Estabelecimento de um clinicamente relevantes

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo clinicamente relevante no qual a reparação de feridas possa ser acompanhada em seu microambiente natural. Isso é realizado primeiramente removendo a lente do olho de um embrião de galinha. O segundo passo consiste em fazer uma pequena incisão na parte anterior da lente.

Em seguida, elua por hidrólise a massa de células fibrilares do cristalino. Depois, a cápsula do cristalino com o epitélio associado é achatada mediante cortes adicionais na cápsula anterior. O passo final consiste em fixar a cultura lesionada à placa de cultura de tecidos, a fim de acompanhar a cicatrização da lesão conforme ela ocorre.

Por fim, a microscopia com lapso de tempo, a microscopia confocal e a análise bioquímica são utilizadas para demonstrar os mecanismos de reparo de feridas em um modelo que recapitula de forma próxima o ambiente in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da cicatrização de feridas, como a forma pela qual as células se movem de maneira coordenada para fechar a ferida. Embora este método possa fornecer informações sobre o processo de reparo de feridas.

Também pode ser aplicado a estudos de cicatrização de feridas ABER, particularmente fibrose e formação de cicatrizes. Comece colocando três placas de Petri de 100 milímetros em uma cabine de fluxo laminar estéril. Encha duas das placas de Petri até a metade com tampão tris dextrose à temperatura ambiente, deixando a terceira vazia.

Em seguida, retire um ovo fértil de frango White Leghorn com 15 dias de desenvolvimento embrionário do incubador a 37,7 graus Celsius e limpe a parte externa da casca com etanol 70% para esterilizá-la. Em seguida, quebre cuidadosamente o ovo e coloque seu conteúdo no interior da placa de Petri de 100 milímetros vazia. Usando pinças comuns e tesoura fina, decepe o embrião e coloque a cabeça em um dos recipientes contendo o tampão de dextrose TST.

Em até 15 minutos, transfira a cabeça do embrião de pintinho para a tampa de uma placa de Petri. Use pinças de alta precisão para pinçar a parte traseira do olho, criando uma pequena abertura na região posterior do olho. Em seguida, segure o humor vítreo com a pinça e puxe suavemente o vítreo com um movimento de rolagem.

O vítreo com a lente acoplada se soltará do olho. Coloque a lente e o vítreo na outra placa de Petri contendo o Tampão Tex Extras. Deixe as lentes permanecerem no tampão por não mais de 30 minutos antes de prosseguir com a dissecação.

Em seguida, mova a lente para uma nova tampa de placa de Petri sob um microscópio estereoscópico usando pinças de alta precisão, removendo cuidadosamente com a borda da pinça quaisquer células do corpo ciliar que tenham sido deslocadas junto com a lente. Em seguida, separe a lente do humor vítreo pinçando o corpo vítreo de sua associação com a cápsula posterior da lente. Após a separação, transfira a lente para uma gota de 200 microlitros de tampão tris-dextrose em uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros e posicione-a com a face anterior da lente voltada para cima.

A região anterior da lente é facilmente identificável pela presença de um anel denso no tecido, que marca a fronteira entre a região interna e a equatorial do epitélio da lente. Usando duas pinças de alta precisão, faça uma pequena incisão com aproximadamente 850 micrômetros de comprimento no centro da cápsula anterior da lente, segurando o tecido com uma pinça em cada mão e puxando suavemente em direções opostas. Em seguida, pegue uma seringa de um mililitro com agulha de calibre 27,5 e preencha-a com 300 microlitros de tampão de dextrose TST.

Insira a ponta da agulha na incisão feita na cápsula anterior do cristalino e cerca de metade do caminho para dentro do cristalino. Em seguida, pressione suavemente a seringa, injetando o tampão de dextrose TST no cristalino. Massa de células fibrilares.

Injete entre 50 e 200 microlitros de tampão para soltar a massa de células fibrilares do epitélio circundante e da cápsula do cristalino. Nunca injete mais de 300 microlitros. Usando pinças de alta precisão, remova a massa de células fibrilares solta do cristalino através do sítio de incisão anterior.

A remoção da massa de células em fibra de sua fixação na cápsula posterior cria uma área de ferida altamente reprodutível na membrana basal, cercada pelo epitélio lesionado. A partir do saco capsular, faça cinco cortes na face anterior da lente até o equador. Aplique as cinco abas resultantes da cápsula da lente, com o epitélio aderido, com a face capsular voltada para baixo e a face celular voltada para cima no prato de cultura.

Pressione suavemente com a pinça em cada ponto da estrela para fixar a cápsula ao recipiente. Isso criará uma pequena depressão nas cinco pontas mais externas do x explan e resultará em uma fixação sustentada ao recipiente. Em seguida, remova o tampão de tris dextrose do recipiente de 35 milímetros e substitua-o por 1,5 mililitros de M1 99 pré-aquecido.

Meio suplementado com 1% de L-glutamina e penicilina. A estreptomicina cobriu a placa com sua tampa e colocou-a no incubador. Coloque a placa de cultura sob o microscópio estereoscópico e observe a delimitação entre a zona de migração central e a zona original de adesão das células epiteliais.

Em seguida, utilize duas pinças de alta precisão para segurar a borda de ambos os lados da linha de demarcação entre as duas zonas. Puxe suavemente a zona de fixação original ao longo da linha para separar facilmente as duas zonas. Continue separando as duas zonas ao redor de toda a cultura até que as duas regiões estejam completamente separadas.

Estude as duas frações utilizando técnicas analíticas moleculares ou bioquímicas padrão. Imediatamente após a remoção da massa de células fibróticas, uma subpopulação de células mesenquimatosas de reparo é ativada e migra para a borda da ferida no epitélio. Essas células se deslocam rapidamente para a região livre de células na lâmina basal endógena, a zona central de migração, para iniciar o processo de cicatrização.

O ferimento, a técnica descrita aqui prepara perfeitamente este sistema modelo para visualizar este processo com um microscópio ou câmera de vídeo; a cicatrização do ferimento progride rapidamente, cobrindo uma área significativa do ferimento até o primeiro dia em cultura. No terceiro dia, o processo de cicatrização do ferimento geralmente está concluído, após a separação das zonas central de migração e de fixação original. As diferenças moleculares entre essas zonas distintas foram analisadas aqui.

Os níveis de quinase de adesão focal foram medidos nas duas zonas e constatou-se que a quantidade de quinase de adesão focal fosforilada estava aumentada na zona central específica de migração. Uma vez dominada, essa técnica de simulação de cirurgia de catarata pode ser concluída em três minutos, se realizada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar um modelo de simulação de cirurgia de catarata que imite de perto a reparação de feridas em um microambiente natural.