Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal

O objetivo geral deste procedimento é isolar os leucócitos infiltrantes da interface materno-fetal murina. Isso é feito colhendo primeiro o útero, a placenta e os eua. Os tecidos são decompostos por dissociação mecânica em uma solução enzimática, seguida por uma digestão enzimática subsequente.

A suspensão celular resultante é então filtrada e lavada, momento em que as células imunes de interesse são separadas dos detritos celulares, como células não viáveis, por um gradiente de soro fetal bovino. Em última análise, os leucócitos isolados podem ser usados para cultura de células de imunofenotipagem ou classificação de células. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos tentando estabelecer um protocolo para isolar leucócitos da interface materno-fetal e percebemos que os métodos publicados não facilitavam o isolamento das raras células imunes que nos interessam.

Uma demonstração O procedimento será realizado por Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez, que são pesquisadores associados do meu laboratório Para coletar os tecidos da interface materno-fetal, comece usando uma tesoura cirúrgica estéril para remover completamente a porção abdominal inferior da pele e o tecido muscular. Em seguida, use uma pinça para afastar todos os outros órgãos até que o útero e os ovários estejam visíveis. Em seguida, mova o útero para fora da cavidade peritoneal.

Localize os ovários distais ao UCT e a junção tubária uteriana de cada corno uterino. Em seguida, faça uma incisão na junção tubária do útero para separar os chifres da membrana que contém os vasos uterinos. Extirpar o colo do útero para separar os cornos uterinos da cavidade peritoneal.

Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão entre o colo do útero e o segmento inferior dos chifres, deixando uma parte do colo do útero presa para evitar a abertura do corno uterino. Mergulhe os chifres e o colo do útero em uma grande placa de Petri cheia de 10 a 15 mililitros de PBS para hidratar os locais de implantação. Corte qualquer gordura dos tecidos.

Em seguida, segurando os chifres no lugar com a pinça. Faça um corte transversal através de uma região interimplantada para remover um dos locais de implantação do útero. Agora segure o local no lugar e faça uma pequena incisão na parede uterina adjacente à placenta e aos tecidos residuais.

Apare ao redor do perímetro da placenta e da decídua até que os tecidos se separem da parede uterina e da membrana coriotóica. Em seguida, transfira a placenta e os tecidos deciduais anexados para uma placa de Petri fresca contendo três a cinco mililitros de PBS. Transfira o feto para outra placa de Petri com PBS e use uma pinça de ponta fina para descascar suavemente o tecido deci cinza branco da superfície placentária.

Tomando cuidado para manter a integridade dos tecidos placentário e ECI. Divida a placenta e os tecidos ECI em duas placas de Petri rotuladas individualmente preenchidas com PBS. Em seguida, use a pinça de ponta fina para remover suavemente a parede uterina da membrana cória Allen toic e coloque esses tecidos uterinos em uma nova placa de Petri cheia de PBS para dissociar mecanicamente os tecidos.

Em seguida, transfira dois 100 a 150 miligramas dos discos uterinos e tecidos placentários e dois tubos cônicos de mililitros rotulados individualmente. Adicione 500 microlitros de solução enzimática fria um a cada tubo. Em seguida, use uma tesoura estéril para dissociar mecanicamente cada um dos tecidos por não mais do que dois minutos até as suspensões.

Desenvolva uma aparência leitosa. Adicione mais 500 microlitros de solução enzimática fria, um para cada tubo, e coloque os tubos no gelo. Em seguida, incube todos os tecidos a 37 graus Celsius com uma agitação orbital suave a 80 RPM, colocando os tubos no gelo após 30 a 35 minutos para interromper a digestão.

Agora coe cada pasta de tecido através de um filtro de 100 mícrons em tubos cônicos de 50 mililitros rotulados individualmente e lave cada tubo de dois mililitros e coador duas a três vezes com 20 mililitros de PBS para coletar todas as células. Quando todas as células tiverem sido filtradas, gire-as para baixo e aspire cuidadosamente o SUP natin sem perturbar os pellets. Suspender suavemente os leucócitos isolados e as células estromais em um mililitro de cultura RPMI, meio sem vórtice.

Em seguida, para cada tecido, adicione 500 microlitros de soro fetal bovino em um tubo de poliestireno de cinco mililitros e cubra lentamente a suspensão celular no soro. Finalmente, quando todas as células tiverem sido sobrepostas, centrifugue as células sem interrupção e aspire o supinado sem tocar nos grânulos celulares. Nessas imagens, a morfologia de F quatro 80 macrófagos positivos isolados de tecidos decididos e uterinos.

Aos 16,5 dias após o coum, são mostradas células dos tecidos de interface materna e fetal. Exibem uma viabilidade de mais de 70% após o isolamento por este método e contêm populações de macrófagos neutrófilos, células T, células NK e células dendríticas com uma alta proporção de macrófagos que expressam subpopulações de leucócitos CD 11 C isoladas de tecidos no espelho e na interface fetal materna. Também incluem células B e CD: quatro células T positivas, CD oito células T positivas e CD três células T positivas

Ok, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter os tecidos e o coquetel enzimático no gelo para definir a temperatura correta na incubadora e não manipular demais seus tecidos durante a digestão após este procedimento. Outros métodos como imunofenotipagem, cultura de células, classificação de células e isolamento D-N-A-R-N-A podem ser realizados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar os leucócitos infiltrantes na interface materno-fetal, no útero, na placenta.