Name: Implementação de In Vitro Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprenda a identificar mecanismos de resistência a drogas em terapias-alvo usando linhagens celulares resistentes e sequenciamento de exoma completo. Este protocolo acelera a descoberta de variantes clinicamente relevantes.

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Os autores gostariam de agradecer aos nossos colegas da H3 Biomedicine por seus comentários durante a preparação do manuscrito.

1. Avaliação GI 50 para o composto (s) de interesse <ol><li> Gerar curva (s) de crescimento de linhas celulares de interesse para avaliar a densidade de sementeira apropriada. Traçar O número de células em vários pontos de tempo após a sementeira (dias 2, 4, 6 e 8) em relação ao dia 0. Isto proporcionará uma taxa de crescimento relativo da linha de células de interesse e deve ser utilizado para avaliar a densidade de sementeira inicial de tal modo que confluência não é atingido em placas de 96 poços no prazo de 7 dias. </li><li> Uma vez que as curvas de crescimento foram determinadas, semente número adequado de células em não-transparente, claro fundo placas de 96 poços em 100 ul de meio de células para avaliar GI 50. Semente o número de células com base na linha celular utilizada e determinada em 1,1. Normalmente, sementes 3x10 3 células para linhas de células de crescimento rápido com um tempo de duplicação de ~ 24 horas, por exemplo., HCT116. <ol><li> Prepara-se uma placa de ensaio (dia-1). Para a placa de ensaio, as células semente com uma densidade desejada em 100 ul de meio de cultura In poços sombreados em azul (Figura 1). Wells em destaque na branco contêm apenas mídia. </li><li> Prepara-se uma placa de controlo (dia-1). Para a placa de controlo, semear a mesma densidade das células como no passo 1.2.1 em 100 ul de meio de cultura em separado uma placa de 96 poços. Este &quot;Dia 0&quot; leitura vai ajudar na interpretação da natureza citostático / citotóxica dos compostos que está sendo analisado (Figura 2). </li></ol></li><li> No dia seguinte (dia 0), ler a placa de controle. Equilibrar reagente de viabilidade celular luminescente (substrato CellTiter-Glo misturado com tampão de acordo com as instruções do fabricante) para a TA e agitar suavemente o conteúdo por inversão para se obter uma solução homogénea. Adicionar 80 ul de reagente a 100 ul de células / mistura meios e agitar o conteúdo durante 30 min para induzir a lise celular. <ol><li> Grave luminescência com um luminómetro definida para uma exposição de 0,1-1,0 segundos e detecção de comprimento de onda de 560 nm. </li></ol></li><li> Adicionar os compostos de teste (compostosde interesse) para testar as placas (dia 0). Fazer uma diluição 1: 4 em série dos compostos em DMSO, a concentração final de 200x, para um total de 10 concentrações (diluições contendo o composto 9 e apenas um de DMSO, a placa de composto). Como um ponto de partida inicial, o objectivo para uma dose 200x menor de 0,03 mM e uma dose superior de 2.000 mM (volume final de 200 ul). </li><li> Adicionar compostos serialmente diluídos para meio para fazer uma mistura composto-forma numa concentração final 10X (volume final de 100 ul, a placa intermediária). Armazenar a placa de composto a -20 ° C para utilização no dia 3 do ensaio. Adicionar 10 uL de mistura de composto de médio a células em triplicado de modo a que a dose mais elevada é 10 uM (por ex., As linhas B, C e D, dia 0) (Figura 1). Incubar as placas de ensaio durante 3 dias a 37 ° C. Descartar placa intermédia (s) após o uso. </li><li> No dia 3, preparar uma mistura de composto 400 ul de meio 1x utilizando as placas de composto preparado no passo 1.4. Inverta placas de ensaio para remover mídia e seque em autotoalhas de papel claved 2-3x para remover mídia residual. Adicionar composto / meios (100 ul / poço) para poços sombreadas em azul e adicionar 100 ul de meios de perímetro poços para evitar a evaporação (Figura 1). Re-incubar as placas de ensaio a 37 ° C durante um período adicional de 3 dias. </li><li> No dia 6, avaliar o número relativo de células viáveis ​​através da realização de uma leitura de luminescência, tal como descrito na etapa 1.3. </li><li> Use a leitura dia 0 para avaliar a natureza estática / tóxico de compostos. Agentes tóxicos induzir a apoptose enquanto os agentes citostáticos induzir parada do ciclo celular. Se o composto é tóxico (dia 6 leitura está abaixo de dia 0 leitura), considere a escolha de GI 50, e GI 50 x 5 concentrações para os testes de resistência. No entanto, se o composto induz a estase (igual a ou maior do que a leitura D0), considere GI 100 e 100 GI X5 para os ensaios de resistência (Figura 2). </li></ol> 2. Criação de drogas Resistência Assays <ol><li> Se a sagacidade de trabalhoha agente citostático, as células semente em uma confluência de 30-40% em 150 mm 2 pratos de cultura de tecidos (volume = 30 ml) para o ensaio de resistência. Se trabalhar com um agente tóxico, semear a uma confluência de 70-80%. </li><li> Para linhas de células que abrigam um mecanismo de reparação de emparelhamentos incorrectos intacta (MMR), incubar as células do passo 2.1 O / N a 37 ° C com o agente cancerígeno de N-etil-N-nitrosoureia (ENU). Tratar as células com 30 ul de uma solução de estoque de 50 mg / ml ENU (concentração final 50 ug / ml) para aumentar a instabilidade do genoma. Para linhas de células que possuem um defeito MMR (Tabelas 2 e 3), o tratamento com ENU ou outras substâncias cancerígenas pode não ser necessário. <ol><li> Para outras linhas celulares, determinar MMR-deficiência por critérios NCI usando microsatélites instabilidade 12, ou com base na caracterização publicada utilizando ensaios de instabilidade de microssatélites ou perfil genômico / epigenômico de genes MMR 13-15. </li></ol></li><li> Células trata-se com o composto de teste (s) deinteresse na concentração determinada no passo 1.8. Para os compostos altamente tóxicos que causam a morte celular num ensaio de viabilidade de três dias típico 10, começar com um tratamento de dose baixa (ou seja, GI 50) e progressivamente aumentar a concentração (múltiplos de GI 50) de composto até cada 2-3 semanas robusta resistência é observada. Reabastecer de mídia e agravar a cada 3 d. </li><li> Uma vez que a selecção foi iniciada, mudança media / composto misturar a cada 3-4 dias até clones resistentes emergem. Resistência, por definição, surge quando as células tratadas mostram um maior crescimento / viabilidade durante o tratamento da droga em relação ao tratamento agudo de células de controlo tratadas com DMSO. </li></ol> 3. isolamento de clones de uma única célula <ol><li> Examine cultura prato usando microscopia de contraste de fase (ampliação de 40x) para clusters de células viáveis. </li><li> Clones satisfatórios de interrogação no fundo do prato com uma caneta de marcação. Escolha clones que são de tamanho médio (colônias maiores podemoriginários de várias células) e bem isolado a partir de outras colónias. Escolha clones usando uma das duas abordagens descritas no passo 3.3. </li><li> Método 1: Utilizando um pipetador (Figura 3) <ol><li> Remova a mídia de crescimento e enxágüe com 1x PBS para remover quaisquer células flutuantes. </li><li> Use marcas pretas como guia para &#39;colheita&#39; clones com ponta de pipeta (anexado a pipeta, p200 de preferência). </li><li> Clones de transferência para placas de 48 poços com 200 ul de meio fresco (com uma concentração metade composto para permitir a recuperação óptima de células). </li><li> Permitir que as células recuperar durante 2-3 dias antes de adicionar 200 mL de mídia fresco / concentração composto ideal. </li><li> Continuar a mudar media / composto a cada 3-4 dias e continuar a expandir clones. </li></ol></li><li> Abordagem 2: Usando clonagem de discos (Figura 3) <ol><li> Marque clones como descrito no passo 3.2. </li><li> Colocar 3 milímetros discos de clonagem em uma placa de 10 cm de cultura de tecidos contendo 5 ml de 0,25% trypsin-EDTA durante 2 min. </li><li> Aspirar media de prato contendo clones resistentes e sobrepor clones com tripsina embebido discos de clonagem utilizando fórceps estéreis descartáveis. </li><li> Deixar durante 1-2 min, dependendo da facilidade com que os clones levantar as placas, num banho a 37 ° C incubadora. </li><li> Pegue clonagem discos usando uma pinça estéril e transferir para placas de 48 poços com 200 ul media frescos e metade concentração do composto. </li><li> Pipeta-se para baixo e ligeiramente para desalojar as células a partir de discos de clonagem e incubar O / N a 37 ° C (deixar em discos de clonagem de poços). </li><li> Na manhã seguinte, remova os discos de clonagem a partir de placas de 48 poços e encher os poços com 200 ul fresco media / composto (concentração do composto de metade ideal). </li><li> Três dias mais tarde, reabastecer de mídia com a concentração ideal do composto. </li><li> Continuar a mudar o media / composto a cada 3-4 dias e continuar a expandir clones. </li></ol></li></ol> 4. Avaliação Grau de Resistance de Isolado Clones <ol><li> Uma vez que 10-20 colónias são expandidos, geram IG 50 curvas, tal como descrito no passo 1 para avaliar o grau de resistência. </li><li> Sempre incluir populações de controlo tratados com DMSO durante o processo de seleção. É muito provável que o espectro de resistência vai ser grande (alguns mostrando parcial enquanto outros mostrando resistência completa). Recolha algumas clones de cada uma destas classes como o mecanismo de resistência pode variar entre os dois grupos. </li></ol> Sequenciamento 5. Próxima geração <ol><li> Girar 2 milhões de células (controlo) e os clones resistentes (500 xg durante 5 min) em 15 ml de frascos cónicos para ambos ADNg e recolha de RNA (por conseguinte, 2 x 2 milhões). </li><li> Lavar duas vezes com PBS 1x e congelar em aglomerados -80 ° C até estar pronto para o isolamento. </li><li> Use um kit de extração comercial para isolar RNA ou gDNA de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Enviar amostras para sequenciamento de última geraçãousando o protocolo do fornecedor 10. </li></ol> 6. Bioinformática análise de amostras (whole-exome sequenciação) <ol><li> Preprocess sequência de dados de acordo com a melhor prática DNA-seq gasoduto 16. <ol><li> Mapear todas as leituras para fazer referência GRCh37 genoma humano utilizando BWA 17. Converter descompactados alinhamentos SAM formatadas para o formato BAM comprimido com Samtools 18. Classificar alinhamentos por coordenar com Samtools. Adicionar grupos de leitura usando Picard. (Para BWA específico, Samtools e Picard comanda, consulte Suplementar Text 1, linhas 1-4) </li><li> Mark todas as duplicatas lê usando os MarkDuplicates comando da ferramenta Picard definido 19. Índice este arquivo com Samtools. (Texto Suplementar 1, linhas 5-6) </li><li> Para minimizar bases não correspondentes em todos os lê, lê realinhar localmente em regiões que abrigam pequenas inserções ou exclusões usando uma realigner indel 20. (Texto Suplementar 1, linhas 7-8) </li><li> Para melhorar ainda mais o Accuracy da chamada variante, os escores de qualidade de base empírica recalibrar usando uma ferramenta de recalibração índice de qualidade base. A ferramenta de calibração da qualidade de base deve não só o índice de qualidade inicial correto, mas também ter em conta covariation de vários recursos, incluindo leitura de grupo, ciclo da máquina, posição de base, e contexto dinucleotide (bases atuais anteriores +). Gerar BAM recalibrado com PrintReads Picard. (Para comandos específicos para esta etapa, consulte Suplementar Text 1, linhas 9-10) </li><li> Repita os passos 6.1.1 através 6.1.4 (Texto Suplementar 1, linhas 1-10) para cada amostra sequenciada. </li></ol></li><li> Identificar a variação de nucleotídeo único (SNV) em cada clone usando uma variante emparelhado chamando tool19, 21-23. Para cada clone sequenciado, variante emparelhado executar chamando usando o clone parental como o combinado &quot;normal&quot;. (Recurso Text 1, linha 11) </li><li> Filtro recorrentes, variantes de alta qualidade e se preparar para anotação com uma ferramenta de anotação variante 24. Deprioritize variants não é comum a todos os clones resistentes. (Veja R roteiro em Suplementar Text 2) </li><li> Anotar variantes com uma ferramenta de anotação 25, 26. Muitas ferramentas de anotação variante tenho um aplicativo web que acompanha permitindo que os dados sejam enviados e processados ​​por um servidor remoto. </li><li> Use uma ferramenta de previsão do impacto funcional 27-29 de priorizar as variantes previstas de ter alto impacto funcional. Como anotação variante, várias ferramentas estão disponíveis para a previsão do impacto funcional através de uma interface web. </li></ol>

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Taxas de publicação do presente artigo são pagos pelo H3 Biomedicina.

Seleção de linha (s) celular: Caracterização do estado genético e instabilidade genômica Sem dúvida, o factor mais importante na descoberta de mecanismos de resistência com sucesso clinicamente relevantes é a seleção inicial da linha celular. Dois factores devem ser considerados. Em primeiro lugar, o objectivo de seleccionar a linha de células (s) da mesma linhagem / subtipo abrigar os traços genéticos que definem a doença (por exemplo., BRAF V600E em melanoma). Interrogatório de dados transcriptomic e mutação publicamente disponíveis para ambas as linhas de células 30-32 e tumores primários / metástase para uma variedade de indicações 33,34 facilitará o processo de seleção. Embora a identificação de linhas celulares com alterações genéticas clinicamente relevantes é ideal, em alguns casos, isto pode não ser possível devido à falta de linhas celulares disponíveis ou viável devido a factores tais como a dificuldade e duração do processo de triagem. <p class="jove_content"&gt; Com relação ao ponto acima mencionado, um segundo fator a considerar, em seguida, durante a seleção de linha celular é a facilidade ou viabilidade de resistência rastreio utilizando a linha desejada. Por exemplo, factores tais como a proliferação e taxas de mutação intrínsecas podem ter grande impacto na velocidade de descoberta. Para esse efeito, as linhas celulares podem ser utilizadas com uma cinética de crescimento mais rápidas e deficiente em mecanismos de ADN MMR na esperança de que o surgimento de resistência espontânea pode ser acelerada 35. Com base no banco de dados cósmicos, várias linhas celulares candidatas existir com deficiência de um dos dois genes MMR frequentemente mutados MSH2, MLH1 ou (Tabelas 2 e 3). Alternativamente, se as linhas celulares de interesse, não existem defeitos de rolamento na MMR, o tratamento agudo com mutagénios químicos ou físicos ADN reactivo, tal como o agente de alquilação N-etil-N -nitrosourea (ENU) pode ser usado para aumentar a instabilidade do genoma. Apesar de ambas as abordagens podem significativamente de sHorten o tempo para atingir os clones resistentes e seguimento de sequenciação, ensaio funcional rigorosas deve ser realizada em genes candidatos como um maior número de não-funcional, mutações de passageiros é provável que surjam. SNVS pode ser posto ordenou para maximizar as chances de identificação de mutações funcionalmente relevantes. Em primeiro lugar, escolha dessas mutações que são recorrentes em clones independentes vai aumentar a probabilidade de estas mutações são drivers de resistência. No caso mutações recorrentes não são identificados, concentrando-se em SNVS que se encaixam no mecanismo de acção do fármaco (por exemplo, o alvo da droga ou um efector a jusante do conhecido fármaco alvo) pode ser significativa. Em última análise, o padrão-ouro é sempre a avaliação experimental da atividade de resistência concessão dos SNVS candidatos por expressão cDNA ectópica em células parentais sensíveis à droga. DNA vs RNA seqüenciamento Uma vez que os clones resistentes foram gerados, ADN e / ou ARNpode ser sequenciado de acordo com a necessidade. A sequenciação de ADN, quer exome ou todo o seqüenciamento do genoma, permitirá a identificação de germinativas e somáticas variantes, tais como SNPs, indels e número do exemplar variantes. Considerando que o mais exome seqüenciamento custo-friendly centra-se na geração lê a partir de regiões codificantes conhecidos, todo o seqüenciamento do genoma irá gerar dados de seqüenciamento de todo o genoma que possam facilitar a identificação de mutações em elementos não-codificantes, como potenciadores ou miRNAs 36. No entanto, uma vez que a expressão do gene de dados não é calibrada durante a sequenciação de ADN, é difícil prever qual a mutação (ões) é provável que seja um condutor funcional. A este respeito, a sequenciação de ARN, ainda mais dispendiosos, oferece esta vantagem. O facto de que a mutação de chamada é realizada apenas em espécies de ARN expressas aumenta a probabilidade de que a mutação de interesse pode ser um condutor funcional. Além de permitir uma pesquisa mais focada de mutações para testes funcionais de seguimento, RNA sequenciamento tambémoferece a vantagem adicional de ser capaz de identificar alterações no gene expressão, splicing alternativo e novas espécies de RNA quiméricos, incluindo fusões de genes que podem também servir como motoristas potentes de resistência. Pipeline de Bioinformática Comandos de exemplo são fornecidos para fins de ilustração, mas uma documentação mais detalhada e tutoriais estão disponíveis a partir do Broad Institute 16 e devem ser lidas cuidadosamente antes de começar a análise NGS. Os comandos a seguir são projetados para um ambiente UNIX shell em um sistema no qual todas as ferramentas e dados de referência ter sido pré-instalado. Estes comandos também assumir FASTQ arquivos contendo seqüência emparelhados-end lê a partir de duas amostras, com o nome &quot;parental&quot; e &quot;resistentes&quot;, foram recebidas do fornecedor e colocado no diretório &quot;data&quot;. Na maioria dos casos, esses comandos devem ser adaptadas ou optimizados para uma aplicação específica usando arg de linha de comando adicionaldo- (por exemplo, acrescentando &quot;-t 8&quot; para o comando BWA permite o funcionamento de vários segmentos por 8 núcleos de CPU). Grupos de leitura (que atribuem alinhamentos de amostras biológicas), muitas vezes deve ser adicionado a arquivos BAM, mesmo se houver apenas uma amostra por arquivo bam, a fim de cumprir com os requisitos de formato de arquivo para certas ferramentas. Leia parâmetros do grupo RGID, RGSM, RGPL, RGPU, e RGLB podem ser strings arbitrárias descrevendo o nome da amostra, plataforma de sequenciamento e estratégia biblioteca. In vitro vs ensaios in vivo Apesar de vários mecanismos de resistência identificados por seleção in vitro foram verificados para ser clinicamente relevante, existe uma possibilidade de que os mecanismos não podem servir como mecanismos relevantes ou predominantes de resistência clínica. Uma razão para isto pode incluir um papel essencial para o micro-ambiente na condução resistência à terapia, um componente que é desprovida no protocolo experimental / d configuraçãoiscussed até agora. De facto, vários estudos têm demonstrado que os agentes anti-cancro que são capazes de matar células tumorais são alteráveis ​​quando as células tumorais são cultivadas na presença de células estromais que implica mecanismos inatos de resistência conferida pelo estroma 37,38. Para identificar esses mecanismos de resistência adquirida induzida pelo estroma, pode-se considerar a realização in vitro de co-cultura ou em ensaios de resistência do tumor in vivo. Uma vez que o ensaio anterior é bastante complexo, muitos têm recorrido a geração de xenoenxertos de tumores resistentes aos medicamentos para tratar o papel potencial do estroma na resistência ao avanço. Tais estudos revelaram ambos os únicos 5 e 39 idênticas mecanismos de resistência relativa à selecção in vitro, o que implica que o estroma podem de facto, desempenhar um papel no último. No entanto, é preciso estar atento ao período de tempo que pode demorar para gerar tais tumores resistentes e da complexidade do acompanhamento genômica análise complexitie-s por causa da heterogeneidade molecular e celular intra-tumoral. A identificação do alvo Além de revelar os mecanismos de resistência a drogas, esta abordagem baseia-perfilamento genómico NGS também pode ser aplicado para identificar alvos celulares de sondas químicas. Historicamente, vários métodos imparciais têm sido usados ​​para identificar os mecanismos celulares de ação e metas de produtos químicos de baixo peso molecular com atividades biológicas, incluindo a purificação por afinidade, juntamente com a proteômica quantitativa, métodos genómicas de levedura, triagem RNAi, e inferência computacional abordagens 40. Como uma extensão para a elucidação dos mecanismos de resistência a drogas usando perfil genômico ou transcriptomic baseado em NGS de populações de células fenotipicamente resistentes, identificação de variações exclusivas recorrentes de nucleotídeo único (SNVS) ou alterações de expressão que permitem resistência pode oferecer insights sobre alvos celulares funcionais dos compostos. To baseia-se na ideia de que um subconjunto de mecanismos de resistência observado pode envolver mutações recorrentes em genes que codificam as proteínas alvos directos da molécula pequena. Recentemente, vários relatórios validou a utilidade da abordagem, particularmente através da combinação com outras abordagens, incluindo em grande escala de células de cancro A linha de perfil de sensibilidade, para revelar os alvos celulares de pequena molécula sonda 9,10.

Caracterização molecular detalhada de genomas de tumor por tecnologias de sequenciação e robustas ferramentas analíticas melhorada dados levou à descoberta de alterações genéticas importantes em tipos específicos de cancro 1,2. Desenvolvimento de terapias específicas destinadas a essas alterações genéticas, como HER2, BCR-ABL, EGFR e ALK, melhoraram significativamente a qualidade de vida dos pacientes 1,2. No entanto, apesar da especificidade desta abordagem, a resposta clínica para a maioria das terapias individuais tem sido sub-óptima em última análise, como a resistência emerge. Recentemente, progressos significativos foram feitos na compreensão das bases moleculares de resistência à terapêutica alvejados. Curiosamente, torna-se evidente que um mecanismo importante de resistência envolve a atividade de destino / caminho persistente. Como um caso em apreço, receptor de andrógeno (AR) -directed tratamento enzalutamida de câncer de próstata leva ao enriquecimento de mutações ativadoras em si AR, mantendo outp de sinalização ARut na presença de inibidor a 3-5. Este conhecimento tem conduzido a uma campanha agressiva para 1) desenvolver antagonistas da terceira geração que pode continuar a suprimir tanto a WT e função mutante-AR em enzalutamida resistente CaP 3 e 2) identificar potenciais gânglios a jusante de sinalização de AR que pode ser alvo de intervenção terapêutica . Da mesma forma, a resistência a outras classes de inibidores tais como aquelas voltadas para EGFR, BRAF e ABL muitas vezes levar a mutações que reativam a quinase via viciante original é 1. Com o conhecimento de que a resistência surge inevitavelmente na maioria dos pacientes, desenvolvendo abordagens para rapidamente trazer esses mecanismos à luz permitirá o desenvolvimento de terapias de acompanhamento eficazes. Uma abordagem que está sendo amplamente utilizado é o de analisar a genômica dos tumores refratários clínicos em relação aos tumores sem tratamento prévio ou sensível a para identificar enriquecimentos / depleções em lesões genéticas que podem ser passíveis de ddescoberta tapete. Apesar de sua promessa, existem duas principais passivos dessa abordagem que dificultam a descoberta rápida. Em primeiro lugar, ganhando acesso oportuno a material de tumor para interrogatório genômica pode servir como um obstáculo significativo na mudança de terapia para curar. Em segundo lugar, desconvolução da miríade de lesões genéticas na configuração resistente pode ser um desafio uma vez que os tumores podem apresentar heterogeneidade intratumoral significativa 6,7. À luz destes desafios, tem havido um aumento da confiança na descoberta pré-clínica de mecanismos de resistência. Esta abordagem pode permitir a identificação de mecanismos de resistência proeminentes antes dos ensaios clínicos 1 que podem nortear estratégias alternativas de gestão clínica naqueles pacientes que carregam esses mecanismos, quer antes ou após o início da terapia de resistência. Uma dessas ferramentas descoberta pré-clínica que está sendo amplamente utilizado é aplicar imparciais telas de RNAi funcionais. Para o exameple, Whittaker e colegas aplicaram uma tela de RNAi genoma escala para identificar que a perda de NF1 medeia a resistência aos inibidores da RAF e MEK através MAPK sustentada ativação da via 8. Estes resultados foram encontrados como sendo clinicamente relevante, como a perda de função mutações em NF1 foram observados em células tumorais BRAF -mutant que são intrinsecamente resistentes à inibição da RAF e em tumores de melanoma resistentes à activação Vemurafenibe 8. No entanto, apesar do sucesso desta abordagem, muitos alvos clinicamente relevantes são frequentemente não identificada, presumivelmente devido à polarização por perda de função desta abordagem. Em contraste, uma ferramenta para a descoberta de menos parcial pré-clínico de mecanismos de resistência envolve a geração de linhas celulares resistentes após exposição prolongada ao composto de interesse juntamente com perfis genómico ou transcriptómica baseado no NGS. Esta abordagem tem sido implementada com sucesso por vários grupos para identificar espontâneavariantes de nucleótidos únicos ou recorrentes alterações de expressão que permitem a resistência 5,9,10. Por exemplo, uma mutação F876L recorrente em AR foi recentemente descoberto em clones resistentes in vitro 3-5 e em tumores de xenoenxerto in vivo 5 antes da identificação desta mutação na clínica 4. Muito recentemente, Bangue e colegas (2015) 11 utilizado ClonTracer em dois modelos clinicamente relevantes para mostrar que a maioria dos clones resistentes que surgem durante a exposição prolongada do fármaco fizessem parte de uma sub-população pré-existente que sugere que a maior parte funcionalmente relevantes mutações já são susceptíveis pré-existente que se tornam selecionado para durante a seleção de 11. Em contraste com o perfil genômico de tumores discutido anteriormente, esta abordagem benefícios de menor heterogeneidade como clones resistentes &quot;homogéneos&quot; são usados ​​para facilitar a análise de dissecção genética mais precisa do potencial de condutores. Furthermminério, excitante, para além do potencial de revelar os mecanismos de resistência, este método pode também ser aplicado para identificar os mecanismos celulares de acção e alvos de pequenas moléculas bioactivas para o qual essa informação é desconhecido 10. Dadas as vantagens claras e os múltiplos usos desta abordagem, aqui apresentamos um protocolo detalhando a implementação bem sucedida de uma tela de tais pré-clínico para maximizar o potencial para descobertas clinicamente significativas.

<table><tbody><tr><td>Placas de 48 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86&nbsp;</td><td>Expandindo clones</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-588</td><td>Geração de curvas GI50</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>Teste de viabilidade</td></tr><tr><td>Discos de clonagem (3 mm)</td><td>Sigma</td><td>Z374431</td><td>Picking clones Pinças</td></tr><tr><td>estéreis</td><td>DF8088S</td><td>Unomedical</td><td>Picking</td></tr><tr><td>Clones RNeasy Plus Kit de extração de RNA</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Isolando RNA</td></tr><tr><td>Sangue e Tecido DNeasy kit de extração</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td>Isolando gDNA</td></tr><tr><td>GATK</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Indel realigner</td></tr><tr><td>MuTect</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Ferramenta de chamada de variante emparelhada</td></tr><tr><td>Oncotator</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Ferramenta de anotação de variantes</td></tr><tr><td>MutationAccessor</td><td>The Broad Ferramenta</td><td>de previsão de impacto funcional</td> do Instituto <td></td></tr></tbody></table>

implementação de<em&gt; in vitro</em&gt; droga de resistência ensaios: maximizar o potencial para descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Embora as terapias direcionadas sejam inicialmente eficazes, a resistência inevitavelmente surge. Vários métodos, como a análise genética de espécimes clínicos resistentes, têm sido aplicados para descobrir esses mecanismos de resistência para facilitar o acompanhamento. Embora essas abordagens tenham levado a descobertas clinicamente relevantes, as dificuldades em obter o material relevante do paciente ou em desconvoluir os dados genômicos coletados dessas amostras dificultaram severamente o caminho para a cura. Para esse fim, descrevemos aqui uma ferramenta para descoberta rápida que pode orientar a melhoria nas terapias de primeira linha e estratégias alternativas de manejo clínico. Ao acoplar a seleção pré-clínica de medicamentos in vitro ou in vivo com o sequenciamento de última geração, é possível identificar variações estruturais genômicas e/ou alterações na expressão gênica que podem servir como impulsionadores funcionais de resistência. Essa abordagem facilita o surgimento espontâneo de alterações, aumentando a probabilidade de que esses mecanismos possam ser observados nos pacientes. Neste protocolo, fornecemos diretrizes para maximizar o potencial de descoberta de variantes de nucleotídeo único que impulsionam a resistência usando linhas aderentes.

Para maximizar o potencial para a descoberta de controladores funcionais chave de resistência, selecionar clones de células únicas de expansão, o teste fenotípico e seqüenciamento. Como ilustrado na Figura 4A, as células HCT116 tratados durante um período prolongado com o composto citotóxico # 1 levou ao surgimento espontâneo de clones resistentes que continuaram a crescer durante o tratamento (círculos pretos tracejadas). Estes clones foram colhidos usando uma abordagem # destacadas na Figura 3 e, posteriormente, expandidos para análise fenotípica. Como mostrado na Figura 4B, os clones resistentes a todos os 1-3 apresentaram uma resistência significativa ao composto n ° 1 e a sua estreita composto análogo # 2 (maior viabilidade / crescimento), ao passo que todos os clones mostrou sensibilidade a um composto citotóxico VELCADE não relacionado. Após a confirmação da resistência fenotípica, gDNA foi isolado e submetido à análise de sequenciação de todo-exome. Ferramentas de bioinformática foram aplicadas para reduzir em no dessas variantes estruturais quesão: 1) recorrente e 2) têm o potencial de impacto funcional (Figura 5A). Variantes estruturais que conheci estes dois critérios foram confirmados por uma ferramenta de seqüenciamento independente. Tal como ilustrado na Figura 5B, uma mutação sem sentido heterozigótica que foi identificado utilizando-exome toda a sequenciação foi confirmada utilizando o método de sequenciação de Sanger (painel superior, sequência WT; painel inferior, sequência mutante). Após confirmação da sequência, a linha celular parental originalmente utilizado para o ensaio de resistência foi geneticamente manipulada para expressar o ADNc mutante para confirmar funcionalmente o papel da mutação. Tal como ilustrado na Figura 6, enquanto que a sobre-expressão de cDNA falhou o WT para conferir resistência, a expressão do ADNc mutante conferida significativamente a resistência fenotípica forçado para o composto # 1, confirmando o papel funcional desta variação estrutural, como um condutor de resistência. Todos os reagentes utilizados para esta experiência são apresentadas na Tabela 1 </s<html> trong&gt;. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> Figura 1. Disposição de placas de ensaio e de controlo. Sombra azul, poços de tratamento de compostos. Sombra branca, único meio. Os compostos são diluídos em série 1: 4 e são administradas em triplicado (BD) ou, por exemplo. 2 compostos podem ser aplicados por placa. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> Figura 2. Curvas de viabilidade representativos. Linha ponteada representa Vermelho do eixo x dia 0 leitura. Indica o aumento das doses do composto para a direita e o eixo dos y representa a viabilidade relativa aos poços de controlo de DMSO. GI = 100 dose utilizada para atingir 100% de inibição de crescimento; IG 50 = dose utilizada para reduzir a viabilidade de 50% de controlo de DMSO. _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Duas abordagens para escolher clones resistentes para a expansão. Aproxime-se 1- uso pipeta de pegar e transferir clones bem definidas para placas de 48 poços. Abordagem 2- uso de tripsina-embebido discos de clonagem para levantar clones e transferidos para placas de 48 poços. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> Figura 4. Confirmação da resistência obtida em relação aos clones HCT116 para o composto # 1 in vitro. (A) o composto # 1 HCT116 clones resistentes surgiu na sequência contínua selecção de três semanas. (B) A viabilidade dos clones de controlo e resistentes foi testada após 72 horas de tratamento com vários compostos. Composto # 2 é um análogo próximo do composto # 1. Velcade foi utilizado como um agente de controlo citotóxico. Os dados são apresentados como média + desvio padrão de três réplicas biológicas. Figura 5. Identificação de uma mutação única ou recorrente (variantes de um único nucleótido, SNVS) no gene A em composto # 1 HCT116 clones resistentes. Fluxo (A) de trabalho para identificar SNVS presente em todos os clones resistentes e previsto para ter um impacto funcional alta por MutationAssessor. (B) A confirmação da mutação no gene A por Sanger Sequencing. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> Figura 6. Re-expressão do gene mutado Uma resistência conferida ao composto # 1 in vitro. Viabilidade das linhas celulares HCT-116 modificadas foi testada após 72 horas de tratamento com o composto # 1. Linhas celulares mutantes HCT116-WT ou são estavelmente expressando cDNAs WT ou mutantes de gene A, respectivamente. Os dados são apresentados como média + desvio padrão OF três réplicas biológicas. <table><tbody><tr><td> Nome Amostra </td><td> Aminoácido </td><td colspan="2"> Tecido primário </td><td> Zigosidade </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2"> cerviz </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2"> pele </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr> &lt;td&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2"> mama </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> LNCaP </td><td> P.? </td><td colspan="2"> próstata </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> LoVo </td><td> P.? </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> Skut-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2"> endométrio </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> Skut-1B </td><td> pL787fs * 11 </td><td colspan="2"> endométrio </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr></tbody></table> Tabela 1. MSH2 Linhas Celulares -mutated. A linha celular (nome da amostra), substituição de aminoácidos, a linhagem de origem e a zigosidade são indicados. <table><tbody><tr><td> Nome Amostra </td><td> Aminoácido </td><td colspan="2"> Tecido primário </td><td> Zigosidade </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> P.? </td&gt; <td colspan="2"> próstata </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2"> estômago </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> PR-Mel </td><td> P.? </td><td colspan="2"> pele </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> REH </td><td> P.? </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td&gt; <td> Homozygous </td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0? </td><td colspan="2"> ovário </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2"> intestino grosso </td><td> Homozygous </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2"> pâncreas </td><td> Heterozigotos </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Linhas Celulares -mutated MLH1. A linha celular (nome da amostra), substituição de aminoácidos, a linhagem de origem e a zigosidade são indicados.

A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

O objetivo geral deste procedimento é facilitar a descoberta pré-clínica rápida de variantes de nucleotídeo único clinicamente relevantes que possam funcionalmente induzir resistência a diversas classes de terapias. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de oncologia, como quais mutações gênicas podem contribuir para a resistência funcional a terapias clínicas, o que pode, em última instância, orientar a melhoria das terapias e estratégias alternativas de manejo clínico para pacientes resistentes a medicamentos. A principal vantagem desta técnica é que, ao promover o surgimento de mutações espontâneas e aplicar uma tecnologia de triagem imparcial em clones resistentes, há uma probabilidade maior de que essas variantes estejam induzindo a recidiva em terapias direcionadas na clínica.Um pesquisador muito talentoso do meu laboratório demonstrará o procedimento para avaliar a GI 50 de linhagens celulares. Prepare uma placa de ensaio semeando células em placas de fundo claro e não transparente de 96 poços com 100 microlitros de meio celular, conforme o mapa mostrado aqui.Prepare uma placa controle de maneira semelhante, adicionando células aos poços azuis e apenas meio aos poços brancos. Após incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite, equilibre o reagente luminiscente de viabilidade celular à temperatura ambiente e misture suavemente invertendo o frasco. Para obter uma solução homogênea, adicione 80 microlitros de reagente aos poços da placa controle e agite o conteúdo por 30 minutos.Para induzir a lise celular. Utilize um luminômetro com uma exposição de 0,1 a 1,0 segundo e um comprimento de onda de detecção de 560 nanômetros para registrar a luminiscência. Em seguida, para adicionar os compostos em teste às placas de ensaio, prepare uma série de diluições de um para quatro dos compostos em DMSO, começando com uma concentração de 2000 micromolar, totalizando 10 diluições.Em seguida, adicione os compostos diluídos em série ao meio para obter uma mistura de meio com compostos na concentração final 10 x. Armazene a placa com compostos a menos 20 graus Celsius para uso no terceiro dia do ensaio. A seguir, adicione 10 microlitros dos compostos diluídos às células em triplicata, de modo que a dose mais alta seja 10 micromolar.Incube as placas a 37 graus Celsius por três dias. No terceiro dia, prepare uma mistura de meio composto 400 microlitros um X utilizando as placas compostas preparadas três dias antes. Inverta as placas de ensaio para remover o meio e seque delicadamente em papel toalha para autoclave duas a três vezes.Adicione um composto x ao poço sombreado em azul e adicione 100 microlitros de meio aos poços periféricos para prevenir evaporação. No sexto dia, avalie o número relativo de células viáveis realizando a leitura de luminiscência conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Em seguida, calcule os valores de GI 50 utilizando software como o PRISM e, com os valores de GI 50 calculados, prepare as células para ensaios de resistência a fármacos.Se estiver trabalhando com um agente citostático, semeie as células com uma confluência de 30 a 40% em placas de cultura quadradas de 150 milímetros. Se estiver trabalhando com um agente tóxico, semeie as células com uma confluência de 70 a 80%. Após determinar as concentrações iniciais do composto de acordo com o protocolo descrito no texto, trate as células com os compostos em teste para compostos altamente tóxicos, que causam morte celular em um ensaio de viabilidade de seis dias.Inicie com a GI 50 e aumente incrementalmente a concentração a cada duas a três semanas até que resistência robusta seja observada. Para isolar clones de células individuais, utilize microscopia de contraste de fase com ampliação de 40 x para examinar a placa de cultura e identificar grupos viáveis de células no fundo da placa. Use uma caneta para marcar clones de tamanho médio e bem isolados de outras colônias, a fim de selecionar os clones utilizando uma pipeta P 200.Remova o meio de crescimento do recipiente e use um XPBS para remover quaisquer células flutuantes. Com a ponteira da pipeta, levante as colônias e transfira-as para os poços de uma placa de 48 poços contendo 50 microlitros de tripsina 0,25%, incubando a 37 graus Celsius por um a dois minutos. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio fresco com metade da concentração do composto para permitir a recuperação ideal das células.Para isolar os clones usando discos de clonagem de três milímetros, coloque os discos em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros contendo cinco mililitros de tripsina 0,25% EDTA por dois minutos. Em seguida, aspire o meio da placa contendo os clones resistentes e sobreponha os clones com os discos de clonagem embebidos em tripsina. Incube a 37 graus Celsius por um a dois minutos, dependendo da facilidade com que os clones se destacam das placas.Em seguida, utilizando pinças estéreis, pegue os discos de clonagem e transfira-os para placas de 48 poços contendo 200 microlitros de meio fresco, e com a concentração do composto, pipete suavemente para cima e para baixo a fim de desprender as células dos discos de clonagem e incubar a 37 graus durante a noite. No dia seguinte, remova os discos de clonagem, incube as células e então avalie a resistência ao fármaco. De acordo com o protocolo descrito no texto, conforme mostrado aqui, células HCT 116 tratadas por um período prolongado com o composto citotóxico número um levaram ao surgimento espontâneo de clones resistentes que continuaram a crescer durante o tratamento.Os clones foram selecionados utilizando um pipetador manual. Nesta figura, os clones resistentes um a três demonstraram resistência significativa ao composto número um e ao seu análogo próximo, composto número dois, enquanto todos os clones mostraram sensibilidade a um composto citotóxico não relacionado, Velcade. Após a confirmação da resistência fenotípica, o ADN genômico (GDNA) foi isolado e submetido à análise de sequenciamento de exoma completo.Variantes estruturais que foram recorrentes e tinham potencial de impacto funcional foram confirmadas por uma ferramenta de sequenciamento independente, como o sequenciamento de Sanger. Um exemplo mostrado aqui apresentava uma mutação de sentido trocado heterozigótica, e a linhagem celular parental foi posteriormente modificada para expressar o cDNA mutado. Enquanto a superexpressão do cDNA do tipo selvagem não conseguiu conferir resistência ao fármaco.O CD NA mutante conferiu significativamente resistência fenotípica ao composto número um, confirmando o papel funcional da variação estrutural como fator determinante da resistência. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver crescimento espontaneamente resistente para identificar genes responsáveis pela resistência a medicamentos em células cancerígenas após seu desenvolvimento. Esta técnica abre caminho para que pesquisadores na área de oncologia explorem mecanismos de resistência a medicamentos de maneira imparcial, tanto em linhagens celulares cancerígenas quanto em modelos animais.

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