Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens e sondar as propriedades físicas das membranas separadoras de fase usando microscopia de força atômica. Isso é obtido misturando primeiro dilio, fosfatidilcolina, fgo, mielina e colesterol em uma proporção de dois para dois para um para formar uma mistura lipídica separadora de fases. Em seguida, as bicamadas lipídicas suportadas são preparadas depositando a suspensão de lipossomas em uma superfície MICA usando microscopia de força atômica.

A superfície da bicamada é então escaneada, produzindo uma imagem topográfica onde características estruturais como altura podem ser medidas. Em seguida, a espectroscopia de força é realizada em áreas específicas da bicamada para sondar as propriedades físicas da bicamada, principalmente a força de ruptura e a espessura da membrana. Em última análise, os resultados mostram diferenças nas propriedades entre diferentes fases lipídicas com base em imagens FM e curvas de força.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia de fluorescência, é o aumento da resolução e das propriedades adicionais que um FM pode sondar na amostra. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biofísica, como a estrutura das membranas biológicas e proteínas embutidas nessas membranas. Além disso, também podemos observar as propriedades físicas da membrana e monitorar como mudanças na composição ou adicionais de agentes ativos da membrana podem alterar essas propriedades.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à natureza frágil da amostra. Isso tem implicações na preparação da amostra, na escolha do manuseio de cantilevers e nas condições de imagem e espectroscopia FM Comece dissolvendo DOPC, spino, mielina e colesterol em clorofórmio nas concentrações desejadas. Em seguida, combine 18,38 microlitros de DOPC, 17,1 microlitros de mielina e 11,3 microlitros de colesterol para fazer uma solução com um miligrama de lipídios totais e uma proporção molar de dois para dois, para um, respectivamente.

Misture uma solução por vórtice, seque a mistura usando um gás inerte como nitrogênio e, em seguida, seque-a novamente sob vácuo por pelo menos uma hora. Em seguida, dissolva os lipídios secos em 100 microlitros de PBS a uma concentração de 10 miligramas por mililitro. Vortex para misturar vigorosamente por cerca de um minuto.

Para obter uma suspensão turva contendo vesículas multilaminares. Certifique-se de que não ficam películas lipídicas presas aos lados do frasco para injetáveis. Pegue 10 microlitros da suspensão lipídica multilaminar e adicione 150 microlitros de tampão de bicamada lipídica suportado.

Em seguida, misture uma solução e transfira-a para um pequeno frasco de vidro com tampa de dois mililitros e sele-o com sonicato de filme para. A mistura à temperatura ambiente em banho sonicado durante 10 minutos. Durante esse tempo, a solução deve se tornar clara e produzirá pequenas uni ou vesículas com um diâmetro de aproximadamente 50 nanômetros.

Lave as lamínulas de vidro em água seguida de etanol e deixe-as secar ao ar. Em seguida, pegue os discos de Micah e retire a camada externa com fita adesiva. Prenda o disco MICA a uma lamínula usando uma gota de cola transparente opticamente transparente.

Em seguida, conecte os cilindros de plástico ao MICA usando graxa a vácuo e certifique-se de que não haja vazamentos. Pique toda a solução de lipossomas diretamente na mica e adicione mais 140 microlitros de tampão de bicamada lipídica suportado para atingir um volume de 300 microlitros. Em seguida, adicione 0,9 microlitros de uma solução molar de cloreto de cálcio para atingir uma concentração final de três milimolares de cálcio, incube as amostras por dois minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, por pelo menos 10 minutos a 65 graus Celsius durante esta etapa, também pré-aqueça o tampão de bicamada lipídica suportado a 65 graus Celsius.

Adicione tampão, se necessário, para garantir que a amostra não seque. Cobrir a câmara de amostra com uma lamínula também manterá a amostra hidratada. Em seguida, enxágue a amostra suavemente com o lipídio suportado pré-aquecido por tampão de camada 10 a 15 vezes para remover o cálcio e as vesículas não fundidas.

Tome cuidado extra durante as etapas de lavagem para evitar que a bicamada seque seguindo as etapas de lavagem. Resfrie as bicamadas suportadas à temperatura ambiente. Antes das medições no microscópio de força atômica, configure o microscópio de força atômica ou um FM para realizar imagens das bicamadas lipídicas em uma solução.

Usando o modo de contato de acordo com as especificações do fabricante, adicione tampão à amostra para mantê-la imersa em tampão durante todo o experimento. Monte o sample no estágio A FM e certifique-se de que todos os módulos de isolamento de vibração estejam ligados. Aguarde pelo menos 15 minutos para que o sistema se equilibre e reduza o desvio térmico.

Em seguida, aproxime-se da amostra no modo de contato com uma ponta cantilever FM macia até que o contato seja feito. Como as bicamadas são muito frágeis, minimize o ponto de ajuste da ponta A FM durante a aquisição de imagens em modo de contato para manter a força no mínimo e corrigir o desvio térmico enquanto mantém contato com a amostra. Quando a imagem estiver concluída, processe as imagens ajustando cada linha de varredura às funções de nivelamento polinomial.

Execute a remoção da linha para varreduras que perdem contato com a membrana. Usando o software proprietário da empresa fabricante A FM, calibre o cantilever seguindo o protocolo do fabricante para determinar a conversão correta do sinal elétrico em uma medição de força. Depois de obter imagens de uma área da bicamada, selecione uma região de cinco mícrons por cinco mícrons na bicamada para realizar a espectroscopia de força.

Configure os AFMs que ele leva curvas de força em uma grade de 16 por 16 dessa região, resultando em 256 curvas de força por região. Em seguida, configure o deslocamento do piso Z para 400 nanômetros. Isso determina a amplitude máxima de movimento do z piezo e garante que o cantilever tenha se retraído totalmente da amostra entre as medições.

Em seguida, defina a velocidade de aproximação para 800 nanômetros por segundo e a velocidade de retração para 200 nanômetros por segundo. Defina também a força alvo máxima para cada curva de força, neste caso, 12 nano Newton. Depois de configurar todos os parâmetros, adquira curvas de força pressionando o botão de execução do software A FM.

Adquira pelo menos 500 curvas de força para cada condição para garantir boas estatísticas, trace um histograma dos valores e, em seguida, ajuste os histogramas a uma distribuição gaussiana para obter o pico e a largura da distribuição. Devido à composição lipídica usando este estudo, duas regiões principais da membrana são formadas. Existe uma região líquida ordenada que é composta de fing, mielina e colesterol, e uma região líquida desordenada que é composta principalmente de DOPC.

O perfil de altura da imagem A FM pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da membrana, observando o perfil de altura. A espessura da bicamada pode ser medida utilizando a presença de defeitos na membrana. O mapa de altura também pode ser usado para medir a diferença de altura entre as fases ordenada e desordenada.

As curvas de força derivadas do modo de espectroscopia de força são usadas para medir a força de ruptura vining o valor da força no pico da curva de força, conforme mostrado aqui. Além disso, a espessura da membrana pode ser derivada subtraindo o valor da distância do pico da curva de força para o valor da distância. Quando a curva de força começa a subir novamente, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a solução de estratificação B e monitorar a montagem FM constantemente para corrigir os efeitos do desvio térmico e do acúmulo de D na ponta Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como microscopia de fluorescência confocal, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como dinâmica da membrana. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar o suporte por camadas e usar um FM para criar imagens e investigar as propriedades físicas dessas bicamadas.