Name: Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a preparar fatias cerebrais para registrar oscilações gama na região CA1 do hipocampo usando estimulação tetânica. Este método permite avaliar os efeitos de fármacos na excitabilidade neuronal e investigar mecanismos de doenças neurológicas como epilepsia e autismo.

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Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo comitê de ética animal Instituto Florey. 1. Instalação para corte fatias do cérebro do <ol><li> Prepara-se uma solução de corte composta por (mM) 125 de colina-Cl, 2,5 de KCl, 0,4 de CaCl2, 6 de MgCl2, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO 3 26, 20 D-glucose saturado com gás de carbogénio (95% O 2 -5 % de CO 2) e um fluido cerebroespinal artificial (aCSF solução) de gravação formada por (mM) NaCl 125, KCl 2,5, CaCl2 2, MgCl2 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 10 de glucose-D, saturado com carbogénio. Coloque a solução de corte no gelo para mantê-lo frio. </li><li> Congelar aproximadamente 400 ml da solução de corte e misturam-se com 100 ml de solução descongelada de corte para criar uma pasta de gelo. Bolha com carbogénio (95% O2 5% CO2) a um caudal de aproximadamente 0,5 L / min por meio de pequenos ctubulação Aliber ou de vidro sinterizado para produzir um fluxo constante, mas suave de bolhas. </li><li> Prepara-se uma proveta de 250 ml com uma inserção de rede de nylon levantado em que as fatias de cérebro vai ser colocado. Encha com aCSF para cobrir a malha por aproximadamente 2 cm e bolha com carbogênio, garantindo que as bolhas não perturbar directamente área da fatia segurando. Também é importante que não existem bolhas de ar na rede de nylon, por isso, se qualquer estão presentes removê-los. Esta será a câmara de retenção e é mantida à TA (20 - 25 ° C). </li><li> O layout dos instrumentos de dissecação, incluindo um grande par de tesouras, um pequeno par de tesouras, pequenos e grandes espátulas, micro e pequenas e grandes pinças e chill-los no gelo. Coloque o bloco de corte de tecidos vibratome no gelo em um quadrado de papel alumínio. Obter dois pedaços de papel 6 cm de filtro, uma única lâmina de barbear borda, e um copo de 25 ml cheio com a solução de lama de corte bem. </li><li> Encha um segundo recipiente com gelo, e colocar um pedaço de tecido paper sobre o gelo e colocar um prato de cultura de 12 centímetros na parte superior. Encha o prato de cultura com o corte de solução de pasta de gelo e espuma com carbogênio. Este é o contentor no qual o cérebro com dissecção ser realizada. </li><li> Prepare o vibratome. Remover uma lâmina de barbear duplo gumes frescos (use uma nova lâmina de cada vez) da embalagem e spray com etanol 80% de água, em seguida, deionizada. Cortar a 3 ml de transferência pipeta de plástico no ponto onde ele começa a diminuir. Isto irá ser utilizado para transferir as fatias de cérebro. Dobre a 27 G agulha na base por cerca de 45 ° e anexar a uma seringa de 1 ml. Isto irá ser utilizado para manipular fatias durante o corte. </li></ol> 2. Corte fatias de cérebro <ol><li> Anestesiar um rato (P16 - P18) com isoflurano a 2% ou um método aprovado localmente. Após a indução, decapitar o animal com um grande par de tesouras e soltar a cabeça no prato de cultura 12 centímetros que contém borbulhado pasta solução de corte. A pasta deve mergulhar totalmente a cabeça pararesfriamento rápido. </li><li> Segurar a parte frontal da cabeça com uma mão a descamação da pele e do tecido conjuntivo para a frente em direcção ao nariz. Usando as pequenas tesouras cortar o tecido conjuntivo para revelar o crânio subjacente. Em seguida, retire os músculos que recobrem aspecto dorsal do crânio e pescoço. </li><li> Remover o cérebro do crânio por fixar a primeira parte frontal do crânio com as grandes pinça e, em seguida, fazer dois cortes laterais através do osso ou outro lado do buraco occipital, utilizando as pequenas tesouras (Figura 1, os cortes marcados A1 e A2). <ol><li> Faça outro corte entre os olhos (apenas anterior do bregma) (Figura 1, corte marcado B), em seguida, corte cuidadosamente ao longo da sutura sagital anteriormente e refletem as seções corte do crânio para revelar o cérebro (Figura 1, corte C rotulado). </li><li> Use a pequena espátula para colher o cérebro eo lugar em uma placa de cultura. Esteja ciente do crannervos ial sobre o aspecto inferior do cérebro, que terá de ser rompida, isto pode ser feito usando o menor tamanho micro espátula. Utilizando a espátula de transferir maiores do cérebro para o copo de 25 ml cheio com a solução de lama de corte. </li></ol></li><li> Preparando o hemisfério cerebral para corte. <ol><li> Coloque um pedaço de papel de filtro 6 centímetros no fundo de um prato de cultura fresco, em seguida, preencher com chorume fresco solução de corte e bolha. Utilizar a espátula maior para posicionar o cérebro, o lado ventral para baixo, para o papel de filtro. Pegue uma lâmina de barbear nova e limpa aresta única e cortar o cérebro para remover o cerebelo, em seguida, faça um corte ao longo da linha média para separar o cérebro em dois hemisférios. </li></ol></li><li> Preparando o bloco de tecido vibratome. <ol><li> Aqui o bloco de tecido vibratome refrigerados, secar a superfície, e colocar uma gota de cola de cianoacrilato no meio e distribuídos uniformemente para o tamanho aproximado do cérebro. Utilizar a pequena espátula para manipular um doshemisférios cerebrais para o grande micro espátula de modo que o lado medial do cérebro está em baixo. </li><li> Tocar a borda da espátula na interface do cérebro no segundo pedaço de papel de filtro para remover o máximo da solução quanto possível. Deslize o cérebro fora das espátula maiores, usando a espátula menor para guiá-lo para a cola. </li><li> Prenda o bloco de corte para a câmara de vibratome e encher a câmara com lama solução de corte e bolha, garantindo o cérebro está completamente imerso. Rodar o bloco de corte de modo que o lado ventral do cérebro está virada para a lâmina. </li></ol></li><li> Cortando o cérebro. Nota: Cada vibratome é único por isso siga as instruções do fabricante. <ol><li> Definir a espessura da fatia de 450 mm, e assegurar a lâmina está a vibrar, uma vez que se move através do cérebro a uma velocidade de cerca de 0,3 mm / s. Cortar inteiramente através do cérebro do lado ventral para a superfície cortical, isso vai produzir fatias de cérebro sagital inteiras que podem Be usado para registros eletrofisiológicos. Fatias serão produzidos lateralmente para medialmente e tipicamente 3-4 fatias pode ser cortada a partir de cada hemisfério. </li><li> Se a base dos elevadores fatia usar o bent 27 G agulha para imprensa suave a fatia de volta para baixo. À medida que cada fatia é cortada, utilizar a pipeta de transferência para movê-lo para a plataforma na câmara de retenção, onde eles são viáveis ​​para até 8 horas. </li></ol></li></ol> 3. extracelulares Eletrofisiologia Recordings <ol><li> Montagem da fatia na câmara de gravação. <ol><li> Utilizando a pipeta de transferência, coloque uma fatia do cérebro dentro de uma câmara de gravação submersa perfundidos com aCSF fluindo a 1 - 2 ml / min e aquecida a 32 ° C. O aCSF usado para gravações difere do que na câmara de retenção, como a concentração de Mg 2+ é aumentada de 2 mM a 4 mM. </li><li> Fixe a fatia com uma &quot;harpa&quot; (aço inoxidável semi circular com fios de nylon esticadas em toda a 2 - espaçamento de 3 mm). Lugarharpas, de modo que as cadeias correm paralelamente ao CA1. Aumentar a velocidade de perfusão para 8 - 10 ml / min a 32 ° C. </li></ol></li><li> Sob um microscópio de dissecação lugar um eléctrodo estimulante e um eléctrodo de registo (eléctrodo de vidro preenchido com a solução de gravação aCSF) sobre a superfície do estrato radiante de CA1 (Figura 2A). Coloque o eletrodo estimulando primeiro, em seguida, coloque o eletrodo de registro. </li><li> Estimular a Schaffer dos colaterais com um 120 - 150 mA amplitude e 0,1 ms duração do pulso de teste e observar o campo pós excitatório sináptica potencial (fEPSP) forma de onda resultante para determinar fatia saúde (Figura 2B). Os eléctrodos de estimulação e de registo pode precisar de ser movido para a fatia de cerca de 50 - 100 | iM a partir da superfície da fatia para obter a gravação de um fEPSP com uma pequena da salva de fibra e grande amplitude. A garantia Schaffer evocado fEPSPs são estereótipo e oferecer um bom indicador da fatia saúde. HEalthy fatias mostram tipicamente uma saraivada de fibra para fEPSP relação de amplitude inferior a 0,3. </li><li> Reposicionando os eletrodos. <ol><li> Usando um microscópio de dissecação, mover-se do eléctrodo estimulante para o meio das stratum oriens e mover o eléctrodo de registo para a camada de células piramidais o mais próximo do eléctrodo de registo como possível, como mostrado na Figura 3A. Os eléctrodos de estimulação e de registo pode ter de ser empurrada para dentro da fatia de cerca de 50-100 uM de modo que a amplitude da resposta ao fEPSP 120-150 uA pulso de teste é de aproximadamente 1 mV. </li></ol></li><li> Gerando oscilações γ. <ol><li> Para gerar oscilações γ estimular o tecido com um trem de 20 x 0,1 pulsos ms entregues a 200 Hz. Este estímulo tetânico pode render respostas reprodutíveis quando entregues a cada 5 minutos. </li></ol></li><li> Utilize os seguintes parâmetros de gravação. <ol><li> Escala o ganho do sinal de saída para combinar com a gama de tensão de entradao conversor de analógico para digital. Certifique-se que o máximo esperado excursão sinal usa um mínimo de 30% da gama de tensão de entrada. Tenha cuidado ao definir ganhos para alta como sinais pode cortar. A largura de banda típica necessário para gravações de campo é de 500 Hz com acoplamento AC a 0,1 Hz para remover desvio da linha de base. </li><li> Digitalizar pelo menos 4-5 vezes mais rápido do que a frequência de corte do filtro passa-baixo para evitar a turbulência de sinais. </li></ol></li><li> Análise de dados. <ol><li> Dados filtro de alta freqüência de 5 Hz para remover quaisquer mudanças da linha de base. Identificar picos utilizando um derivado de limiar, com uma separação mínima evento de 10 ms, um tempo típico de evento para o pico e o intervalo de regressão de 7 ms, de um limiar de ~ 100 mV / ms, e um vale a separação de 100%. Calcular latência como o tempo necessário para o primeiro pico identificado para ocorrer após o fim do artefacto de estimulação. Esta análise permite a caracterização do número de espigas, a latência, intervalo inter-eventos, e calculada como a duraçãosegue: </li><li> Calcular o número de picos como o número total de picos por oscilação para cada varrimento é determinada. </li><li> Calcula-se a latência de oscilação. Para cada oscilação, subtrai-se o tempo do primeiro ponto identificado a partir da extremidade do artefacto de estimulação. </li><li> Calcule o intervalo médio inter-evento (ISI). Determinar o período de tempo entre vários picos detectados e média. </li><li> Calcula-se a duração da oscilação. Medir o tempo entre o primeiro eo último pico detectado dentro de cada oscilação. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Um método robusto para gerar oscilações de CA1 γ em fatias cerebrais agudos está descrito. As oscilações geradas surgir a partir de um circuito local possibilitando uma melhor oportunidade para controlar e compreender a base neurofisiológica de oscilações da rede 12. Os receptores de AMPA, receptores de GABA A, I h e de tipo T canais de Ca2 + são todos necessários para oscilações γ neste modelo. Enquanto as oscilações CA1 locais descritos aqui podem ser robustamente gerou esta...

Oscilações de rede do cérebro ocorrem nas faixas de frequências distintas que se correlacionam com estados comportamentais. Em roedores, oscilações θ do hipocampo (5-10 Hz) são observadas durante comportamentos exploratórios 1,2, enquanto oscilações γ (20 - 80 Hz) associado com vários processos cognitivos, incluindo a percepção e atenção 3,4. Atividade da rede síncrona γ também está implicado na patologia de distúrbios como a epilepsia e esquizofrenia 5,6. Por exemplo, oscilações γ Pensa-se que correspondem a áreas corticais de focos epilépticos 5,7,8 e poderiam ser utilizados como marcadores de pharmacosensitivity ou resistência, dois importantes áreas de investigação na pesquisa da epilepsia 9. A fatia do hipocampo do cérebro é um modelo que tem sido amplamente utilizada para investigar a atividade da rede 10-12. Vários protocolos têm sido desenvolvidos para gerar oscilações γ em fatias cerebrais que tipicamente imodulação farmacológica nvolve tais como Mg 2+ baixo, 4-aminopiridina (4AP), bicuculina e ácido caínico 12-17. Deficiências de oscilações farmacologicamente desencadeadas são de que eles ocorrem aleatoriamente após a aplicação da droga e não são gerados de forma fiável ou estável ao longo do tempo. Electricamente desencadeada oscilações γ ultrapassar muitos destes problemas e também tem a vantagem de ser temporariamente bloqueado para o evento estimulante para permitir a gravação e análise episódica. Aqui é descrito um protocolo para gerar oscilações CA1 γ, oferecendo uma estimulação tetânica para os oriens estrato na fatia do hipocampo.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de 4-(N-etil-N-fenilamino)-1,2-dimetil-6-(metilamino) pirimídino (ZD7288)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z3777</td><td></td></tr><tr><td>Biuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14340</td><td></td></tr><tr><td>6-ciano-7-nitroquinoxa-linha-2,3-diona (CNQX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C127</td><td></td></tr><tr><td>Níquel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266965</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr> <tr><td>(2R) - amino-5-fosfonopentano-ato (APV)</td> <td>Tocris Bioscience</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Retigabine</td><td>ChemPacific</td><td>150812-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Colina-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1879-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH 2 PO 4 </td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & touro; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de vidro</td><td>Harvard Apparatus&nbsp;</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo metálico estimulante bipolar concêntrico</td><td>Isolador</td> Digital <td>FHC CBBPF75</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Obtendo Instrumentos</td><td>Modelo BJN8-9V1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador modelo 1800</td><td>Sistemas AM Modelo</td><td>1800 amplificador</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Intruments</td><td>NI USB-6211</td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de locais oscilações ca1 γ por tetânica estimulação

Generation of Local CA1 &#947; Oscillations by Tetanic Stimulation

Oscilações de rede neuronal são características importantes da actividade cerebral na saúde e na doença e pode ser modulada por uma variedade de fármacos utilizados clinicamente. Um protocolo é fornecido para gerar um modelo para o estudo de oscilações CA1 γ (20 - 80 Hz). Estas oscilações γ são estáveis ​​durante pelo menos 30 min e dependem actividade sináptica excitatória e inibidora em adição a activação de correntes de pacemaker. Oscilações tetanicamente estimuladas têm uma série de características reprodutíveis e facilmente quantificáveis, incluindo contagem de pico, duração de oscilação, a latência ea frequência que apresentar um relatório sobre o estado da rede. As vantagens das oscilações estimuladas electricamente incluem a estabilidade, reprodutibilidade e aquisição episódica robusta permitindo caracterização da função de rede. Este modelo de CA1 oscilações γ podem ser usadas para estudar os mecanismos celulares e para investigar a actividade sistematicamente como rede neuronal é alterado na doença e pelas drogas.Doença farmacologia estado pode ser facilmente incorporado pela utilização de fatias de cérebro de modelos animais geneticamente modificados ou de intervenção para permitir a selecção de drogas que visam especificamente mecanismos da doença.

Estimulação tetânica dos oriens estrato gerado robustos e reprodutíveis oscilações γ (35,4 ± 2,2 Hz), ver Figura 3B. Para demonstrar que as oscilações foram geradas na rede local de CA1 as entradas de CA3 foram cortados pelo corte da fatia na região CA2 usando uma agulha G 32 dobrada. As propriedades de oscilação de corte em fatias não diferiram das fatias não cortadas (p = 0,85, e as fatias cortadas 6,16 ± 1,1 pontos, n = 6; não cortadas fatias 5,89 ± 0,8 pontos, n = 6), indicando que as oscilações sej...

Oscilações são propriedades fundamentais da rede e são modulados pela doença e drogas. Estudar oscilações cérebro-slice permite a caracterização das redes isoladas em condições controladas. Protocolos são fornecidos para a preparação de fatias cerebrais agudos para evocar CA1 oscilações γ.

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

Neuronal network oscillations are important features of brain activity in health and disease and can be modulated by a range of clinically used drugs. A ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias cerebrais para o registro de oscilações gama extracelulares como um modelo de excitabilidade neuronal. Isso é realizado primeiramente removendo o cérebro do crânio. O segundo passo é resfriar rapidamente o cérebro em uma solução salina artificial gelada e cortá-lo em fatias de 450 mícrons.Em seguida, transfira uma fatia para a câmara de registro e posicione o eletrodo estimulante no estrato e um eletrodo de registro no stratum pyramidale. O passo final é evocar oscilações gama e avaliar o impacto de fármacos sobre a excitabilidade neuronal. Em última análise, a caracterização das oscilações gama do hipocampo é utilizada para demonstrar os efeitos de fármacos sobre a função da rede ou para compreender os mecanismos da gênese de doenças em distúrbios neurogenéticos.Este método pode ser utilizado para obter insights sobre os mecanismos de doenças nas quais ocorrem aumentos na excitabilidade da rede neuronal, como epilepsia, autismo e Alzheimer, e também pode ser usado para investigar o mecanismo de ação de fármacos. Para iniciar este procedimento, prepare uma câmara de contenção inserindo uma malha de náilon elevada em um béquer de

generation-of-local-ca1-oscillations-by-tetanic-stimulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A preparação de fatias cerebrais agudas de isolado hipocampo, assim como as gravações simultâneas electrofisiológicas de astrócitos e neurónios...

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Este vídeo demonstra o procedimento de indução de oscilações gama CA1 locais em uma fatia de cérebro de camundongo hipocampo CA1 usando simulações tetânicas. Este método é importante para entender a atividade da rede neuronal.

Gerando oscilações gama locais de Cornu Ammonis 1 (CA1) usando estímulos tetânicos em uma fatia de cérebro do hipocampo

Este vídeo demonstra um método para registrar as respostas sinápticas CA3-CA1 em uma fatia de hipocampo de rato. Ele descreve as etapas envolvidas na colocação dos eletrodos de estimulação e registro na fatia do hipocampo e na medição do potencial pós-sináptico excitatório de campo (fEPSP) para avaliar a força da resposta sináptica.

Registrando respostas sinápticas CA3-CA1 em uma fatia de hipocampo de rato

Este vídeo demonstra a gravação da atividade da rede neuronal rítmica, também conhecida como oscilações, em um hipocampo isolado. Os eletrodos são inseridos em várias camadas e posições espaciais para detectar e analisar as oscilações. Isso mostra as composições neuronais únicas e a conectividade da rede neuronal em diferentes camadas do hipocampo.

Registro in vitro de oscilações no hipocampo de camundongos

Este vídeo demonstra o método para usar a optogenética para modular a dinâmica da rede hipocampal, ativando interneurônios sensíveis à luz geneticamente modificados em uma fatia de cérebro de camundongo, aprimorando a sincronização da oscilação e estudando o comportamento do circuito neural.

Controle optogenético da dinâmica da rede hipocampal

O núcleo pedunculopontino (PPN) está localizado no tronco cerebral e seus neurônios são maximamente ativado durante a vigília e movimento rápido dos olhos (REM) do cérebro sono estados. Este trabalho descreve a abordagem experimental para gravar em oscilação vitro membrana subliminares banda gama em neurônios PPN.

Gravação Gama Oscilações banda em pedunculopontino Núcleo Neurônios

Aqui, apresentamos um protocolo para a gravação da teta de rede neuronal rítmica e das oscilações gama de uma preparação isolada do hipocampo inteiro. Descrevemos os passos experimentais da extração do hipocampo para detalhes de gravações de grampos de campo, unidade e toda célula, bem como a estimulação optogenética do ritmo de theta.

Tuning na banda Theta do hipocampo<em&gt; In Vitro</em&gt;: Metodologias para gravação a partir do Circuito de Septohippocampal de Roedores Isolado

Nós descrevemos o uso de optogenetics e eletrofisiológicas gravações para manipulações seletivas das oscilações de theta hippocampal (5-10 Hz) no comportamento de ratos. A eficácia do arrastamento ritmo é monitorada utilizando o potencial do campo local. Uma combinação de opto - e inibição farmacogenética aborda a leitura eferente de sincronização hippocampal.

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Este protocolo descreve a gravação dos potenciais de campo local com haste multi sondas de silicone linear. Conversão de sinais usando análise de densidade atual fonte permite a reconstrução do local atividade elétrica no hipocampo do mouse. Com esta técnica, oscilações espacialmente restrita do cérebro podem ser estudadas em ratos movimentando-se livremente.

Gravação espacialmente restrita oscilações no hipocampo de ratos de comportar-se

Em alguns animais gene-manipulados, usar um único protocolo pode não induzir o LTD em pilhas Cerebelares de Purkinje, e pode haver uma discrepância entre o LTD e a aprendizagem do motor. Os protocolos múltiplos são necessários avaliar a LTD-indução em animais gene-manipulados. Os protocolos padrão são mostrados.

Avaliação da indução de depressão em longo prazo em fatias Cerebelares adultas

Utilizamos eletrodos de gravação e estimulação em fatias de cérebro hipocampal longitudinal e eletrodos de gravação e estimulação longitudinalmente posicionados no hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciais pós-sinápticos extracelulares e demonstrar plasticidade sináptica de longo prazo ao longo do CA1 interlamelar longitudinal.

Investigando a plasticidade sináptica de longo prazo no hipocampo interlamelar CA1 por gravação de campo eletrofisiológico

Aprenda a preparar fatias cerebrais para registrar oscilações gama na região CA1 do hipocampo usando estimulação tetânica. Este método permite avaliar os efeitos de fármacos na excitabilidade neuronal e investigar mecanismos de doenças neurológicas como epilepsia e autismo.

Geração de locais Oscilações CA1 γ por Tetânica Estimulação

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