Name: Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a preparar bicamadas lipídicas suportadas e caracterizar suas propriedades físicas usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força. Este método permite investigar estrutura, espessura e propriedades mecânicas de membranas biológicas.

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Este trabalho foi financiado pela Max Planck Society, o alemão Cancer Research Center, da Universidade de Tübingen, eo Bundesministerium für Bildung und Forschung (conceder nenhum. 0.312.040). Agradecemos Eduard Hermann por nos ajudar a automatizar a análise dos dados curva de força e Dr. Jakob Suckale para a leitura cuidadosa deste manuscrito.

1. Preparação de Bicamadas Lipídicas suportados (SLB) 11,12,21 <ol><li> Preparação de mistura de lípidos e de Vesículas multilamelares Suspensões <ol><li> Preparar os seguintes tampões de antemão. <ol><li> Preparar tampão PBS a concentrações de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM de KH 2 PO 4, 8 mM de Na 2 HPO 4, e 137 mM de NaCl, pH 7,2. </li><li> Prepare SLB (suportado bicamada lipídica) em concentrações de tampão de 150 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, pH 7,4. </li><li> Prepara-se uma solução de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Dissolve-se os seguintes lípidos em clorofórmio a uma concentração desejada: por exemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / mL e colesterol (Chol) a 10 mg / ml. </li><li> Aqui 18,38 ul de DOPC, 17,10 mL de SM e 11,30 mL de Chol para fazer uma solução com 1 mg de lipidos totais na proporção de 2: 2: 1 de DOPC: razão molar Chol: SM. Variar os volumes em conformidade com base no concentrations dos lipídios preparadas em 1.1.2. No entanto, manter a proporção molar de 2: 2: 1 de DOPC: SM: Chol, como alterar a relação molar irá alterar as características de fase da membrana 25. </li><li> Misture a solução completamente por agitação em vórtex. Adicionar um corante fluorescente lipídica a 0,05% molar, se alguém deseja visualizar a bicamada por um microscópio de fluorescência. Nota: A família de dialkylcarbocyanines de cadeia longa, como o fez, DII e DiO abrangem uma ampla gama de comprimentos de onda e pode ser preferencialmente utilizadas para etiquetar membranas lipídicas. Alternativamente, lípidos marcados com fluorescência, assim como a rodamina-fosfatidiletanolamina ou BODIPY-colesterol pode ser utilizado. Em qualquer caso, a concentração do corante deve ser optimizado de acordo com a configuração de microscopia, mantendo em mente que as altas concentrações do fluoróforo ligado ao lípido pode alterar o comportamento de lípido 19. </li><li> Seque o clorofórmio utilizando gás N2 (ou qualquer gás inerte disponíveis, tais como Ar e He). </li><li> Além disso seco tele lípido mistura sob vácuo durante pelo menos 1 h. Nota: Se armazenar esta mistura de lípidos, purgar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. Alíquota excesso de lípidos-em-clorofórmio em pequenos frascos castanhos. Secá-las de uma maneira semelhante como a mistura de lípidos, deslocar o ar com o gás inerte (N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. </li><li> Dissolve-se os lípidos secos em tampão PBS até uma concentração de 10 mg / ml. </li><li> Vortex-se a mistura vigorosamente durante cerca de 20 segundos a 1 min para obter uma suspensão turva, contendo vesículas multilamelares. Certifique-se de que não há a filmes lipídicos adira às paredes do frasco. </li><li> Distribuir esta suspensão em alíquotas de 10 ul (1 mg de lípido torna alíquotas de 10). </li><li> Armazenar a -20 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Preparação de Vesículas Unilamelares Nota: Os vários tamanhos de vesículas unilamelares podem ser preparadas utilizando o método de sonicação ou o método de extrusão. Sonication usa sound energia para agitar a mistura e separar as camadas da suspensão multilamelar. Isto é indicado por limpar da suspensão turva. Extrusão obriga as vesículas multilamelares de passar através de um filtro de membrana com um tamanho de poro definido. <ol><li> Método de sonicação <ol><li> Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB. </li><li> Transferir a mistura em pequenos (2 ml) frascos de vidro tapados e selar com Parafilm. </li><li> Sonicar a mistura à temperatura ambiente num banho de ultra-sons durante 10 min ou até se tornar clara, para se obter pequenas vesículas unilamelares (SUVs, abaixo de 50 nm de diâmetro). </li></ol></li><li> Método de extrusão <ol><li> Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB. </li><li> Transferir a suspensão para um tubo criogénico. </li><li> Congelar a suspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico por alguns segundos em azoto líquido. </li><li> Descongele osuspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico num banho de água à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante alguns minutos. Repetir os passos de congelamento e descongelamento, pelo menos, 10 vezes. </li><li> A fim de extrusão da suspensão de lípido, utilizar uma membrana de policarbonato com 200 nm de tamanho de poro (outros tamanhos dos poros estão disponíveis como, 100 nm ou 400 nm) e um dispositivo de extrusão comercial 26. Nota: Actualmente, existem dois dispositivos de extrusão comercialmente disponíveis: um extrusor manual está disponível para pequenos volumes (200 uL para alguns mL). Neste caso, a amostra é submetida a extrusão através da membrana, empurrando manualmente a suspensão e para trás entre duas seringas. Dependendo do fabricante, alíquotas de lípidos teriam de ser combinadas para atingir o volume mínimo do conjunto acima. Para volumes maiores (até 50 ml) dispositivos mais sofisticados são utilizados em que a suspensão é forçada através da membrana de policarbonato utilizando gás comprimido. Condições de set-up e extrusão pode mudar de acordo com o model. Consulte as instruções do fabricante antes de usar. Este protocolo refere-se ao extrusor manual para pequenos volumes. </li><li> Equilibrar a extrusora em água por passagem da água através da extrusora. Imergir a membrana na água. </li><li> Colocar a membrana entre os dois pistões, montar o dispositivo e equilibrar em tampão, fazendo passar o tampão através da extrusora, a partir de uma seringa para a outra. Este passo permite adicionalmente ensaios de leakiness do sistema. Se ele vazamentos, desmontar e remontar-lo novamente alterando a membrana. </li><li> Tome a suspensão lipídica usando uma seringa da extrusora (&quot;lado sujo &#39;). </li><li> Introduzir a seringa que contém a suspensão de lípido em uma câmara e a seringa vazia na câmara oposta. </li><li> Empurre a seringa em uma extremidade. Filtrar a solução através da membrana e para dentro da seringa oposta. Este é o passo 1 r. </li><li> Passá-lo através da membrana para um total de 31 vezes taisque a solução acaba na seringa adversária (&#39;lado limpo&#39;). Nota: Verifique a membrana após a extrusão. Se ele foi quebrado, então o processo de extrusão não foi bem sucedida e necessita de ser repetida. </li><li> Esvaziar a seringa num pequeno tubo. As grandes vesículas unilamelares (LUV) são estáveis ​​durante 1-2 dias se mantida a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação de Mica e Lamelas <ol><li> Lavar lamelas primeiro em água e depois em etanol. Ar seco. </li><li> Tome discos de mica e descolar a camada exterior usando fita adesiva. </li><li> Coloque o disco de mica sobre a lamela. Colas ópticas transparentes são ideais para que se possa verificar as camadas duplas com um microscópio de fluorescência. </li><li> Anexar cilindros de plástico (2,5 cm de diâmetro externo, diâmetro interno 2 cm, e 0,5 cm de altura), utilizando óptica cola / graxa. Certifique-se de que tudo está selado e que não há fugas. Use graxa quando querendo voltar a utilizar os cilindros como eles podem ser facilmente retirado do the lamela e lavados. As dimensões dos cilindros de plástico depender do tamanho do suporte do braço de suporte de AFM e devem ser ajustados em conformidade. </li></ol></li><li> Deposição de Unilamelares vesículas em suporte sólido <ol><li> Pipetar toda a solução de lipossomas directamente sobre a mica. Adicionar mais tampão SLB para chegar a um volume de 300 ml. </li><li> Adicionar 0,9 ml de solução 1 M de cloreto de cálcio para alcançar uma concentração final de 3 mM de Ca 2+. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2 minutos e depois a 65 ° C durante pelo menos 10 min. Sempre cobrir as bicamadas com tampão. O contato com as bolhas de ar e ar irá destruí-lo. Durante a incubação, adicionar mais tampão, se necessário, especialmente se a incubação a temperaturas mais elevadas. Nota: As temperaturas de incubação variam de acordo com as misturas de lípidos e as fases necessárias. É necessário um período de incubação de pelo menos 10 minutos para formar bicamadas suportados, mas pode ser mais longo, dependendo da temperatura e composição. </li><li> Lavagema bicamada com quente (65 ° C) Tampão de SLB 15-20 vezes para remover o cálcio e vesículas não fundidas. Tome cuidado extra durante as etapas de lavagem para manter a bicamada sob tampão e pipeta suavemente a solução de lavagem para evitar a destruição da camada dupla. </li><li> Bilayers legal suportados à temperatura ambiente antes medições AFM. Isto é necessário para formar as diferentes fases da membrana, bem como minimizar o desvio térmico no instrumento. </li></ol></li></ol> 2. Microscopia de Força Atômica Medidas 11,12 <ol><li> Imagem Nota: Execute projeção de imagem atômica no modo de contato ou o modo de tocar. Imagem suportado bilayers em solução; Não deixe que a solução para evaporar completamente, pois isso irá destruir as camadas duplas. Como era de se estar trabalhando com tampão, observe as precauções de segurança para garantir que qualquer parte AFM está protegido contra derramamento de líquidos. <ol><li> Selecione um cantilever macio (abaixo de 0,2 N / m constante da mola é aconselhável) e montá-lo para tele AFM. A escolha da rigidez cantilever é mais crítico para a espectroscopia de força (e isso será discutido mais tarde). </li><li> Monte a amostra no palco AFM e certifique-se que todos os módulos vibração de isolamento estão ligados. Aguarde pelo menos 15 minutos para equilibrar e reduzir a dispersão térmica do sistema. Dependendo da AFM set-up, especificações de ajuste e de imagem podem variar. Consulte o manual do fabricante. </li><li> Aproxime-se da amostra com a ponta do AFM até que o contato. </li><li> Desde bicamadas lipídicas são geralmente 4 nm de altura, utilize o Z-gama do instrumento que lhe dará a mais alta resolução z (por exemplo, 1,5 mm). </li><li> Selecione uma região para a imagem. Para obter uma visão geral da bicamada lipídica, uma 50 mm x 50 mm ou 25 mm x 25 mm região será um bom ponto de partida para a imagem. Se aparecer pequenos recursos, imagem uma lata em áreas menores (10 mm x 10 mm, ou 2 mm x 2 mm). A escolha de uma área de imagem depende também da r trabalhandoange do scanner piezoeléctrico. Por favor, consultar o manual do instrumento para isso. </li><li> Como camadas duplas são muito frágeis, ajustar o ponto da ponta do AFM conjunto durante a imagem para manter a força no mínimo e corrigir deriva térmica, mantendo contato com a amostra. No modo de contato, minimizar o set point. No modo de tocar, maximizar o set point. </li><li> Processar imagens por encaixando cada linha de digitalização para funções polinomiais de nivelamento. Executa a remoção linha para verificações que perdem contato com a membrana usando o software proprietário da empresa de fabricação de AFM. </li></ol></li><li> Força Spectroscopy <ol><li> Calibrar o cantilever seguindo as instruções de acordo com o protocolo do fabricante. A calibragem permite a conversão do sinal eléctrico dos fotodiodos de força (Figura 1B). <ol><li> Calibrar a sensibilidade da ponta para medir a deflexão de movimento piezo-z (em unidades de comprimento) em vez do sinal eléctrico em volts. <br /&gt; Nota: AFM detecta mudanças na deformação do cantilever usando um laser reflectida na parte traseira do braço de suporte. O laser atinge um fotodíodo que pode detectar a posição espacial do ponto de laser. Uma mudança na deflexão do braço de suporte, uma vez que se dobra quando em contacto com a amostra é detectada por este fotodíodo como &quot;de deflexão vertical&quot;, e isto é nas unidades de tensão. Uma vez que o braço de suporte é movido pelo piezo-z, a deflexão vertical está relacionado com o movimento na z-piezo. A relação entre a deflexão vertical e z movimento é chamado de sensibilidade e converte a tensão de distância. </li><li> Calcula-se a constante de mola cantilever usando o método de frequência de ruído térmico, geralmente incorporados no software AFM. Neste método, traçar a amplitude de vibração de ruído em relação à frequência de oscilação, a criação de uma trama densidade espectral de potência. Este gráfico irá mostrar um pico em torno da freqüência de ressonância. A freqüência em que o i amplitudeé a maior é a freqüência de ressonância. Ajustar uma função Lorentzian em torno do pico para calcular automaticamente a constante de mola pelo software. Alguns recursos úteis para a teoria do método de ruído térmico são dadas nas referências 27-30. </li></ol></li><li> Depois de imagiologia uma área da bicamada, seleccionar uma região x 5 mm 5 mm na bicamada para realizar espectroscopia de força. </li><li> Configure o AFM para que ele leva curvas de força em uma grade de que a região de 16 x 16. Isso resulta em 256 curvas força por região. O espaço entre dois pontos vizinhos deve ser suficiente para evitar que a área de membrana sendo sondado por um ponto coincidiria com o próximo ponto. Isto é dependente do raio da ponta. Uma distância de 100 nm entre dois pontos seria ideal. Divide x 5 uM a região 5 um de 16 x 16 em grade. Dependendo do tamanho da fase, pode-se seleccionar uma região mais pequena ou maior, e, em seguida, ajustar o tamanho da grelha em conformidade. </li><li> Definir deslocamento z piezo-a400 nm. Isso determina o alcance máximo do movimento do z-piezo. Ele deve ser suficientemente grande para garantir que o braço de suporte está totalmente retraída a partir da amostra entre as medições. </li><li> Definir velocidade de aproximação de 800 nm / seg e retrair a velocidade para 200 nm / seg. Utilize uma velocidade de aproximação entre 400 a 6000 nm / seg dependendo da composição da bicamada lipídica e da fase a ser estudado 6,16. </li><li> Depois de configurar todos os parâmetros, adquirir curvas força, pressionando o botão &quot;run&quot; do software AFM. </li><li> Salvar curvas de força como força vs. curvas de altura (uma medida do movimento z-piezo). Isso não leva em conta a curvatura do cantilever quando em contacto com a amostra. Durante a etapa de processamento de dados, o software permite a correção da AFM para cantilever dobrar para obter força vs. curvas de separação ponta-amostra (Figura 1C), o que dará valores adequados para a espessura da camada dupla. Os valores de correcção são geralmente incorporados na calibradoção, que são guardadas com cada curva de força. Calcular separação ponta-amostra subtraindo a deflexão vertical do movimento piezo a um determinado ponto. Nota: O pico na curva da força de aproximação (o valor da força vai para baixo, mesmo se o movimento cantilever ainda está no ciclo de abordagem) é a força de ruptura da membrana, enquanto que a diferença entre a posição do pico e a posição do ponto em que a força começa a levantar-se de novo fornece a espessura da membrana. </li><li> Adquirir, pelo menos, 500 curvas de força para cada condição para obter boas estatísticas. Traçar um histograma dos valores usando programas como origem ou MatLab, e se encaixam os histogramas para uma distribuição de Gauss para obter o pico e largura da distribuição. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

SLBS compostos de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram formadas em mica após adsorção vesícula e ruptura induzida por cloreto de cálcio. Esta composição de lípido separado em L e L o d fases. A fase L o é enriquecida em esf ingomielina e colesterol e é menos fluido / mais viscoso (Figura 1A) do que a fase L d 11. A separação de fase a partir de L o G d manifesta como estruturas circulares elevados acima da circundante (Figura 1B, C).</s...

Microscopia de força atómica (AFM) gera uma imagem de uma superfície de varrimento através de uma área da amostra, utilizando um braço de suporte com uma ponta muito afiada 1. O movimento do braço de suporte investiga a topologia de superfície da amostra. AFM tem sido amplamente aplicado para moléculas biológicas - incluindo proteínas, DNA e membranas, devido à sua versatilidade na análise de amostras fixadas no ar ou estado quase nativo em líquido 2-5. Para além da sua capacidade de imagiologia de alta resolução em escala nanométrica, o cantilever AFM actua como uma mola para sondar forças de interacção (adesão e repulsão) e as propriedades mecânicas da amostra 5,6. Isto é conhecido como espectroscopia de força. Neste modo, a sonda se aproxima primeiro da amostra e exerce uma força sobre ele, em seguida, é retraído até que perde o contacto com a amostra (Figura 1A). As curvas geradas mostram força em função da distância do braço de suporte, tanto para a aplicaçãobarata e retração. Várias propriedades, incluindo o módulo de elasticidade para medir a rigidez de um material, e as forças de adesão pode ser derivada. Bicamadas lipídicas suportados são membranas biológicas modelo que encontram-se no topo de um suporte sólido - geralmente mica, vidro de borosilicato, de sílica fundida, ou oxidado silício 7. Elas são preparadas utilizando várias técnicas, como a deposição de vesículas, método Langmuir-Blodgett e spin-coating 8,9. Imagiologia AFM foi utilizado para seguir a formação destas camadas duplas suportados 10, e sondar diferentes estruturas formadas por membranas de diferentes composições 11-15. Execução de espectroscopia vigor em apoiadas resultados bicamadas em um pico na curva de abordagem. Este pico indica a força necessária para perfurar a camada dupla, e é chamada força de avanço. A espessura da bicamada pode também ser medido usando a curva de força 6. A força típica avanço de bilayersintervalo entre 1-50 nN 6. Estas propriedades dependem embalagem lípido (fase líquida ou gel) e da estrutura (comprimento da cadeia acilo e grau de insaturação) e alterado pelos agentes activos de membrana 16. A teoria por trás da ruptura foi explicada 17 e outros parâmetros experimentais, tais como maciez cantilever, raio de ponta e velocidade de aproximação também afetam a força de avanço 15,16,18. Espectroscopia de força foi usado para analisar as propriedades de diferentes fases lipídicas 11,19, dependente da composição alterações 12,20, bem como os efeitos de outras biomoléculas, tais como péptidos, sobre a estabilidade da membrana 21. A orientação plana de bicamadas suportados é vantajoso para a combinação de AFM com outros métodos tais como ressonância 22 e microscopia de fluorescência de plasma de superfície 11,19 para caracterizar melhor a estrutura e as propriedades das membranas. Este proto vídeo detalhadacol destina-se a preparar bicamadas lipídicas suportados usando deposição de vesículas e analisá-los com a AFM e espectroscopia de força. Enquanto vesículas de diferentes tamanhos podem ser utilizados para preparar bicamadas, este protocolo concentra-se em pequenos e grandes vesículas unilamelares. Bilayers suportados que separam em fase líquida ordenou (L o) e (L d) fases líquidas desordenados foram caracterizados 11,15. A membrana é composta de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM), e colesterol (Chol) a 2: 2: 1. Esta composição modelos as jangadas lipídicas, que são propostas para se comportar como plataformas importantes para o tráfico de proteína e de triagem, sinalização celular e outros processos celulares 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Vem como pó liofilizado em frascos selados. Dissolva todo o pó em clorofórmio ao abrir. Armazene extra como filmes lipídicos secos, sob atmosfera inerte, a -20&nbsp; &deg;C. Visite <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; ver = artigo & id=1679& Itemid=398">aqui</a> para obter mais informações sobre armazenamento e manuseio.</td></tr><tr><td>Esfinomielina (Cérebro, Suíno)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Vem como pó liofilizado em grandes recipientes de plástico selados. Dissolva uma espátula de pó em pó em clorofórmio ao abrir. Armazene extra como filmes lipídicos secos, sob atmosfera inerte, a -20&nbsp; &deg;C. Visite <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; ver = artigo & id=1679& Itemid=398">aqui</a> para obter mais informações sobre armazenamento e manuseio.</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Vem como pó liofilizado em grandes recipientes de plástico selados. Dissolva uma espátula de pó em pó em clorofórmio ao abrir. Armazene extra como filmes lipídicos secos, sob atmosfera inerte, a -20&nbsp; &deg;C. Visite <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; ver = artigo & id=1679& Itemid=398">aqui</a> para obter mais informações sobre armazenamento e manuseio.</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl), 99,8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265,1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4), >99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2), grau de biologia molecular</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, grau de biologia molecular</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro, 24&nbsp; x&nbsp; 60&nbsp; mm, 1&nbsp; mm de espessura</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de Punção e Matriz</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo Óptico</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Adesivo líquido que endurece quando curado sob luz UV de comprimento de onda longo.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica bloqueia</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>Estas são peças de mica com pelo menos 1 polegada quadrada de área e espessura variando de 0,006 polegadas a 0,016 polegadas. Eles são cortados em um tamanho específico pela empresa para envio. Pequenos discos de mica podem ser perfurados a partir dos blocos de mica usando o conjunto de punção e matriz.&nbsp; Sempre manuseie a mica com luvas ou pinças.</td></tr><tr><td>Equipamento de laboratório Broca de graxa</td><td>Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Lipossoma Extrusora</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>Como alternativa, também se pode consultar as ofertas da Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Fita Adesiva</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1 polegada)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>Sem aquecimento, Frequência: 35 kHz, Saída de Pico Ultrassônica: 160 W, Potência HF: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">Folha de dados</a>)</td></tr><tr><td>Balanço AFM Nitreto de Silício&nbsp;</td><td>Sondas Bruker AFM</td><td>DNP-10</td><td>Cada cantilever tem quatro pontas e seu raio de ponta nominal é de 20 nm (com máximo possível em 60&nbsp; nm). Com base nas especificações, usamos a ponta D com frequência de ressonância de 18 kHz e constante nominal da mola de 0,06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II montado em Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

projeção de imagem atômica e força espectroscopia de bicamadas lipídicas suportados

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

A microscopia de força atômica (AFM) é uma técnica de imagem versátil e de alta resolução que permite a visualização de membranas biológicas. Tem ampliação suficiente para examinar subestruturas de membrana e até moléculas individuais. O AFM pode atuar como uma sonda de força para medir interações e propriedades mecânicas das membranas. As bicamadas lipídicas suportadas são convencionalmente usadas como modelos de membrana em estudos de AFM. Neste protocolo, demonstramos como preparar bicamadas suportadas e caracterizar sua estrutura e propriedades mecânicas usando AFM. Isso inclui espessura de bicamada e força de ruptura. 
As informações fornecidas pela imagem latente do AFM e pela espectroscopia da força ajudam a definir propriedades mecânicas e químicas das membranas. Essas propriedades desempenham um papel importante nos processos celulares, como manter a hemostasia celular do estresse ambiental, reunir as proteínas da membrana e estabilizar os complexos de proteínas.

Bicamadas lipídicas constituídas suportados de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram fotografadas em AFM (Figura 2 CA). Devido à composição de lípido, foram observados SM / Chol-rico e L o DOPC-ricas fases G d. O perfil de altura a partir da imagem AFM pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da membrana. Ao olhar para o perfil de altura, a espessura da bicamada pode ser medido na presença de defeitos na membrana (Figura 2B), ou a diferença de altura entre ...

Descrevemos um protocolo para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e sua caracterização usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter imagens e investigar as propriedades físicas de membranas com separação de fases utilizando microscopia de força atômica. Isso é alcançado primeiramente pela mistura de dilio, fosfatidilcolina, fgo, mielina e colesterol numa proporção de dois para dois para um, formando uma mistura lipídica com separação de fases. Em seguida, as bicamadas lipídicas suportadas são preparadas depositando-se a suspensão de lipossomos sobre uma superfície de MICA utilizando microscopia de força atômica.A superfície da bicamada é então escaneada, produzindo uma imagem topográfica na qual características estruturais como altura podem ser medidas. Em seguida, a espectroscopia de força é realizada em áreas específicas da bicamada para investigar as propriedades físicas da mesma, notadamente a força de ruptura e a espessura da membrana. Em última análise, os resultados mostram diferenças nas propriedades entre diferentes fases lipídicas com base em imagens de MF e curvas de força.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia de fluorescência, é o aumento da resolução e as propriedades adicionais que um microscópio de força atômica (FM) pode investigar na amostra. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biofísica, como a estrutura de membranas biológicas e de proteínas inseridas nessas membranas. Além disso, também podemos analisar as propriedades físicas da membrana e monitorar como alterações na composição ou a adição de agentes ativos sobre a membrana podem modificar essas propriedades.De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à natureza frágil da amostra. Isso tem implicações sobre o preparo da amostra, o manuseio, a escolha de cantilevers e as condições de imageamento e espectroscopia em modo FM. Comece dissolvendo DOPC, spino, mielina e colesterol em clorofórmio nas concentrações desejadas. Em seguida, combine 18,38 microlitros de DOPC, 17,1 microlitros de sing mielina e 11,3 microlitros de colesterol para preparar uma solução contendo um miligrama de lipídios totais e uma razão molar de dois para dois para um, respectivamente.Prepare uma solução por vortex, seque a mistura usando um gás inerte como nitrogênio e, em seguida, seque-a ainda mais sob vácuo por pelo menos uma hora. Em seguida, dissolva os lipídios secos em 100 microlitros de PBS até uma concentração de 10 miligramas por mililitro. Vortexe a mistura vigorosamente por cerca de um minuto.Para obter uma suspensão turva contendo vesículas multilamelares. Certifique-se de que nenhum filme lipídico permaneça aderido às paredes do frasco. Transfira 10 microlitros da suspensão lipídica multilamelar e adicione 150 microlitros de tampão para bicamada lipídica suportada.Em seguida, misture uma solução e transfira-a para um pequeno frasco de vidro com tampa de 2 mililitros, selando-o com filme de parafina. Sonique a mistura à temperatura ambiente em um banho ultrassônico durante 10 minutos. Durante esse tempo, a solução deverá ficar límpida e produzirá pequenas uni ou vesículas com diâmetro de aproximadamente 50 nanômetros.Lave as lamínulas de vidro com água, seguida por etanol, e depois deixe secar ao ar. Em seguida, pegue os discos de MICA e remova a camada externa usando fita adesiva. Fixe o disco de MICA a uma lamínula usando uma gota de cola óptica transparente e incolor.Em seguida, fixe cilindros de plástico à MICA usando graxa de vácuo e certifique-se de que não haja vazamentos. Pipete toda a solução de lipossomos diretamente sobre a mica e adicione 140 microlitros adicionais de tampão de bicamada lipídica suportada para atingir um volume de 300 microlitros. A seguir, adicione 0,9 microlitro de solução de cloreto de cálcio a um molar para atingir uma concentração final de três milimolares de cálcio, incube as amostras por dois minutos a 37 graus Celsius e, depois, por pelo menos 10 minutos a 65 graus Celsius; nesta etapa, aqueça previamente também o tampão de bicamada lipídica suportada a 65 graus Celsius.Adicione tampão, se necessário, para garantir que a amostra não seque. Cobrir a câmara da amostra com uma lamínula também manterá a amostra hidratada. Em seguida, enxágue suavemente a amostra com o tampão pré-aquecido de bicamada lipídica de apoio de 10 a 15 vezes para remover o cálcio e as vesículas não fundidas.Tenha cuidado extra durante as etapas de lavagem para evitar que a bicamada seque após as etapas de lavagem. Resfrie as bicamadas suportadas até a temperatura ambiente. Antes das medições no microscópio de força atômica, configure o microscópio de força atômica ou um FM para realizar imagens das bicamadas lipídicas em solução.Usando o modo de contato de acordo com as especificações do fabricante, adicione tampão à amostra para mantê-la imersa em tampão durante todo o experimento. Monte a amostra na platina de MF-A e certifique-se de que todos os módulos de isolamento de vibração estejam ligados. Aguarde pelo menos 15 minutos para que o sistema atinja o equilíbrio e reduza a deriva térmica.Em seguida, aproxime a amostra em modo de contato com uma ponta de canto FM macia até que o contato seja estabelecido. Como as bicamadas são muito frágeis, minimize o ponto de ajuste da ponta FM durante a aquisição em modo de contato para manter a força no mínimo e corrigir a deriva térmica, ao mesmo tempo que mantém o contato com a amostra. Após a conclusão da aquisição, processe as imagens ajustando cada linha de varredura a funções polinomiais de nivelamento.Realize a remoção de linhas em varreduras que perdem contato com a membrana. Utilizando o software proprietário da empresa fabricante do AFM, calibre o cantiléver seguindo o protocolo do fabricante para determinar a conversão correta do sinal elétrico em uma medida de força. Após obter a imagem de uma área da bicamada, selecione uma região de cinco mícrons por cinco mícrons na bicamada para realizar a espectroscopia de força.Configure os MFA para obter curvas de força em uma grade de 16 por 16 nessa região, resultando em 256 curvas de força por região. Em seguida, configure o deslocamento do piso Z em 400 nanômetros. Isso determina a faixa máxima de movimento do piezo z e garante que a alavanca tenha se retratado completamente da amostra entre as medições.Ajuste em seguida a velocidade de aproximação para 800 nanômetros por segundo e a velocidade de recuo para 200 nanômetros por segundo. Também defina a força-alvo máxima para cada curva de força, neste caso, 12 nano Newtons. Após configurar todos os parâmetros, adquira as curvas de força pressionando o botão de execução do software de FM-A.Adquira pelo menos 500 curvas de força para cada condição para garantir uma boa estatística, construa um histograma dos valores e, em seguida, ajuste os histogramas a uma distribuição gaussiana para obter o pico e a largura da distribuição. Devido à composição lipídica utilizada neste estudo, duas regiões principais da membrana são formadas. Há uma região líquida ordenada composta por fing, mielina e colesterol, e uma região líquida desordenada composta principalmente por DOPC.O perfil de altura proveniente da imagem de AFM pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da membrana ao analisar o perfil de altura. A espessura da bicamada pode ser medida aproveitando a presença de defeitos na membrana. O mapa de altura também pode ser usado para medir a diferença de altura entre as fases ordenada e desordenada.As curvas de força derivadas do modo de espectroscopia de força são usadas para medir a força de ruptura vinculando o valor de força no pico da curva de força, conforme mostrado aqui. Além disso, a espessura da membrana pode ser determinada subtraindo o valor de distância do pico da curva de força até o valor de distância quando a curva de força começa a aumentar novamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter a solução de laminação B e monitorar constantemente a montagem de FM para corrigir os efeitos da deriva térmica e do acúmulo de D na ponta após este procedimento.Outros métodos, como microscopia de fluorescência confocal, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como as relacionadas à dinâmica da membrana. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar bicamadas suportadas e utilizar um MF para obter imagens e investigar as propriedades físicas dessas bicamadas.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, demonstramos as interações proteína-fosfoinositídeo em um padrão microfluídico usando o ensaio de modulação de pH, usando corante fluorescente sensível ao pH marcado com lipídio fosfatidiletanolamina de uma bicamada lipídica suportada, chamada de plataforma microfluídica. As modulações no pH após a ligação da proteína ao fosfolipídio causam extinção de fluorescência.

Ensaio de modulação de pH em bicamadas lipídicas suportadas para detectar interações proteína-fosfoinositídeo

Apresenta-se um método de preparação de mica suportado bicamadas lipídicas para microscopia de alta resolução. Mica é transparente e liso em uma escala atômica, mas raramente usado em imagiologia por causa de dificuldades de manuseio; a preparação resulta em deposição uniforme da folha de mica, e reduz o material usado na preparação de bicamada.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

&lt; class = 'jove_content '&gt; Um protocolo para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais covalentemente em uma ponta AFM é apresentado. Procedimentos e exemplos para determinar a força de adesão e a energia livre dessas moléculas em suportes sólidos e bio-interfaces são fornecidos.

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Apresenta-se um protocolo experimental para formar uma bicamada lipídica suportado sobre substratos sem a utilização de vesículas lipídicas. Nós demonstramos um método de um só passo para formar uma bicamada lipídica em dióxido de silício e ouro, bem como membranas suportadas com o domínio enriquecida em colesterol durante várias aplicações biológicas.

Biomembrane Fabrication pelo Solvent-assistida Lipid bicamada (SALB) Método

A preparação de bicamadas lipídicas planares com suporte de vidro funcionalizadas por proteínas, determinação da mobilidade de proteínas e medição de densidades de proteínas é mostrada aqui. Um roteiro para a construção de um microscópio de reflexão interna total com redução de ruído é delineado, o que permite visualizar fluorocromos residentes em uma única camada com alta resolução espaço-temporal.

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Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

Nós apresentamos um método para conseguir imagens com resolução sub-nanométrica com (modo tapping) amplitude da modulação de microscopia de força atômica em líquido. O método é demonstrado em microscópios de força atómica comerciais. Nós explicar a lógica por trás de nossas escolhas de parâmetros e sugerir estratégias para otimização resolução.

Sub-nanômetros de imagem resolução com Amplitude modulação Microscopia de Força Atômica no líquido

Este artigo descreve os protocolos de preparação de amostras, redução de dados e análise de dados em estudos de eco de giro de nêutrons (NSE) de membranas lipídicas. A rotulagem criteriosa de deutério de lipídios permite o acesso a diferentes dinâmicas de membrana em comprimento mesoscópico e escalas de tempo, sobre as quais ocorrem processos biológicos vitais.

Espectroscopia de Eco de Rotação de Nêutrons como uma sonda única para dinâmicas de membrana lipídica e interações membrana-proteína

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

A quantificação da área de contato e da força aplicadas por uma ponta de sonda de microscópio de força atômica (AFM) à superfície de uma amostra permite a determinação de propriedades mecânicas em nanoescala. As melhores práticas para implementar nanoindentação baseada em balil AFM em ar ou fluido em amostras moles e duras para medir módulo elástico ou outras propriedades nanomecânicas são discutidas.

Nanoindentação baseada em cantilever por microscopia de força atômica: medidas de propriedades mecânicas em nanoescala no ar e fluido

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Caracterização da Estrutura e Função da Membrana Lipídio-Proteína usando Bicamadas de Interface de Gotículas

Aprenda a preparar bicamadas lipídicas suportadas e caracterizar suas propriedades físicas usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força. Este método permite investigar estrutura, espessura e propriedades mecânicas de membranas biológicas.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

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