Name: Estabelecimento de um clinicamente relevantes Ex Vivo Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprenda a criar um modelo ex vivo de cirurgia de catarata simulada usando embriões de galinha para estudar a reparação de feridas epiteliais em seu microambiente nativo. Este método permite observar processos de cicatrização em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant para A.S.M. (EY021784).

O protocolo a seguir está em conformidade com os Animal Care Institucional e Comitê de Uso orientações Thomas Jefferson University e com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Vision Research. 1. Configuração e Preparação de Lentes de Cultura Ex Vivo de Feridas <ol><li> Coloque três pratos de 100 mm de petri em um estéril, capela de fluxo laminar. Encha duas das placas de Petri até meio com tampão Tris / dextrose (tampão TD; 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na 2 PO 4, 5 mM de D-glucose, 8,25 mM de Tris base, pH a 7,4 com HCl) à TA , deixando a terceira vazio. Meios de cultura de pré-aquecer (Media suplementado com 199, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina / estreptomicina) a 37 ° C. Nota: O padrão de cura de feridas é o meio de cultura isento de soro, como ocorre in vivo; no entanto, as culturas de reparação da ferida podem ser cultivadas com sucesso em condições de meios definidos, que incluem soro ou outros factores. </li><li> Remover fértil d embrionárioay 15 clara de ovo pintainho leghorn da incubadora (realizada em 37,7 ° C com agitação suave) </li><li> Coloque o ovo selecionado na capela de fluxo laminar e limpo fora do shell com etanol a 70% a partir de um frasco de lavagem. Realizar todos os procedimentos a seguir em condições de assepsia na câmara de fluxo laminar, usando soluções e instrumentos estéreis. </li><li> Craque conteúdo dos ovos e colocar no vazio 100 milímetros placa de Petri. Decapitar embrião usando uma pinça e tesouras padrão finas. Coloque a cabeça de embrião de pinto em uma placa de Petri contendo tampão de TD e descartar adequadamente o restante do embrião. Opcionalmente manter as cabeças de embrião de pinto em tampão de TD por um curto período de tempo, não mais do que 15 min. </li><li> Coloque a cabeça de embrião de galinha em uma tampa de placa de Petri. Utilizando uma pinça de alta precisão, remova a lente junto com seu humor vítreo do olho ligados na seguinte sequência. Comprima a parte posterior do olho com a pinça para criar uma pequena abertura na parte posterior do olho. </li><li> Em seguida, segure o humor vítreo with fórceps e puxar suavemente no vítreo com um movimento de rolamento, o vítreo com a lente vai ser ligado desalojado do olho. Lugar da lente / vítreo na placa de Petri contendo tampão restante TD. Permitir que as lentes permaneçam em tampão TD durante o período de 30 min. </li><li> Mover a lente para uma nova tampa de placa de petri sob um microscópio de dissecação. Deste ponto em diante executar todas as etapas sob um microscópio de dissecação. Com uma pinça de alta precisão cuidadosamente afastar qualquer corpo ciliar (células pigmentadas) que foram desalojados com a lente usando a ponta da pinça, tomando cuidado para não danificar o tecido da lente. Nota: A remoção do corpo ciliar assegura que os tipos de células que não são endógenos às lentes não estão incluídos na cultura da reparação da ferida. </li><li> Separa-se a lente do humor vítreo com uma pinça de alta precisão por beliscar fora do corpo vítreo de sua associação com a cápsula posterior do cristalino. </li><li> Usando alta precisão forceps transferir a lente em uma pequena gotade tampão de TD (cerca de 200 ul) num prato de cultura de tecidos 35 milímetros. </li></ol> 2. realização de cirurgia de catarata Mock <ol><li> Orientar a lente na gota de tampão de TD no prato de 35 mm com o aspecto anterior da lente voltada para cima. Nota: A anterior da lente pode ser facilmente identificados pela presença de um anel denso no tecido que regista a fronteira entre a região anterior e equatorial do epitélio da lente. Em contraste, há uma ausência de marcas sobre a parte posterior da cápsula da lente para que as células das fibras da lente estão ligados. </li><li> Usando duas pinças de alta precisão fazer uma pequena incisão (aproximadamente 850μm) no centro da cápsula anterior da lente, a espessura da membrana basal que circunda a lente de tecido, e a sua associada epitélio anterior do cristalino, por agarrar o tecido com uma pinça em cada mão e puxando suavemente em direções opostas. </li><li> Remover a massa celular da fibra, que constitui a maior parte do tecido da lente, dislodging-lo de suas ligações com o epitélio da lente e circundante cápsula do cristalino por hydro-eluição (uma abordagem usada em cirurgia de catarata clássico, modelado na Figura 1A). </li><li> Encher uma seringa de 1 mL com uma ponta de agulha de 27,5 L com 300 ul de tampão de TD. Inserir a ponta da agulha dentro da incisão feita na cápsula anterior do cristalino, e cerca de metade para a lente. </li><li> Pressione levemente a seringa injetar o tampão TD na massa celular fibra lente. Injectar entre 50 e 200 ul TD, e nunca mais de 300 ul. Observe a massa celular fibra soltando-se do epitélio e lente cápsula. </li><li> Utilizando uma pinça de alta precisão, retire a massa celular fibra soltos da lente através do local da incisão anterior. Nota: Este procedimento deixa a cápsula posterior do cristalino membrana basal ao qual as células de fibra tinha sido anexado desnudada de células, e um epitélio da lente ferido apenas adjacente a este site. </li></ol> 3. Preparing o Lens Ferido para Ex Cultura Vivo <ol><li> Nivelar o saco capsular da lente, que resulta da cirurgia da catarata descrito acima no prato de cultura, o lado das células para cima, fazendo cinco cortes na face anterior do saco capsular. </li><li> Corte perpendicular ao local da incisão original através do equador do cristalino. Achate as resultantes cinco &quot;retalhos&quot; da cápsula do cristalino com epitélio anexado no lado da cultura cápsula prato para baixo, celular voltado para cima. Note-se a lente ex vivo feridos agora deve assumir uma forma em estrela ou flowerlike (ver Figura 1B). </li><li> Para fixar a cápsula para o prato, pressione suavemente para baixo com a pinça em cada ponto da estrela. Isso fará com que um pequeno recuo para as cinco dicas mais fora do explante e resultar em anexo sustentado para o prato. Nota: É possível danificar a cápsula durante este processo e por isso é importante para assegurar que a cápsula se o prato mais próximo possível das pontas das flaPS quanto possível, bem como para tornar a menor quantidade de pontos de fixação quanto possível (em geral duas, máximo de três por retalho). </li><li> Remover o tampão de TD no prato de 35 mm e substituí-la com 1,5 ml de meio de pré-aquecido. Cobrir o prato de 35mm com a sua tampa e lugar na incubadora (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol> 4. Separação da Zona de Migração Central (CMZ), onde Re-epitelização da área ferida do Posterior Capsule Ocorre, do anexo original Zone (OAZ) de lente células epiteliais, para análise quantitativa. Nota: As células começam a mover-se para a região de CMZ imediatamente em resposta à lesão. Por um dia em cultura células suficientes estão migrando através do CMZ para análise molecular e bioquímica, após a separação da CMZ eo OAZ por micro-dissecção 23. Este protocolo envolve a remoção de uma aba (OAZ) de cada vez a partir da área ferida da cápsula. <ol><li> Observar uma demarcatião, claramente visíveis ao microscópio de dissecação, e entre o OAZ CMZ (ver Figura 2A). Usando duas pinças de alta precisão, agarrar com as duas pinças na extremidade da linha OAZ / CMZ, apenas um lado para o outro, em ambos os lados da linha (ver figura 2A, B, seta). </li><li> Usando uma mão / um fórceps no lado da CMZ continuar a sustentar a cultura feridos, enquanto com a outra mão / pinça, puxe o OAZ ao longo da linha OAZ / CMZ. O CMZ facilmente se separa do OAZ ao longo desta linha. Continue ao longo desta linha em torno de toda a cultura até que as duas regiões são completamente separados. </li><li> Estude as fracções separadas OAZ e CMZ para a análise molecular, tais como 24 ou bioquímica análise de RNA-Seq como western blot ou co-imunoprecipitação 23,25. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui é descrita uma técnica para preparar um modelo de cultura de reparo de feridas que envolve a realização de uma cirurgia de catarata ex vivo em lentes de embriões de galinha após sua remoção do olho. O epitélio do cristalino responde a essa ferida clinicamente relevante com um processo de reparo que imita de perto o que ocorre in vivo e compartilha características com o reparo da ferida em outros tecidos epiteliais2,4. Embora o protocolo seja direto e simples de seguir, a realização de um...

A, a cirurgia de catarata simulada clinicamente relevante, ex vivo epitelial modelo cicatrização de feridas aqui descrito foi desenvolvido para fornecer uma ferramenta para investigar os mecanismos que regulam a reparação de tecidos epiteliais, em resposta a uma lesão. Os principais recursos que foram destinados para na criação deste modelo incluiu uma condições) que prevêem que de perto replicados a resposta in vivo para ferindo em uma configuração de cultura, 2) facilidade de modular os elementos reguladores de reparação, e 3) capacidade de imagem do processo de reparação, na sua totalidade, em tempo real. O desafio, portanto, era criar um modelo de cultura em que foi possível estudar e manipular, reparação epitelial no microambiente nativo das células. A disponibilidade deste modelo ferida-reparação abre novas possibilidades para identificar os sinais de sinalização endógenas de matriz proteínas, citocinas e quimiocinas, que regulam o processo de reparação. Além disso, o modelo é ideal para examinar como umn epitélio é capaz de mover-se como uma folha colectivo para re-epithelialize área da ferida 2,3, e para determinar a linhagem de células mesenquimais líder no bordo da ferida que funcionará em colectivo dirigir a migração do epitélio ferido 4. Este modelo também fornece uma plataforma com a qual identificar terapêuticas que possam promover a cicatrização de feridas eficaz e evitar que a reparação de feridas aberrante 5. Há já uma série de modelos ferida de reparação disponíveis, tanto em cultura e in vivo, que forneceram a maioria do que se sabe sobre o processo de reparação ferida hoje. Em modelos animais de lesão, tais como a córnea 6-12 e 13-17 da pele, há a oportunidade para estudar a resposta do tecido do ferimento no contexto de todos os mediadores de reparo que podem estar envolvidos no processo, incluindo contribuições do vasculatura e no sistema nervoso. No entanto, existem limitações para manipular a expericondições mentais in vivo, e ainda não é possível realizar estudos de imagem da resposta de reparação in vivo, de forma contínua ao longo do tempo. Em contraste, a maioria dos modelos de cultura in vitro de reparação de feridas, tais como a ferida zero, pode ser facilmente manipulada e seguido ao longo do tempo, mas falta o contexto ambiental de estudar a cicatrização de feridas no tecido in vivo. Enquanto ex vivo em modelos oferecem a vantagem de estudar o processo de reparação da lesão de forma contínua ao longo do tempo no contexto da microambiente das células juntamente com a capacidade para modular os reguladores moleculares de reparação em qualquer ponto de tempo no processo, existem poucos modelos que se encaixam estes parâmetros. Aqui é descrito um procedimento para gerar altamente reprodutível ex vivo epitelial culturas que reproduzem a resposta de um tecido epitelial a um ferimento fisiológico cura. Usando a lente de embrião de galinha como uma fonte de tecido, um ex vivo mock cirurgia de catarata é realizada. A lente é um tecido ideal para usar para esses estudos, uma vez que é auto-suficiente dentro de uma cápsula de membrana basal espessa, avascular, não inervados, e livre de qualquer estroma associada 18,19. Na doença humana, a cirurgia da catarata aborda a perda de visão devido a opacificação da lente, e envolve a remoção da massa celular da fibra da lente, o qual compreende a maior parte da lente. Seguindo a visão cirurgia de catarata é restaurada através da inserção de uma lente intra-ocular artificial. O procedimento de cirurgia de catarata, através da remoção das células da fibra, induz uma resposta a uma lesão no epitélio do cristalino adjacente, que responde por re-epitelialização da área posterior da cápsula da lente que tinha sido ocupada pelas células de fibra. Na cirurgia de cataratas, como na maioria das respostas de reparação de ferida, há por vezes ocorre um resultado de fibrose aberrante para a resposta de cicatrização das feridas, associado com o aparecimento dos miofibroblastos, em que a lente é conhecido como posterior Capsule Opacificação 20-22. Para gerar o modelo de cicatrização de feridas cirurgia de catarata, um procedimento de cirurgia de catarata é imitado em lentes removidas do olho de embrião de pinto para produzir uma lesão fisiológica. Remoção microcirúrgico da fibra lente células resulta em uma área de ferida circular muito consistente rodeado pelas células epiteliais da lente. Esta população de células permanece firmemente ligado à cápsula membrana basal da lente e é ferido pelo procedimento cirúrgico. As células epiteliais migrar para a área desnudo da membrana basal endógena para curar a ferida, liderada por uma população de células mesenquimais rico em vimentina conhecidas no processo de reparação como células líder um. Com este modelo, a resposta de um epitélio de lesão pode ser visualizada facilmente seguido e com o tempo no contexto do microambiente das células. As células são facilmente acessíveis a alteração da expressão ou activação de moléculas que se espera que desempenham um papel na reparação de feridas. Um poderoso recurso do thé o modelo é a capacidade de isolar e estudar alterações específicas do migração no âmbito da cicatrização de feridas. A capacidade para preparar um grande número de envelhecidos ex vivo de cura de feridas culturas combinadas para estudos é outra vantagem deste modelo. Assim, este sistema modelo proporciona uma oportunidade única de provocar uma separação mecanismos de reparo de feridas e terapêutica de teste para o seu efeito sobre o processo de cicatrização de feridas. O modelo de cirurgia de catarata ex vivo simulada deverá ter ampla aplicabilidade, fornecendo um recurso crítico para o estudo de mecanismos de reparação do prejuízo.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Uso a 140 mM em tampão TD</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>Uso a 5 mM em tampão TD</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>Uso a 0,7 mM em tampão TD</td></tr><tr><td>D-glicose (Dextrose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td>Use a 0,5 mM em tampão TD</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Use a 8,25 mM em tampão TD</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Use para pH TD tampão a 7,4</td></tr><tr><td>Mídia 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning/CellGro</td><td>25-005-CI</td><td>Uso a 1% em Media199</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Corning/ CellGro</td><td>30-002-CI</td><td>Uso a 1% em placas de Petri Media199</td></tr><tr><td>100 mm</td> Unidade <td>de</td> Filtro <td>Fisher Scientific</td> FB0875711Z <td></td></tr><tr><td>Stericup</td><td>Millipore</td><td>SCGPU01RE</td><td>Use para filtrar e esterilizar</td></tr><tr><td>Mídia Pinça Dumont #5 (precisa de 2)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1 ml Ponta Deslizante com agulha de deslizamento de precisão</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps Padrão</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Outros Itens Necessários: Instrumentos de dissecação geral,&nbsp; ovos de galinha leghorn brancos férteis, verifique a incubadora de ovos (umidificado, 37.7&deg; C), capa de fluxo laminar, microscópio</td><td></td><td></td><td></td> de dissecação de estereovisão binocular</tr></tbody></table>

estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; ex vivo</em&gt; mock cataract surgery modelo para investigar epithelial wound repair em um microambiente native

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

O principal impedimento para entender como um tecido epitelial executa o reparo de feridas é a disponibilidade limitada de modelos nos quais é possível acompanhar e manipular a resposta da ferida ex vivo em um ambiente que imita de perto a lesão do tecido epitelial in vivo. Essa questão foi abordada com a criação de um modelo de reparo de lesão epitelial ex vivo clinicamente relevante baseado na cirurgia de catarata. Neste modelo de cultura, a resposta do epitélio do cristalino à ferida pode ser acompanhada ao vivo no microambiente nativo das células, e os mediadores moleculares do reparo da ferida podem ser facilmente manipulados durante o processo de reparo. Para preparar as culturas, as lentes são removidas do olho e uma pequena incisão é feita na parte anterior do cristalino, da qual a massa interna das células da fibra do cristalino é removida. Este procedimento cria uma ferida circular na cápsula posterior do cristalino, a espessa membrana basal que envolve o cristalino. Esta área da ferida onde as células da fibra foram fixadas está localizada adjacente a uma monocamada contínua de células epiteliais do cristalino que permanece ligada à cápsula do cristalino durante o procedimento cirúrgico. O epitélio ferido, o tipo de célula do qual as células fibrosas são derivadas durante o desenvolvimento, responde à lesão da remoção das células fibrosas movendo-se coletivamente pela área da ferida, liderada por uma população de células de reparo ricas em vimentina cujos progenitores mesenquimais são endógenos ao cristalino1. Essas propriedades são típicas de uma resposta normal de cicatrização de feridas epiteliais. Neste modelo, como in vivo, o reparo de feridas depende de sinais fornecidos pelo ambiente endógeno que é mantido exclusivamente neste sistema de cultura ex vivo, proporcionando uma oportunidade ideal para a descoberta dos mecanismos que regulam o reparo de um epitélio após a ferida.

Ex Vivo Modelo criado para estudar o processo de cicatrização da ferida no microambiente das células nativas Para investigar os mecanismos envolvidos na regulação da cicatrização da ferida de um epitélio em microambiente das células nativas, um modelo de cirurgia de catarata clinicamente relevante ex vivo simulada foi criado. Este modelo é criada a partir de tecido da lente que oferece muitas vantagens, devido às suas propriedades intrínsecas: 1) A lente é um órgão auto-con...

Descrito aqui é o estabelecimento de um modelo de cirurgia de catarata simulada ex vivo clinicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de resposta à lesão de tecidos epiteliais dentro de seu microambiente nativo.

Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo clinicamente relevante no qual a reparação de feridas possa ser acompanhada em seu microambiente natural. Isso é realizado primeiramente removendo a lente do olho de um embrião de galinha. O segundo passo consiste em fazer uma pequena incisão na parte anterior da lente.Em seguida, elua por hidrólise a massa de células fibrilares do cristalino. Depois, a cápsula do cristalino com o epitélio associado é achatada mediante cortes adicionais na cápsula anterior. O passo final consiste em fixar a cultura lesionada à placa de cultura de tecidos, a fim de acompanhar a cicatrização da lesão conforme ela ocorre.Por fim, a microscopia com lapso de tempo, a microscopia confocal e a análise bioquímica são utilizadas para demonstrar os mecanismos de reparo de feridas em um modelo que recapitula de forma próxima o ambiente in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da cicatrização de feridas, como a forma pela qual as células se movem de maneira coordenada para fechar a ferida. Embora este método possa fornecer informações sobre o processo de reparo de feridas.Também pode ser aplicado a estudos de cicatrização de feridas ABER, particularmente fibrose e formação de cicatrizes. Comece colocando três placas de Petri de 100 milímetros em uma cabine de fluxo laminar estéril. Encha duas das placas de Petri até a metade com tampão tris dextrose à temperatura ambiente, deixando a terceira vazia.Em seguida, retire um ovo fértil de frango White Leghorn com 15 dias de desenvolvimento embrionário do incubador a 37,7 graus Celsius e limpe a parte externa da casca com etanol 70% para esterilizá-la. Em seguida, quebre cuidadosamente o ovo e coloque seu conteúdo no interior da placa de Petri de 100 milímetros vazia. Usando pinças comuns e tesoura fina, decepe o embrião e coloque a cabeça em um dos recipientes contendo o tampão de dextrose TST.Em até 15 minutos, transfira a cabeça do embrião de pintinho para a tampa de uma placa de Petri. Use pinças de alta precisão para pinçar a parte traseira do olho, criando uma pequena abertura na região posterior do olho. Em seguida, segure o humor vítreo com a pinça e puxe suavemente o vítreo com um movimento de rolagem.O vítreo com a lente acoplada se soltará do olho. Coloque a lente e o vítreo na outra placa de Petri contendo o Tampão Tex Extras. Deixe as lentes permanecerem no tampão por não mais de 30 minutos antes de prosseguir com a dissecação.Em seguida, mova a lente para uma nova tampa de placa de Petri sob um microscópio estereoscópico usando pin&ccedil;as de alta precis&atilde;o, removendo cuidadosamente com a borda da pin&ccedil;a quaisquer c&eacute;lulas do corpo ciliar que tenham sido deslocadas junto com a lente. Em seguida, separe a lente do humor v&iacute;treo pin&ccedil;ando o corpo v&iacute;treo de sua associa&ccedil;&atilde;o com a c&aacute;psula posterior da lente. Ap&oacute;s a separa&ccedil;&atilde;o, transfira a lente para uma gota de 200 microlitros de tamp&atilde;o tris-dextrose em uma placa de cultura de tecidos de 35 mil&iacute;metros e posicione-a com a face anterior da lente voltada para cima.A região anterior da lente é facilmente identificável pela presença de um anel denso no tecido, que marca a fronteira entre a região interna e a equatorial do epitélio da lente. Usando duas pinças de alta precisão, faça uma pequena incisão com aproximadamente 850 micrômetros de comprimento no centro da cápsula anterior da lente, segurando o tecido com uma pinça em cada mão e puxando suavemente em direções opostas. Em seguida, pegue uma seringa de um mililitro com agulha de calibre 27,5 e preencha-a com 300 microlitros de tampão de dextrose TST.Insira a ponta da agulha na incisão feita na cápsula anterior do cristalino e cerca de metade do caminho para dentro do cristalino. Em seguida, pressione suavemente a seringa, injetando o tampão de dextrose TST no cristalino. Massa de células fibrilares.Injete entre 50 e 200 microlitros de tampão para soltar a massa de células fibrilares do epitélio circundante e da cápsula do cristalino. Nunca injete mais de 300 microlitros. Usando pinças de alta precisão, remova a massa de células fibrilares solta do cristalino através do sítio de incisão anterior.A remoção da massa de células em fibra de sua fixação na cápsula posterior cria uma área de ferida altamente reprodutível na membrana basal, cercada pelo epitélio lesionado. A partir do saco capsular, faça cinco cortes na face anterior da lente até o equador. Aplique as cinco abas resultantes da cápsula da lente, com o epitélio aderido, com a face capsular voltada para baixo e a face celular voltada para cima no prato de cultura.Pressione suavemente com a pinça em cada ponto da estrela para fixar a cápsula ao recipiente. Isso criará uma pequena depressão nas cinco pontas mais externas do x explan e resultará em uma fixação sustentada ao recipiente. Em seguida, remova o tampão de tris dextrose do recipiente de 35 milímetros e substitua-o por 1,5 mililitros de M1 99 pré-aquecido.Meio suplementado com 1% de L-glutamina e penicilina. A estreptomicina cobriu a placa com sua tampa e colocou-a no incubador. Coloque a placa de cultura sob o microscópio estereoscópico e observe a delimitação entre a zona de migração central e a zona original de adesão das células epiteliais.Em seguida, utilize duas pinças de alta precisão para segurar a borda de ambos os lados da linha de demarcação entre as duas zonas. Puxe suavemente a zona de fixação original ao longo da linha para separar facilmente as duas zonas. Continue separando as duas zonas ao redor de toda a cultura até que as duas regiões estejam completamente separadas.Estude as duas frações utilizando técnicas analíticas moleculares ou bioquímicas padrão. Imediatamente após a remoção da massa de células fibróticas, uma subpopulação de células mesenquimatosas de reparo é ativada e migra para a borda da ferida no epitélio. Essas células se deslocam rapidamente para a região livre de células na lâmina basal endógena, a zona central de migração, para iniciar o processo de cicatrização.O ferimento, a técnica descrita aqui prepara perfeitamente este sistema modelo para visualizar este processo com um microscópio ou câmera de vídeo; a cicatrização do ferimento progride rapidamente, cobrindo uma área significativa do ferimento até o primeiro dia em cultura. No terceiro dia, o processo de cicatrização do ferimento geralmente está concluído, após a separação das zonas central de migração e de fixação original. As diferenças moleculares entre essas zonas distintas foram analisadas aqui.Os níveis de quinase de adesão focal foram medidos nas duas zonas e constatou-se que a quantidade de quinase de adesão focal fosforilada estava aumentada na zona central específica de migração. Uma vez dominada, essa técnica de simulação de cirurgia de catarata pode ser concluída em três minutos, se realizada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um modelo de simulação de cirurgia de catarata que imite de perto a reparação de feridas em um microambiente natural.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.

Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

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