Implementação de In Vitro Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

O objetivo geral deste procedimento é facilitar a descoberta pré-clínica rápida de variantes de nucleotídeo único clinicamente relevantes que podem conduzir funcionalmente à resistência a várias classes de terapias. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oncologia, como quais mutações genéticas podem contribuir para a resistência funcional às terapias na clínica que podem, em última análise, orientar a melhoria nas terapias e estratégias alternativas de manejo clínico para pacientes resistentes a medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que, como estamos facilitando o surgimento de mutações espontâneas e aplicando uma tecnologia de triagem imparcial em clones resistentes, há uma probabilidade maior de que essas variantes estejam impulsionando terapias direcionadas à recidiva na clínica.

Demonstrando o procedimento será um investigador muito talentoso do meu laboratório Para avaliar o GI 50 para linhas celulares. Prepare uma placa de ensaio semeando células em transparente não transparente. Placas de 96 poços inferiores em 100 microlitros de meio celular de acordo com o mapa mostrado aqui.

Prepare uma placa de controle de maneira semelhante, adicionando células aos poços azuis e apenas médias aos poços brancos. Depois de incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite, equilibre o reagente de viabilidade celular luminescente à temperatura ambiente e misture suavemente invertendo. Para obter uma solução homogênea, adicione 80 microlitros de reagente aos poços da placa de controle e agite o conteúdo por 30 minutos.

Para induzir a lise celular. Use um luminômetro com uma exposição de 0,1 a 1,0 segundos e um comprimento de onda de detecção de 560 nanômetros para registrar a luminescência. Em seguida, para adicionar os compostos de teste às placas de ensaio, faça uma série de uma diluição em cada quatro de compostos em DMSO, começando com uma concentração micromolar de 2000 para um total de 10 diluições.

Em seguida, adicione os compostos diluídos em série ao meio para fazer uma mistura de meio composto a uma concentração final de 10 x. Armazenar a placa composta a menos 20 graus Celsius para utilização no terceiro dia do ensaio. Em seguida, adicione 10 microlitros dos compostos diluídos às células em triplicata, de modo que a dose mais alta seja de 10 micromolares.

Incube as placas a 37 graus Celsius por três dias. No terceiro dia, prepare uma mistura de 400 microlitros de um composto X usando as placas compostas preparadas três dias antes. Inverta as placas de ensaio para remover o meio e seque em toalhas de papel de autoclave duas a três vezes.

Adicione um composto x ao poço sombreado em azul e adicione 100 microlitros de poços médios a perímetro para evitar a evaporação. No sexto dia, avalie o número relativo de células viáveis fazendo a leitura de luminescência, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Em seguida, calcule os valores de GI 50 usando um software como o PRISM, usando os valores calculados de GI 50, configure as células para ensaios de resistência a medicamentos.

Se estiver trabalhando com um agente citostático, as células da semente a 30 a 40% confluem em placas de cultura quadradas de 150 milímetros. Se estiver trabalhando com um agente tóxico, veja as células em 70 a 80% de confluência. Depois de determinar as concentrações iniciais dos compostos de acordo com o protocolo de texto, trate as células com os compostos de teste para compostos altamente tóxicos, que causam a morte celular em um ensaio de viabilidade de seis dias.

Comece com o GI 50 e aumente gradualmente a concentração a cada duas ou três semanas até que uma resistência robusta seja observada. Para isolar clones de células únicas, use microscopia de contraste de fase com ampliação de 40 x para examinar a placa de cultura e identificar aglomerados viáveis de células no fundo da placa. Use uma caneta para marcar clones de tamanho médio e bem isolados de outras colônias para escolher clones usando uma pipetadora P 200.

Remova o meio de crescimento do prato e use um XPBS para enxaguar todas as células flutuantes. Com a ponta da pipeta, levante os clones e transfira para os poços de uma placa de 48 poços contendo 50 microlitros de 0,25% de tripsina incubar a 37 graus Celsius por um a dois minutos. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio fresco com metade da concentração do composto para permitir a recuperação ideal das células.

Para isolar os clones usando discos de clonagem de três milímetros, coloque os discos em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros contendo cinco mililitros de 0,25% de tripsin EDTA por dois minutos. Em seguida, aspirar o meio da placa que contém os clones resistentes e sobrepor os clones com os disparos e os discos de clonagem embebidos. Incube a 37 graus Celsius por um a dois minutos, dependendo da facilidade com que os clones se levantam das placas.

Em seguida, usando uma pinça estéril, pegue os discos de clonagem e transfira para placas de 48 poços com 200 microlitros de meio fresco, e faça com que a concentração do composto pipete suavemente para cima e para baixo para desalojar as células dos discos de clonagem e incubar a 37 graus durante a noite no dia seguinte, remova os discos de clonagem, incube as células, em seguida, avalie a resistência aos medicamentos. De acordo com o protocolo de texto, como mostrado aqui, HCT uma 16 células tratadas por um período prolongado com citotóxico. O composto número um levou ao surgimento espontâneo de clones resistentes que continuaram a crescer durante o tratamento.

Os clones foram colhidos usando um pipeta homem. Nesta figura, os clones resistentes de um a três demonstraram resistência significativa ao composto número um e seu composto análogo próximo número dois, enquanto todos os clones mostraram sensibilidade a um composto citotóxico não relacionado. Velcade. Após a confirmação da resistência fenotípica, o GDNA foi isolado e submetido à análise de sequenciamento completo do exoma.

As variantes estruturais recorrentes e com potencial de impacto funcional foram confirmadas por uma ferramenta de sequenciamento independente, como o sequenciamento de Sanger. Um exemplo mostrado aqui carregava uma mutação missense heterozigótica, e a linha celular parental foi posteriormente projetada para expressar o CDNA mutado. Considerando que a superexpressão do tipo selvagem CDNA não conferiu resistência aos medicamentos.

O mutante CD NA conferiu significativamente resistência fenotípica ao composto número um, confirmando o papel funcional da variação estrutural como condutor da resistência. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver o crescimento resistente espontâneo para rastrear genes responsáveis pela resistência a medicamentos em células cancerígenas após seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para que pesquisadores no campo da oncologia explorem os mecanismos de resistência a medicamentos de maneira imparcial em linhagens de células cancerígenas e modelos animais.