Name: Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprenda a produzir vetores adenovirais de alta capacidade sem genes virais para terapia gênica usando endonucleases de direcionamento. Este método permite entregar até 35 kb de DNA estrangeiro em células e organismos vivos.

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Este trabalho foi apoiado pela bolsa DFG EH 192/5-1 (AE), o projeto da UE (E-rare-2) Transposmart (AE), o UWH Forschungsförderung (ES e WZ) e o programa de doutorado da Universidade Witten / Herdecke (PB). JL foi apoiado por uma bolsa do Conselho de Bolsas Chinesas e TB e MG pela fundação Else Kröner-Fresenius (EKFS).

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo aqui apresentado permite a purificação de vectores HCAdV com base em adenovírus humano tipo 5 com base em procedimentos descritos anteriormente 4,12. O genoma HCAdV dentro do plasmídeo pAdFTC é destituído de todos os genes de adenovírus e só transporta as ITRs 5 &#39;e 3&#39;- e o sinal de empacotamento. Nesta estratégia do HV AdNG163R-2 4 fornece todos os genes necessários para a produção de vírus eficiente em trans. Isto oferece uma capacidade de acondicionamento de até 35 kb...

Para aplicações de terapia génica, é de grande importância para evitar efeitos colaterais citotóxicos e imunogénicas provocadas pela expressão de proteínas virais, a própria transgene ou por proteínas virais de entrada. Os vectores de adenovírus (Adv) são amplamente utilizados para introduzir ADN estranho numa ampla variedade de células para investigar o impacto da expressão do transgene 1,2. A versão mais avançada do AdV é representado por adenovírus vetores de alta capacidade (HCAdV) que faltam todas as sequências codificadoras virais 3,4 e oferecendo assim uma capacidade de acondicionamento até 35 kb, combinadas com baixa imunogenicidade e baixa toxicidade 5-8. Devido à sua capacidade de embalagem de alta permitem a entrega de transgenes grandes ou múltiplas utilizando uma dose única do vetor. Portanto, eles representam uma ferramenta valiosa para a comunidade de pesquisa. Em contraste com a primeira ou segunda geração AdV faltam os genes precoces E1 e / ou E3 que podem ser facilmente produzidos utilizando-se kits comerciais, vecTor construção do genoma do vírus e a produção de HCAdV é mais complexo. O sistema para a construção de genomas HCAdV baseia-se na pAdFTC plasmídeo que transporta um genoma HCAdV desprovido de todos os sequências codificadoras virais e o plasmídeo de transporte pHM5 9-12. Qualquer gene de interesse de até 14 quilobases (kb) podem ser clonados no vector vaivém pHM5 em que o local de clonagem múltipla é flanqueado por reconhecimento / clivagem de locais de endonucleases homing os PI- Sce I e I-Ceu I. Por conseguinte, um gene clonado de interesse possa ser libertado por PI- consecutivo Sce I e I-CEU I digere para a subsequente inserção dirigida para os mesmos sítios de restrição presentes no genoma HCAdV contido no plasmídeo pAdFTC. Em pAdFTC o local de inserção do transgene localizado entre a PI-Sce I e I-I Ceu sítios de clivagem é flanqueado por ADN de enchimento e as sequências não codificantes adenovirais necessárias para o empacotamento do genoma tais como repetições terminais 5 &#39;e 3&#39; invertidas (ITRs)em ambas as extremidades e o sinal de empacotamento a jusante do 5&#39;ITR. O DNA stuffer adicional fornece tamanho ideal do genoma HCAdV finais variando de 27 a 36 kb para garantir a embalagem eficiente durante a produção do vírus. Desde pAdFTC é um grande plasmídeo com até 45 kb (dependente do tamanho do transgene inserido) e o uso de endonucleases homing com locais de reconhecimento de ADN de comprimento comparativamente exibe forte ligação ao ADN, várias etapas de limpeza são necessárias durante a transferência do transgene a partir de pHM5 para pAdFTC. É recomendado um tratamento cuidadoso evitando forças de cisalhamento. As ITRs do genoma HCAdV são acompanhadas por Nem eu locais de reconhecimento de enzimas de restrição situados directamente a montante do 5&#39;ITR ea jusante da 3&#39;ITR 12. Portanto, HCAdV pode ser libertada por digestão Not I para a transfecção subsequente do genoma viral para a linha celular produtora HCAdV. Note-se que a utilização do enzima de restrição Not I para o relfacilidade do genoma viral a partir do plasmídeo pAdFTC implica que o transgene inserido é desprovido de sítios de reconhecimento de Not I de ADN. As células produtoras baseadas em células HEK293 (116 células) expressam de forma estável Cre recombinase. Para a amplificação do vírus 116 células são co-infectados com um vírus auxiliar (HV) fornecendo todos os genes necessários para a replicação AdV e embalagem de trans 3,4. O HV é um AdV de primeira geração com um sinal de empacotamento floxed que é removido durante a amplificação por vírus recombinase Cre expresso em células 116 4. Isto assegura que os genomas predominantemente HCAdV contendo um sinal de empacotamento está intacto encapsidado. Pré-amplificação do HCAdV é efectuada através da realização de passagens em série em passos de 116 células cultivadas em superfícies em pratos de cultura de tecidos. Depois de cada passagem partículas virais são libertadas a partir de células infectadas através da realização de três passos consecutivos de congelação-descongelação. Com cada passagem o aumento do número de células são infectadas com1/3 de lisado celular a partir da passagem anterior. Finalmente lisado proveniente do último passo de pré-amplificação é utilizado para infectar células produtoras cultivadas em suspensão num balão rotativo para a amplificação de grande escala. Os viriões são purificadas a partir das células em suspensão através da realização de uma ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio 4,12. Com este procedimento, as partículas vazias e partículas completamente montados são separados em duas bandas distintas. Para concentrar ainda mais o HCAdV partículas de um segundo passo de ultracentrifugação não gradual, é executada. Subsequentemente, a banda resultante contendo o HCAdV é recolhido e dialisado contra um tampão fisiológico. Preparações de vector finais são caracterizados no que diz respeito ao número de partículas virais infecciosas absolutos, partículas e os níveis de contaminação HV. Absolutos partículas virais podem ser determinadas por lise das partículas virais e medindo a absorvância a 260 nm ou realizando-PCR quantitativo em tempo real (qPCR) 12. A infecciosidade do purespecifica- partículas de vírus pode ser determinado por medição qPCR HCAdV genomas presentes no interior das células infectadas 3 h após a infecção.

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>resumo de restrição</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>resumo de restrição</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ligadura</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>resumo de restrição</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>resumo de restrição</td></tr><tr><td>Fosfatase Alcalina Intestinal de Bezerro (CIP)</td> <td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>desfosforilação de plasmídeos digeridos</td></tr><tr><td>Hygromicina B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>seleção de CRE expressando 116 células</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Meio de cultura celular Hek293T</td></tr><tr><td>Meio Essencial Mínimo (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 meio de cultura de células&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s tampão fosfato salino (DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>lavagem de células, ressuspensão de células</td></tr><tr><td>Frasco de armazenamento de 250 ml</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>infecção de 116 células cultivadas em suspensão</td></tr><tr><td>500 ml PP CentrifugeTubes</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>sedimentação de células de cultura em suspensão</td></tr><tr><td>Frasco giratório</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>crescimento de 116 células em suspensão</td></tr><tr><td>Tubos ultra Clear Ultracentrifuge</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>gradiente de densidade de centrifugação</td></tr><tr><td>Ultracentrifugação</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>densidade gradiente centrifugação</td></tr><tr><td>SW-41 rotor</td><td>Beckmann Coulter</td><td></td><td>densidade gradiente centrifugação</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>tubo de diálise</td></tr><tr><td>de diálise prontos para uso&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>diálise</td></tr><tr><td>one shot DH10B eletrocompetente E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>transformação de reações de ligação</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>isolamento de DNA genômico</td></tr><tr><td>SuperFect Transfecção Reagente</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>transfecção de 116 células</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>transfecção de 116 células</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 touch&nbsp;</td><td>Máquina de qPCR</td> <td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>Fenol/Clorofórmio/Álcool Isoamílico&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>purificação de DNA Cloreto de</td></tr><tr><td>césio</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>gradiente de densidade centrifugação</td></tr><tr><td>acetato de sódio 99%</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>DNA precipitação</td></tr><tr><td>LB médio&nbsp;</td><td>Meio de crescimento bacteriano</td> <td>Carl Roth</td><td>X968.3</td></tr><tr><td>etanol&nbsp; 99.8% puro</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5&nbsp;</td><td>Precipitação e lavagem de DNA</td></tr><tr><td>SDS 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>tampão de lise&nbsp; tampão</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>lise&nbsp; tampão</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>tampão de diálise/lise&nbsp; tampão</td></tr><tr><td>glicerol 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>tampão de diálise</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>tampão de diálise</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>tampão de diálise opcional</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>tampão de diálise opcional</td></tr><tr><td>sacarose</td><td>Carl</td><td>Roth 9286.1</td><td>tampão de diálise opcional</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>Tampão de diálise opcional</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.730.005</td><td>Armazenamento de preparações de vírus a -80 &graus; O</td></tr></tbody></table>

clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Os vetores adenovirais de alta capacidade (HCAdV) desprovidos de todas as sequências codificadoras virais representam um dos vetores de entrega de genes mais avançados devido à sua alta capacidade de embalagem (até 35 kb), baixa imunogenicidade e baixa toxicidade. No entanto, para muitos laboratórios, o uso de HCAdV é dificultado pelo complicado procedimento de construção do genoma do vetor e produção de vírus. Aqui, um protocolo detalhado para clonagem e produção eficiente de HCAdV com base no plasmídeo pAdFTC contendo o genoma do HCAdV é descrito. A construção de genomas de HCAdV é baseada em um sistema de vetores de clonagem utilizando endonucleases homing (I-CeuI e PI-SceI). Qualquer gene de interesse de até 14 kb pode ser subclonado no vetor shuttle pHM5, que contém um sítio de clonagem múltipla flanqueado por I-CeuI e PI-SceI. Após a liberação mediada por I-CeuI e PI-SceI do transgene do vetor shuttle, o transgene pode ser inserido no vetor de clonagem HCAdV pAdFTC. Devido ao grande tamanho do plasmídeo pAdFTC e aos longos locais de reconhecimento das enzimas usadas associadas à forte ligação ao DNA, é necessário um manuseio cuidadoso dos fragmentos de clonagem. Para a produção do vírus, o genoma do HCAdV é liberado pela digestão NotI e transfectado em uma linha celular produtora baseada em HEK293 expressando de forma estável a Cre recombinase. Para fornecer todos os genes adenovirais para amplificação de adenovírus, é necessária a coinfecção com um vírus auxiliar contendo um sinal de empacotamento flanqueado por locais loxP. A pré-amplificação do vetor é realizada em células produtoras cultivadas em superfícies e a amplificação em larga escala do vetor é realizada em frascos giratórios com células produtoras cultivadas em suspensão. Para a purificação do vírus, são realizadas duas etapas de ultracentrifugação baseadas em gradientes de cloreto de césio, seguidas de diálise. Aqui são apresentadas dicas, truques e atalhos desenvolvidos nos últimos anos trabalhando com este sistema vetorial HCAdV.

Aqui exemplos representativos para a clonagem, amplificação e purificação de preparações HCAdV são mostrados. Uma visão geral da estratégia de clonagem (Figura 1) e exemplos representativos para a clonagem e a libertação do genoma HCAdV por digestão com enzimas de restrição estão disponíveis (Figura 2). Um padrão de restrição típica após a libertação da cassete de expressão a partir de GI-pHM5 por PI-Sce I e I-I Ceu digerir e subsequent...

Um protocolo para geração de vetores adenovirais de alta capacidade sem todas as sequências codificadoras virais é apresentado. A clonagem de transgenes contidos no genoma do vetor é baseada em endonucleases homing. A amplificação do vírus em células produtoras cultivadas como células aderentes e em suspensão depende de um vírus auxiliar que fornece genes virais em trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir um vetor adenoviral de alta capacidade com gene deletado para entrega e expressão de transgenes terapêuticos em células ou organismos vivos. Este método pode auxiliar o campo da terapia gênica a entregar transgenes grandes que não cabem em outros vetores virais. A principal vantagem desta técnica é que os adenovírus de alta capacidade são desprovidos de genes virais.Usando esses vetores, até 35 kb de DNA estranho podem ser entregues. A aplicação dessa técnica estende-se à nossa terapia para doenças hereditárias, pois auxilia na entrega de abordagens terapêuticas para correção ou adição gênica. Este método fornece uma ferramenta avançada para a biodisposição de transgenes terapêuticos e pode ser aplicado em culturas celulares, bem como em organismos vivos.A demonstração visual deste método é crucial, pois a amplificação do vetor e a purificação do vetor exigem alguma experiência. É necessário ter o toque adequado durante a purificação do vetor. Analise uma alíquota de um plasmídeo de expressão do genoma de adenovírus de alta capacidade linearizado diluído em uma proporção de um para dez por eletroforese em gel.Um fragmento de nove quilo

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

Nos últimos 15 anos, os vetores derivados do adenovírus canino tipo 2 (CAV2) provaram sua eficiência na transdução de células in vitro e in vivo e são amplamente utilizados para vacinação e terapia gênica. Aqui, descrevemos um procedimento para construir, produzir e purificar vetores CAV2, dando origem a suspensões virais de alto título.

Produção e Purificação de Adenovírus não replicativa Canino Tipo 2 vectores derivados

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um bivalente adenovírus tipo 5 (Ad5) vector de prova de princípio Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, utilizando a estratégia de antígeno do capsídeo-Incorporação. Este vector foi demonstrado que exibem aptidão qualitativa, a capacidade de escapar soros Ad5-positiva, in vitro, e a antigenicidade, bem como a imunogenicidade dos antigénios incorporados.

Utilizando a estratégia Capsid-Incorporação Antigen para o desenvolvimento de abordagens adenovírus subtipo 5-Vectored de vacinas

Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente e reprodutível para produzir, título e lotes de qualidade-controle de vetores de vírus adeno-associado. Permite ao usuário obter uma preparação de vetor com alta-título (≥ 1 x 1013 vector genomas/mL) e um elevado grau de pureza, pronto para uso em vitro ou na vivo .

Produção, purificação e controle de qualidade para vetores de baseados em vírus Adeno-associado

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção de adenovírus usando o sistema pAdEasy. A tecnologia inclui a recombinação dos plasmídeos pAdEasy-1, a embalagem e amplificação do adenovírus, a purificação das partículas adenovirais do meio de cultura e lise celular, a titulação viral e o teste funcional do adenovírus.

Um método eficiente para a produção de adenovírus

Aqui fornecemos um procedimento detalhado para a produção em larga escala de vetores AAV de grau de pesquisa usando células hek 293 aderentes cultivadas em pilhas de células e purificação de cromatografia de afinidade. Este protocolo produz consistentemente &gt;1 x 1013 genomas vetoriais/mL, fornecendo quantidades vetoriais apropriadas para grandes estudos em animais.

Produção de vetores de vírus associados a Adeno em pilhas de células para estudos pré-clínicos em grandes modelos animais

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

À medida que o campo da terapia gênica continua a evoluir, há uma necessidade crescente de métodos inovadores que possam enfrentar esses desafios. Aqui, é apresentado um método único, que agiliza o processo de geração de vetores AAV de alto rendimento e alta pureza usando uma plataforma de fábrica de células, atendendo aos padrões de qualidade para estudos in vivo .

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Apesar das propriedades mecânicas excelentes e bioquímicos da aranha sedas, este material não pode ser colhido em grandes quantidades por meios convencionais. Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para produzir fibras de seda de aranha artificial, que é um processo importante para os investigadores que estudam a produção de seda de aranha e sua utilização como a próxima geração de biomateriais.

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Aprenda a produzir vetores adenovirais de alta capacidade sem genes virais para terapia gênica usando endonucleases de direcionamento. Este método permite entregar até 35 kb de DNA estrangeiro em células e organismos vivos.

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