Name: Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a detectar integrões de classe 1 e cassetes de genes de resistência a antibióticos em alimentos usando PCR e sequenciamento de DNA. Este protocolo permite identificar isolados bacterianos e rastrear a disseminação de resistência.

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Graças a Michaela Hall, Larissa Bispo e Gustavo Tavares de Assistência Técnica.

Os géneros alimentícios que são comidos crus ou levemente cozidos são de maior preocupação para a saúde humana. Exemplos incluem hortaliças, frutas, mariscos e crustáceos. Coleção 1. Amostra <ol><li> Recolha de amostras sob condições que minimizam a contaminação, e armazenadas em sacos separados, limpas durante o transporte. Uma vez recolhidas, as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C e processados ​​dentro de 24 horas. </li></ol> 2. Enriquecido Cultura Preparação <ol><li> Frutas e vegetais: <ol><li> Colocar aproximadamente 10 g de material em um saco de plástico durável. Se a transformação de matérias maior, concentrar-se na pele do fruto ou legume. Adicionar 90 ml de tampão 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,0 e processo num misturador de pás durante 30 s. Em alternativa, o material pode ser agitada manualmente, se um misturador de pás não está disponível. </li><li> Recolhe-se o líquido em dois tubos Falcon de 50 ml. Tubos de centrifugação a 4.000 xg por 7 min de bactérias de pelotização. </li&gt; <li> Remova cuidadosamente o sobrenadante e suspender as bactérias peletizadas em 30 ml de Luria estéril Bertani (LB). </li><li> Incubar num agitador de O / N, que prende um tubo a 25 ° C e o outro a 37 ° C. As culturas deverão ser agitados a 200 oscilações por minuto (OPM). Armazenar as culturas a 4 ° C até serem necessárias. </li></ol></li><li> Seafood: <ol><li> Dissecar o estômago (ostras) ou do tracto digestivo (camarão), utilizando fórceps e pinças estéreis e colocar num tubo de 1,5 ml esterilizado, contendo 200 ul de tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0. Macerar o exemplo para criar um homogeneizado. </li><li> Pipetar 5 ml de caldo LB estéril em dois tubos de 5 ml, e inocular cada um com o homogeneizado de marisco. </li><li> Incubar num agitador de O / N, que prende um tubo a 25 ° C e o outro a 37 ° C. As culturas deverão ser agitados a 200 opm. Armazenar as culturas a 4 ° C até serem necessárias. </li></ol></li></ol> 3. As culturas de rastreio para integrons MgCl2 de 2,5 mM. Se necessário, Lorenz (2011) 24 delineou PCR otimização e solução de problemas métodos em uma edição anterior desta revista. <ol><li> Preparação de ADN fervido: <ol><li> Dispensar 100 l de cultura enriquecido em um estéril 0,5 ml tubo de PCR. Aquece-se a amostra a 99 ° C durante 10 min, utilizando um banho-maria ou bloco de aquecimento. Encaixe frio em gelo durante 2 min. </li><li> Microcentrífuga a 14000 xg durante 5 min para sedimentar os detritos celulares. Retornar ao gelo. As amostras de ADN podem ser congeladas a -20 ° C até serem necessárias, mas deve ser descongelada em gelo. </li></ol></li><li> Rastreio de classe 1 integrons usando PCR: NOTA: culturas mistas do O / N incubação são selecionados para a classe 1 integrons usando o protocolo HS463a / HS464 PCR (Tabela 1). <ol><li> Descongelar todos os reagentes de PCR em gelo, longe de qualquer potencial de souRCEs de ADN contaminante. Compõem 48 ul PCR mastermix por amostra, incluindo controlos negativos (Tabela 2). Dispense 48 ul de PCR master mix para cada tubo, usando dicas de barreira. </li><li> Adicionar 2 mL de ADN descongeladas para tubos de PCR individuais, utilizando pontas de barreira. Executar programa adequado no termociclador de PCR. </li><li> Para avaliar os resultados da amplificação, electroforese 7 uL de produto de PCR num gel de agarose a 2% e executar vertida em tampão TBE (90 mM Tris-borato, 2 mM de EDTA). Incluem um marcador de peso molecular, tais como uma escada de 100 pb. </li><li> Adicione mancha do gel com um corante de ADN, e visualizar utilizando um transiluminador de UV. Verificar que não houve nenhuma amplificação no controlo negativo. A banda forte em torno de 470 pb para qualquer determinada amostra indica que a cultura mista contém bactérias que carregam uma classe 1 integron. Colónias puras vai agora ser isolado a partir de qualquer cultura mista que devolvido um PCR positivo. </li></ol></li></ol><ol><li> Diluições em série e placas espalhadas: NOTA: Para isolar colónias simples a partir das culturas mistas de PCR-positivas, a cultura mista é diluída em série de 10 vezes em tampão de fosfato de sódio, e depois plaqueadas para recuperar as colónias individuais. <ol><li> Adicionar 1 ml de cultura mista a 9 ml de tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 e misturar por inversão. Adicionar 1 ml da diluição para uma mais 9 ml de tampão de fosfato, e repetir até uma diluição em série de 10 -8 é atingido. </li><li> Espalhe 100 ul dos 10 -4 a 10 -8 diluições em agar LB, em duplicado. Incubar as placas de O / N à mesma temperatura utilizada para a cultura mista inicial. As placas podem então ser armazenadas a 4 ° C até ser necessário, no entanto, é melhor para processar as colónias individuais relativamente prontamente. </li></ol></li><li> Selecção de colónias únicas e o ADN fervido preparação: <ol><li> Escolha colónias individuais das placas de diluição em série, SElecting como muitos tipos diferentes de colónias possível, usando critérios como tamanho da colônia, forma e cor. Use palitos esterilizados para selecionar colônias individuais da placa propagação. </li><li> Toque no palito para a colônia, e depois transferir para um tubo de PCR contendo 100 ml de água estéril. Se um grande número de colónias estão a ser pesquisadas, em seguida, as colónias podem ser preparados num tabuleiro de microtitulação. Girar o palito entre os dedos para deslocar algumas das células na água. </li><li> Usando o mesmo palito, inocular uma placa de LB com uma raia da colônia. Um grande número de colónias pode ser armazenada em placas marcadas se cada raia é de cerca de 1 cm de comprimento. Repita os passos 1 a 3 até que você tenha selecionado um número apropriado de isolados. </li><li> Incubar a placas LB O / N, à mesma temperatura que o utilizado para a cultura enriquecido inicial. As culturas podem depois ser armazenado a 4 ° C até serem necessárias. </li><li> Para a preparação de DNA a partir das suspensões bacterianas, siga os passos como UOtlined na secção 3.1. Para o rastreio de lisados ​​de cultura pura, execute o HS463a / HS464 PCR, conforme descrito no ponto 3.2. Os isolados que retornar um PCR positivo será utilizado para a preparação de ADN genómico (seção 5), e para análises posteriores. </li></ol></li></ol> 5. As colónias individuais Genomic DNA Extração de Integron-positivos Usando Bead Batendo 25 <ol><li> Inocular 5 ml de caldo de LB com uma amostra de cultura pura isolada na secção 4.2. Incubar S / N, agitando à mesma temperatura que foi utilizado para a cultura enriquecido inicial. </li><li> Células de pelotas em 4000 g durante 7 min, em seguida, remover o sobrenadante. Volte a suspender as células sedimentadas em 1 ml de solução CLS-TC em um Lysing Matrix E tubo de preparação rápida. Usando uma máquina de talão de espancamento, processar a amostra em 5,5 m / s por 30 s. </li><li> Tubo de centrifugação a 14000 xg durante 5 min e recuperar 700 ul de sobrenadante para um tubo esterilizado de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 700 ul de matriz obrigatório diluído 1: 5 com 6 M guanidinium tiocianato e misturar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 1 min, o sobrenadante de descarte. </li><li> Adicionar 800 ul de lavagem com etanol sal (etanol a 70%, acetato de sódio 0,1 M) e agitar com vortex até que o sedimento é ressuspenso completamente. Lavar durante 5 min à temperatura ambiente, centrifugar a 14.000 xg durante 1 min e descartar o sobrenadante. Assegurar-se que o sobrenadante foi removido, utilizando uma micropipeta, se necessário, em seguida deixar secar ao ar durante 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em matriz de 200 ul de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 7,6), pipetando para cima e para baixo. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 3 min e a transferência de 160 uL do ADN eluído em um tubo estéril. Executar uma alíquota da extracção do ADN genómico em um 2% w / v de gel de agarose para verificar a integridade e rendimento da extracção do ADN. O ADN genómico purificado é armazenado a -20 ° C e descongelados em gelo, quando necessário para o teste de PCR. </li></ol> 6. PCRs de Diagnóstico e seqüenciamento de DNA NOTA: ODNA genómico preparado na seção 5 será usado para todos os PCRs de diagnóstico, e para confirmar o teste positivo para a classe 1 integrons. <ol><li> Descongele DNA genômico em gelo, vortex brevemente a amostra de DNA e pulso rotação a 14.000 xg por 20 s. Repetir a PCR para o gene da integrase íntegron-classe 1 usando HS463a / HS464 (Tabela 1), confirmando que o isolado é positivo para o amplicão 471 pb (Secção 3.2). </li><li> Identificação de culturas positivas ao nível de espécie é conseguida por análise da pequena subunidade do gene de rRNA (16S ADNr). Amplificar o gene 16S utilizando os iniciadores F27 / r1492 (Tabela 1). Confira os produtos de PCR utilizando eletroforese. Todos os alvos bacterianos deve gerar um 16S amplicon de cerca de 1450 pb. </li><li> Sequência do amplicão do gene 16S rRNA para determinar a identidade das espécies, mas uma vez que não é provável que sejam múltiplos PCR positivos a partir do passo 6.2, e muitos destes positivos serão as mesmas espécies bacterianas, vamos primeiro distinguir as diferentes espécies using digestão de restrição do produto de PCR 16S. <ol><li> Digerir uma aliquota do PCR 16S com a enzima de restrição Hinf 1. Qualquer enzima que reconhece sítios de clivagem 4 pb vai fazer, mas Hinf 1 gera boa diversidade de alvos 16S, e é uma enzima confiável e barata. </li></ol></li><li> Configurar uma restrição de 30 ul digerir mastermix (Tabela 2) em um tubo estéril e adicionar 20 l de produto de PCR 16S purfied-un. Incubar em um banho de água a 37 ° C O / N. Verificar o produto da digestão num gel de agarose a 2%. </li><li> Pontuação dos padrões de digestão produzidos por Hinf 1. Os isolados com o mesmo perfil de restrição 16S são susceptíveis de ser da mesma espécie. Em vez de seqüenciar todos os produtos de PCR 16S, seqüência, no máximo, três representantes de cada padrão de restrição Hinf 1. </li><li> Purifica-se os produtos de PCR 16S utilizando um kit comercial. Um único conjunto de exonuclease de cadeia pode ser usado, mas com base em coluna ou métodos de precipitação também funciona bem para remover unincprimers orporated e ADN de cadeia simples. Sequência os amplicons 16S usando R910 iniciador (Tabela 1), que estabelecem as reações como especificado pelo serviço de sequenciação. </li><li> Use a sequência de DNA resultante para interrogar o banco de dados de DNA NCBI com a função blastn ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Mais do que 97% de identidade de nucleótidos geralmente é tomado como a identidade das espécies. </li></ol> 7. Mapeamento e Caracterização de integrons e cassete Arrays NOTA: Classe 1 integrons que emanam de ecossistemas dominados pelo homem tendem a ser os integrons mais comuns em todas as suas amostras. Estes integrons todos têm uma origem única recente e, portanto, têm uma sequência de DNA altamente conservado 5. <ol><li> Diferenciar entre uma classe 1 integrões que emanam a partir de fontes humanas e as que ocorrem naturalmente em amostras ambientais através da realização de umPCR com iniciadores definido intI1F165 / intI1R476 10 (Tabela 1). NOTA: Classe 1 integrons de bactérias comensais clínicos ou irá gerar um produto de ~ 300 pb, enquanto classe ambiental 1 integrons não irá gerar qualquer produto. </li><li> Caracterizar os integrons clínicos, amplificando a matriz cassete com conjunto de primers HS458 / HS459. Esta PCR amplifica a região entre intI1 e segmento conservado a 3 &#39;no terminal da maior parte das matrizes de cassetes. Uma vez que o número e identidade de cassetes é variável, o tamanho do produto de PCR também irá variar. </li><li> Purifica-se produtos de amplificação e a sequência de ADN utilizando cada um dos iniciadores de amplificação. Use seqüências para interrogar bases de dados de ADN utilizando a função blastn ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Certifique-se de nomear de cassetes siga nomenclatura padronizada 9, uma vez que muitos depoimentos dados para cassete gene integrons usar nomes inconsistentes ou ambíguas. Dê especial atenção às cassetes de genes novos, uma vez que estes podem codificar novos fenótipos, incluindo genes que conferem aumento transmissibilidade, patogenicidade ou virulência 8,21. NOTA: pré-clínica formas da classe 1 integron ainda circulam em ambientes naturais. Em particular, aqueles que estão ligados a ativos Tn 402 transposons são de maior interesse 26. As matrizes de cassetes dessas integrons não vai amplificar com conjunto de primers HS458 / HS459, mas pode ser amplificado com o MRG284 / MRG285 primário conjunto (Tabela 1), gerando amplicons de tamanho variável dependente conteúdo cassete. Os produtos de PCR deve ser purificado e o ADN sequenciado conforme descrito em 7.2. </li></ol>

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<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
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<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada de relevante a divulgar.

A identificação de integrons e suas cassetes de genes associados é potencialmente um passo fundamental para prever o surgimento de novos patógenos oportunistas, acompanhamento de percursos para patógenos na cadeia alimentar humana e identificando nova resistência e virulência determinantes 8,21,26. O objetivo deste trabalho foi descrever uma abordagem simplificada para a triagem de amostras para a classe 1 integrons, caracterizando suas matrizes cassete e identificar as espécies de bactérias em que residem. E...

A descoberta dos antibióticos foi uma das maiores conquistas científicas do século 20. No entanto, o uso e abuso de antibióticos levou à rápida evolução de bactérias resistentes aos antibióticos, e estes agora representam uma séria ameaça para a saúde pública no século 21. O surgimento de cepas bacterianas resistentes à maioria das opções de tratamento levanta a possibilidade de que estamos entrando em uma era onde as drogas antimicrobianas não são mais eficazes 1,2. A maquinaria genética que confere resistência aos antibióticos é um sistema antigo, anterior a seres humanos e pressões de seleção de antibióticos por milhões de anos 3. Elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos, transposões, ilhas genômicas, elementos conjugativos integrativas e integrons podem disseminar genes de resistência a antibióticos (ARG) tanto dentro como entre espécies bacterianas 4. Destes, integrões têm desempenhado um papel central na propagação de Arg, apesar dafato de que eles dependem de plasmídeos e transposons de mobilização e de inserção no genoma bacteriano 5. Integrons capturar cassetes de genes que utilizam um íntegron-integrase, e, em seguida, expressar as cassetes utilizando um promotor codificado íntegron 6,7 (Figura 1). Integron gene cassetes são pequenos elementos móveis consistindo de quadros individuais de leitura abertas (ORF), cujos produtos podem conferir resistência a antibióticos ou desinfectantes 8. Classe 1 integrons são os integrons mais comumente recuperados a partir de isolados clínicos 5, onde têm adquiriu coletivamente mais de 130 diferentes cassetes de genes de resistência a antibióticos 9. A propagação da classe 1 integrons em comensais e patogênicas de bactérias associadas a humanos gera fluxos de resíduos humanos que contêm um grande número destes elementos genéticos 10. Estima-se que 10 19 bactérias que contêm uma classe integrons são liberados via lodo de esgoto cada ano in o Reino Unido 11. Portanto, não é surpreendente que uma classe integrons conferem resistências a antibióticos estão agora a ser detectado em microbiota das aves selvagens, peixes e outros animais selvagens nativos 12-14. Soltar integrons volta para o ambiente constitui uma ameaça grave de saúde pública, desde a aquisição de novos cassetes de genes e rearranjos complexos com outros elementos móveis continua a ocorrer, particularmente em estações de tratamento de esgoto e outros corpos d&#39;água 15-18. O ambiente natural, em seguida, torna-se um terreno fértil para o recrutamento de novos determinantes de resistência e patógenos oportunistas 19,20. Bactéria contendo integron novos e novos ARGs pode circular de volta para a comunidade humana através de água e alimentos contaminados 21,22. Vigilância de ARGs ambientais é uma estratégia fundamental para a compreensão e manejo da resistência aos antibióticos no futuro 23. Em particular, deve ser dada atenção aos géneros alimentícios que são comidos crus oulevemente cozidos, uma vez que estes apresentam a maior ameaça para a transmissão de novos elementos celulares e patógenos. Neste protocolo, uma abordagem simplificada para a detecção, identificação e caracterização de classe 1 integrons e suas cassetes de genes associados nos alimentos são descritas (Figura 2). Usando uma combinação de reacção cultura e polimerase em cadeia (PCR), integrões pode ser rapidamente detectada em comunidades bacterianas e complexos isolados individuais. Métodos de identificação das espécies de bactérias e a conformação ea identidade das cassetes de genes associados a integron são dadas. O método é adequado para uma ampla variedade de alimentos de origem vegetal e animal, e exemplos de fluxos típicos são dados para cada um destes tipos de alimentos.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Usado em todos os PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A do pâncreas bovino)</td> <td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Usado em todos os PCRs</td></tr><tr><td>Enzima de restrição HinFI</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Usado para digerir produtos de PCR 16S rDNA. A enzima vem com tampão ideal e</td></tr><tr><td>escada BSA 100 bp</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Usado como padrão de tamanho em todos os géis de agarose</td></tr><tr><td>Mancha de DNA GelRed</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>CUIDADO: Proteção pessoal deve ser usada ao manusear este material</td></tr><tr><td>Tiocianato de guanidínio</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>CUIDADO: Proteção pessoal deve ser usada ao manusear este material</td></tr><tr><td>CLS-TC Solução</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Solução de ressuspensão usada no início da extração do DNA genômico</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E Tubos FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tubo necessário para a ruptura mecânica das paredes celulares bacterianas. Este código é usado para embalagens de 500 tubos, quantidades menores estão disponíveis.</td></tr><tr><td>Matriz de ligação</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>diluído 1:5 com tiocianato de guanidínio 6 M e usado no método de extração de DNA genômico.</td></tr><tr><td>Máquina de preparação rápida</td><td>MP Biomedicals</td><td>Número de opções disponíveis</td> A <td>MP Biomedicals tem várias máquinas FastPrep disponíveis para compra. Visite <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a> para obter mais informações</td></tr></tbody></table>

triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e gene cassetes

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

A resistência aos antibióticos é uma das maiores ameaças à saúde noséculo 21. A aquisição de genes de resistência por meio da transferência lateral de genes é um fator importante na disseminação de diversos mecanismos de resistência. Entre os elementos de DNA que facilitam a transferência lateral, os integrons de classe 1 têm sido amplamente responsáveis por espalhar determinantes de resistência a antibióticos entre patógenos Gram negativos. No total, esses integrons adquiriram e disseminaram mais de 130 genes diferentes de resistência a antibióticos. Com o uso contínuo de antibióticos, os integrons de classe 1 tornaram-se onipresentes em comensais e patógenos de humanos e seus animais domesticados. Como consequência, eles agora podem ser encontrados em todos os fluxos de dejetos humanos, onde continuam a adquirir novos genes e têm o potencial de voltar para os humanos por meio da cadeia alimentar. Este protocolo detalha uma abordagem simplificada para detectar integrons de classe 1 e seus de genes de resistência associados em alimentos, usando cultura e PCR. Usando este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de: coletar e preparar amostras para fazer culturas enriquecidas e rastrear integrons de classe 1; isolar colônias bacterianas únicas para identificar isolados positivos para integrons; Identificar espécies bacterianas que contenham integrões de classe 1; e caracterizar esses integrons e seus de genes associados.

Triagem de culturas mistas e isolados bacterianos para intI1 O conjunto iniciador HS463a / HS464 PCR pode ser usado para detectar a presença do gene da integrase íntegron-classe 1, intI1 (Figura 1). Este conjunto de iniciadores para a detecção trabalha bem intI1 em culturas mistas, e também é utilizado para rastrear colónias bacterianas colhidas a partir de placas de propagação (Figura 2). Isolados positivos devem gerar uma única banda forte e...

Este protocolo descreve a detecção de integrons de classe 1 e seus de genes associados em alimentos.

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma abordagem simplificada para detectar integrons de classe um e seus respectivos cassetes gênicos em produtos alimentícios. Isso é realizado primeiramente por meio da obtenção de um cultivo bacteriano enriquecido a partir do alimento escolhido. O segundo passo consiste em triar o cultivo quanto à presença de integrons de classe um utilizando PCR e isolar colônias individuais a partir do cultivo misto positivo para integrons.Após triar as colônias isoladas quanto à presença de integrons, prepare o DNA genômico das colônias isoladas para PCRs diagnósticas que permitam diferenciar as espécies bacterianas e detectar a presença de cassetes gênicos. O passo final consiste na purificação dos produtos de PCR e no envio para análise de sequenciamento de DNA. Em última instância, a análise do sequenciamento de DNA é utilizada para caracterizar os cassetes gênicos dentro de um integron de classe um e identificar as espécies nas quais estão presentes.A resistência a antibióticos é um dos principais problemas enfrentados pelo tratamento médico no século XXI. Uma das formas de controlar a resistência a antibióticos é detectar e rastrear genes de resistência a antibióticos no ambiente, desde os seres humanos até o meio ambiente e vice-versa. Este protocolo irá mostrar como detectar a resistência a antibióticos.Genes em alimentos que podemos consumir crus ou com processamento mínimo. O procedimento será demonstrado por Leet Waldron, um pós-doutorando que atua no meu laboratório. Alimentos consumidos crus ou levemente cozidos, como frutas, vegetais e frutos do mar, são os que mais preocupam a saúde humana.Apenas a preparação de culturas enriquecidas a partir de frutos do mar será demonstrada aqui. Consulte o texto do protocolo para a preparação de culturas a partir de frutas e vegetais. Para preparar uma cultura enriquecida a partir de frutos do mar, utilize primeiro pinças e tweezers estéreis para dissecar o trato digestivo de camarões.Coloque o material dissecado em um tubo estéril de 1,5 mililitro contendo 200 microlitros de tampão de fosfato de sódio. Macere a amostra usando um pistilo para criar um homogenato e vorte. Dispense rapidamente cinco mililitros de caldo LB em dois tubos estéreis de cinco mililitros e inocule cada um com o homogenato de frutos do mar.Agite ambos os tubos durante a noite a 200 OPM, incubando um tubo a 25 graus Celsius e o outro a 37 graus Celsius no dia seguinte. Armazene as culturas a quatro graus Celsius até que sejam necessárias para recuperar colônias isoladas de uma cultura mista positiva para PCR. Primeiro, dilua a cultura sucessivamente dez vezes em tampão de fosfato de sódio, adicionando um mililitro da cultura mista a nove mililitros de tampão de fosfato de sódio, misturando em vórtex.Adicione um mililitro da diluição a mais nove mililitros de tampão de fosfato de sódio e repita até atingir uma diluição seriada de 10 elevado a menos oito. Distribua 100 microlitros da cultura diluída das diluições de 10 elevado a menos quatro até 10 elevado a menos oito em ágar LB. Em duplicata, incube as placas durante a noite na mesma temperatura utilizada para o cultivo misto inicial no dia seguinte.Colônias isoladas podem ser selecionadas a partir das placas de diluição seriada. Para a preparação de DNA, certifique-se de que todas as placas e tubos de amostra estejam claramente rotulados antes de iniciar. Toque um palito estéril em uma única colônia e, em seguida, transfira para um tubo de PCR contendo 100 microlitros de água estéril.Gire o palito entre os dedos para desprender algumas das células na água; usando o mesmo palito, inocular uma placa de LB com uma estria de cada colônia selecionada. Grandes quantidades de colônias podem ser armazenadas em placas identificadas. Se cada estria tiver cerca de um centímetro de comprimento, feche a tampa imediatamente para reduzir a contaminação entre as amostras.Selecione o maior número possível de tipos diferentes de colônias utilizando critérios como tamanho, forma e cor das colônias. Incube as placas de LB durante a noite na mesma temperatura utilizada para o cultivo enriquecido inicial. Os cultivos podem então ser armazenados a quatro graus Celsius até que sejam necessários para preparar o DNA das suspensões bacterianas.Aqueça as amostras a 99 graus Celsius por 10 minutos usando um microcentrífuga termocicladora a 14.000 vezes, G por cinco minutos à temperatura ambiente para formar um pellet de detritos celulares; em seguida, retorne à gelo. Subsequentemente, analise o DNA por PCR com os primers HS 4 63 A e HS 4 64. Após seguir os procedimentos descritos no texto do protocolo, é importante evitar quaisquer fontes potenciais de DNA contaminante ao realizar a PCR para avaliar os resultados da amplificação por eletroforese.Sete microlitros de cada produto de PCR em um gel de agarose a 2% preparado e eletroforetizado em tampão TBE após coloração pós-eletroforese do gel com corante para DNA. Visualize o DNA utilizando um transiluminador de UV. Os isolados que possuem um integrante da classe um gerarão uma única faixa intensa com 471 pares de bases. O DNA genômico preparado a partir de isolados que apresentam PCR positivo é utilizado para essas análises. Deixe o DNA genômico descongelar no gelo e vortexie brevemente, seguido de centrifugação rápida a 14.000 × g durante 20 segundos.As sequências dos iniciadores e as condições de PCR utilizadas para os PCR diagnósticos estão apresentadas na tabela um do manuscrito. Primeiro, repita o PCR para o gene da integrase da classe um para confirmar que o isolado é positivo para o amplicão de 471 pares de bases. Em seguida, identifique as culturas positivas ao nível de espécie amplificando o gene do RNA ribossomal da subunidade pequena 16 S-R-D-N-A.Todos os alvos bacterianos devem gerar um amplicon de 16 S com cerca de 1.450 pares de bases, já que muitas dessas culturas positivas serão iguais. As espécies bacterianas distinguem as diferentes espécies por meio da digestão com enzima de restrição do produto da PCR de 16 S. Recomenda-se a enzima de restrição HIF uma, pois ela gera boa diversidade a partir de alvos de 16 S e é uma enzima confiável e de baixo custo.Prepare uma mistura mestra de 30 microlitros para digestão de restrição em um tubo estéril e adicione 20 microlitros do produto de PCR 16S não purificado. Incube em banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite no dia seguinte. Verifique a digestão em um gel de AROS 2%. Os produtos de PCR 16S selecionados são então purificados utilizando um kit comercial e enviados a uma instalação de sequenciamento para sequenciação de DNA. Utilize a sequência de DNA resultante para consultar a base de dados N-C-B-I-D-N-A com a função Blast N; identidade de nucleotídeos superior a 97% é geralmente considerada como identidade de espécie.Isolados antibacterianos de culturas mistas são triados para a presença do gene da integrase da classe um por PCR. O uso dos primers HS 4 63 A e HS 4 64 gera um único fragmento forte de 471 pares de bases em colônias positivas. O DNA genômico de isolados puros é utilizado para a caracterização dos arranjos intercassete; a amplificação dos arranjos de cassete a partir de integrons TN 4 0 2 usando os primers HS 4 58 e HS 4 59 produz tamanhos variáveis de produtos, dependendo da identidade e do tamanho das cassetes componentes do arranjo.A identificação dessas cassetes requer sequenciamento de DNA. Os integrons de Classe um Ambiental estão frequentemente inseridos nos cromossomos bacterianos. Suas regiões conservadas podem ser amplificadas pelos primers MG 2 84 e MG 2 85, que visam os sítios de recombinação proximal e mais distal, respectivamente. Esta PCR também gera tamanhos variáveis de produto, dependendo da identidade e do tamanho das cassetes componentes da matriz.No entanto, é improvável que os cassetes em matrizes ambientais codifiquem resistência a antibióticos. As espécies bacterianas são identificadas por meio da amplificação do DNA 16S e da análise dos produtos de PCR por digestão. Com o HIF, uma única espécie individual gerará padrões distintos, de modo que os isolados da mesma espécie possam ser facilmente identificados e confirmados por sequenciamento de DNA.Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma boa ideia de como isolar os ingramas da classe um e suas caixas de resistência a antibióticos de alimentos comuns.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Um método rápido e eficiente para integrar DNA estranho de juros em cepas pré-fabricados receptoras, chamadas de tensões almofada de aterragem, é descrito. O método permite site-specific integração de uma cassete de ADN no locus engenharia aterragem almofada de uma estirpe dada, por meio de conjugação e expressão da integrase ΦC31.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Salmonella spp. /Shigella spp. são patógenos comuns atribuídos a diarreia. Aqui, descrevemos uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp. usando PCR em tempo real combinadas com cultura guiada.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um teste isotémico de amplificação de ácido nucleico (iNAAT) que tem atraído amplo interesse no campo de detecção de patógenos. Aqui, apresentamos um protocolo salmonella LAMP validado em vários laboratórios como um método rápido, confiável e robusto para a triagem de Salmonella em alimentos animais e confirmando salmonela presuntiva do isolamento cultural.

Amplificação isotérmica mediada por loop para triagem de salmonela em alimentos animais e confirmando salmonela do isolamento cultural

O protocolo descreve como alcançar modificações direcionadas ao local no genoma dos mosquitos anofelinos da malária usando o sistema φC31 . As modificações descritas incluem tanto a integração quanto a troca de fitas transgênicas no genoma das linhas de acoplamento de rolamento attP.

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Campylobacter é a principal causa de gastroenterite bacteriana transmitida por alimentos em todo o mundo. Apesar de os estabelecimentos adotarem medidas para reduzir a prevalência em todas as suas instalações, os produtos contaminados chegam consistentemente aos consumidores. A técnica desenvolvida nos últimos doze anos aborda as limitações dos métodos existentes para isolar e detectar Campylobacter spp.

Detecção e Isolamento de Campylobacter spp.

Descrevemos um procedimento fácil para a complementação cromossômica de cópia única de um gene de bomba de efluxo usando um sistema de expressão baseado em mini-Tn7 em uma cepa deficiente em efluxo projetada de Acinetobacter baumannii. Esta ferramenta genética precisa permite a expressão gênica controlada, o que é fundamental para a caracterização de bombas de efluxo em patógenos multirresistentes.

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

Este estudo estabelece um conjunto de procedimentos operacionais padrão (SOPs) para rastrear e isolar com eficiência as bactérias intestinais capazes de clivar os glicosídeos C.

Triagem e isolamento de bactérias intestinais clivadas com glicosídeo C

Aprenda a detectar integrões de classe 1 e cassetes de genes de resistência a antibióticos em alimentos usando PCR e sequenciamento de DNA. Este protocolo permite identificar isolados bacterianos e rastrear a disseminação de resistência.

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

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