade.

A dissecação de tecidos de murino a partir da interface materno-fetal é mostrado na Figura 1; este procedimento inclui a abertura da cavidade peritoneal (Figura 1A, B), cornos uterinos (Figura 1C), incluindo os locais de implantação (Figura 1D), e a recolha dos tecidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), e tecidos deciduais (Figura 1G) em 16,5 dpc. A Figura 2 mostra a morfologia...

Descrito aqui é um protocolo para isolar e analisar os leucócitos infiltrantes de tecidos na interface materno-fetal (útero, decídua e placenta) de camundongos. Este protocolo mantém a integridade da maioria dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, incluindo análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar os leucócitos infiltrantes da interface materno-fetal murina. Isso é realizado primeiramente colhendo o útero, a placenta e a Eua. Os tecidos são dissociados por meio de dissociação mecânica em uma solução enzimática, seguida por uma digestão enzimática subsequente.A suspensão celular resultante é então filtrada e lavada, momento em que as células imunes de interesse são separadas de detritos celulares, como células não viáveis, por meio de um gradiente de soro bovino fetal. Em última análise, os leucócitos isolados podem ser utilizados para imunofenotipagem, cultura celular ou separação celular. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando estávamos tentando estabelecer um protocolo para o isolamento de leucócitos da interface materno-fetal, e percebemos que os métodos publicados não facilitavam o isolamento das células imunes raras que são de interesse para nós.Uma demonstração. O procedimento será realizado por Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez, que são pesquisadores associados do meu laboratório. Para coletar os tecidos da interface materno-fetal, comece utilizando um par de tesouras cirúrgicas estéreis para remover completamente a porção abdominal inferior da pele e do tecido muscular. Em seguida, use uma pinça para afastar todos os outros órgãos até que o útero e os ovários fiquem visíveis. Depois, mova o útero para fora da cavidade peritoneal.Localize os ovários na porção distal da TCU e na junção uterotubária de cada cornetto uterino. Em seguida, faça uma incisão na junção uterotubária para separar os cornetos do mesentério que contém os vasos uterinos. Ressecione ao nível do colo do útero para destacar os cornetos uterinos da cavidade peritoneal.Em seguida, use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão entre o colo do útero e o segmento inferior dos cornos, deixando uma porção do colo do útero aderida para evitar a abertura do corno uterino. Mergulhe os cornos e o colo do útero em uma placa de Petri grande contendo de 10 a 15 mililitros de PBS para hidratar os sítios de implantação. Remova qualquer gordura dos tecidos.Em seguida, mantenha os cornos no lugar com a pinça. Faça um corte transversal através de uma região inter-implantação para remover um dos sítios de implantação do útero. Agora, segure o sítio no lugar e faça uma pequena incisão na parede uterina adjacente aos tecidos placentários e residuais.Recorte ao redor do perímetro da placenta e da decídua até que os tecidos se separem tanto da parede uterina quanto da membrana corioamniótica. Em seguida, transfira a placenta e os tecidos deciduais anexos para uma nova placa de Petri contendo três a cinco mililitros de PBS. Transfira o feto para outra placa de Petri com PBS e use pinças de ponta fina para remover suavemente o tecido decidual acinzentado da superfície placentária.Tendo o cuidado de manter a integridade dos tecidos placentário e ECI. Divida os tecidos da placenta e do ECI em dois recipientes de Petri individualmente rotulados, contendo PBS. Em seguida, use pinças de ponta fina para remover suavemente a parede uterina da membrana coriônica e coloque esses tecidos uterinos em um novo recipiente de Petri contendo PBS para dissociar mecanicamente os tecidos.Em seguida, transfira dois discos uterinos e tecidos placentários de 100 a 150 miligramas para tubos cónicos de dois mililitros individualmente rotulados. Adicione 500 microlitros da solução enzimática fria um a cada tubo. Em seguida, use tesouras estéreis para dissociar mecanicamente cada um dos tecidos por não mais de dois minutos, até obter as suspensões.Desenvolva uma aparência leitosa. Adicione mais 500 microlitros de solução enzimática fria, um para cada tubo, e coloque os tubos sobre gelo. Em seguida, incube todos os tecidos a 37 graus Celsius com agitação orbital suave a 80 rpm, colocando os tubos sobre gelo após 30 a 35 minutos para interromper a digestão.Agora, filtre cada suspensão tecidual através de um filtro de 100 mícrons para tubos cónicos de 50 mililitros individualmente rotulados e lave cada tubo de 2 mililitros e filtro duas a três vezes com 20 mililitros de PBS para coletar todas as células. Quando todas as células tiverem sido filtradas, centrifugue-as e aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar os pellets. Re-suspenda suavemente os leucócitos e células estromais isolados em 1 mililitro de meio de cultura RPMI, sem vortex.Em seguida, para cada tecido, adicione 500 microlitros de soro bovino fetal em um tubo de poliestireno de cinco mililitros e sobreponha lentamente a suspensão celular sobre o soro. Por fim, quando todas as células tiverem sido sobrepostas, centrifugue as células sem frear e aspire o sobrenadante sem tocar os pellets celulares. Nestas imagens, a morfologia de macrófagos positivos para F four 80 isolados de tecidos decíduos e uterinos.Em 16,5 dias pós-acasalamento, são mostradas células provenientes de tecidos da interface materna e fetal. Apresentam uma viabilidade superior a 70% após isolamento por este método e contêm populações de neutrófilos, macrófagos, células T, células NK e células dendríticas, com uma alta proporção de macrófagos que coexpressam subpopulações de leucócitos CD11c isoladas de tecidos na interface materno-fetal. Também incluem células B e células T positivas para CD4, células T positivas para CD8, e células T positivas para CD3, negativas para CD4 e negativas para CD8, que também são isoladas, conforme observado neste gráfico de densidade.Ok, ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter os tecidos e o coquetel enzimático em gelo, ajustar a temperatura correta no incubador e não manipular excessivamente os tecidos durante a digestão após este procedimento. Outros métodos, como imunofenotipagem, cultura celular, separação celular e isolamento de D-N-A-R-N-A, podem ser realizados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar os leucócitos infiltrantes na interface materno-fetal, o útero e a placenta.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método rápido para a obtenção de leucócitos infiltrando a partir do cérebro de camundongos é descrito. Este método utiliza um gradiente de Percoll contínua e descontínua gradiente de Ficoll para selecionar e purificar a camada de leucócitos enriquecido. Leucócitos isolados podem então ser caracterizada por medidas de citometria de fluxo.

Isolamento de Brain-infiltrando Leucócitos

Neste protocolo, descreve-se a dissecção de placenta de rato sobre a gravidez d10.5, seguido de isolamento das células trofoblásticas, utilizando um gradiente de Percoll. Em seguida, demonstrar o uso de células isoladas, num ensaio de invasão de Matrigel.

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

Uma maneira eficiente de isolar linfócitos a partir do tracto genital rato é descrito. Este método tira vantagem da digestão enzimática e separação por gradiente de Percoll para permitir o isolamento eficaz. Esta técnica é também adaptável para utilização em espécies de...

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de leucócitos hepáticos marginais do fígado de camundongo por perfusão forçada.

Isolamento de leucócitos hepáticos marginais de fígado de camundongo

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Descrito aqui é um protocolo para isolar e estudar mais detalhadamente os leucócitos infiltrantes da decídua basal e decídua parietalis - a interface materno-fetal humana. Este protocolo mantém a integridade dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, conforme comprovado pela análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Este protocolo demonstra um método para o isolamento de células de decidual humanas primários coletados de membranas fetais de placentas de termo que podem ser usadas para uma variedade de aplicações (ou seja, imunocitoquímica, citometria de fluxo, etc.) com o objetivo para estudar o papel das populações de células diferentes em complicações na gravidez.

Isolamento de células humanas primárias do Decidual de membranas fetais de termo placentas

Este é um método para isolar células linfoides uterinas de camundongos grávidas e não grávidas. Este método pode ser usado para múltiplas aplicações a jusante, como fenotipagem FACS, classificação celular, ensaios funcionais, RNA-seq e proteômica. O protocolo aqui demonstra como fenótipo grupo 1 células linfoides inatas uterinas por citometria de fluxo.

Isolamento de células linfoides inatas uterinas para análise por citometria de fluxo

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Aprenda a isolar leucócitos de tecidos murinos na interface materno-fetal usando digestão enzimática e gradiente de soro fetal. Este método preserva marcadores de superfície para análise por citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

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