Geração de escalável e de alto-Aspect Metallic nanocompósitos índices, em um Biológico Líquido Médio

O objetivo geral deste procedimento é gerar compósitos lineares de micro e nanoescala com alta razão de aspecto, utilizando materiais iniciais contendo cobre e cisteína. Isso é realizado primeiramente combinando nanopartículas de cobre sonicadas ou sulfato de cobre com cistina e água em um frasco de cultura estéril com ventilação. O segundo passo da síntese consiste em colocar os componentes combinados no frasco em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 graus Celsius por pelo menos seis horas.

Em seguida, o frasco é inspecionado visualmente e por microscopia de luz branca. Para determinar o grau de formação de estruturas lineares, o passo final consiste em interromper a síntese colocando o frasco de síntese em uma geladeira mantida a quatro graus Celsius. Por fim, utiliza-se microscopia digital para caracterizar as estruturas sintetizadas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a posição do eletrodo, é que a síntese descrita pode ser facilmente ampliada na forma líquida e o processo ocorre em condições fisiológicas.

As implicações desta técnica estendem-se à terapia ou diagnóstico de doenças como o câncer, pois estruturas sintetizadas podem ser degradadas por células, oferecendo potencialmente um meio para a entrega de fármacos. Tive a ideia inicial deste método quando realizávamos experimentos para investigar a toxicidade potencial de diferentes nanomateriais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas finais da síntese podem ser difíceis de aprender.

Procedimentos incorretos podem resultar em estruturas agregadas ou ausência total de estruturas. Para realizar a síntese por autoagregação utilizando nanopartículas de cobre ou CMPs, prepare uma solução de nanopartículas de cobre pesando pelo menos dois miligramas de CMPs. Use luvas descartáveis durante este passo para evitar o possível contato dos CMPs com a pele.

Coloque as nanopartículas em um frasco de vidro estéril vazio de 16 mililitros com CMPs. Adicione água desionizada estéril no volume apropriado para obter uma solução de dois miligramas por mililitro e vortexie a solução por 20 segundos para garantir a dispersão das nanopartículas antes do início da síntese. Não encha o frasco com água além da metade, pois isso inibirá.

A mistura por vortexamento faz com que os CMPs se depositem rapidamente no fundo do frasco e apresentem coloração escura. Soneque a solução de CNP por 17 minutos à temperatura ambiente para garantir a dispersão máxima dos CMPs antes do início da síntese. Verifique periodicamente para assegurar que os CMPs estejam sendo misturados devido à sonicação; após uma sonicação bem-sucedida, os CMPs permanecem suspensos na solução por pelo menos 30 minutos, e a solução apresenta coloração escura.

Pese 7,29 miligramas de cistina para a síntese. Como a cistina não é diretamente solúvel em água, coloque a cistina em um recipiente de pesagem antiestático até o recipiente contendo cisteína. Adicione um volume suficiente de hidróxido de sódio estéril 1 molar para que a cistina se dissolva completamente, obtendo uma solução de 72,9 miligramas por mililitro.

Dissolva completamente a cisteína em 100 microlitros de hidróxido de sódio um molar. Em seguida, combine sete microlitros da cisteína dissolvida com 6.643 microlitros de água estéril em um frasco de síntese estéril. Coloque o frasco com a solução combinada na incubadora por 30 minutos a 37 graus Celsius, com a tampa do frasco ventilada para proporcionar uma mistura eficaz.

Esta será a solução de trabalho de cisteína. Re-suspenda a solução de CNP de dois miligramas por mililitro por meio de vortex por 30 segundos, já que os CMPs terão sedimentado após a etapa de sonicação, para um volume total de síntese de sete mililitros. Transfira a solução de trabalho de cisteína para um frasco de cultura celular de 25 centímetros quadrados e adicione 350 microlitros dos CMPs re-suspendidos.

Substitua a tampa no frasco e aperte-a para que fique firme. Após combinar todos os componentes para a síntese, misture suavemente o frasco girando-o quatro a cinco vezes. Coloque o frasco no incubador de dióxido de carbono e ventile o frasco afrouxando a tampa para que haja troca de gases para dentro e para fora do frasco.

Durante a síntese, deixe a reação ocorrer no incubador por aproximadamente 24 horas. Durante esse período, é possível observar, por microscopia e a olho nu, a formação de compostos altamente lineares. Este passo é essencial para garantir que algumas estruturas estejam se formando e que o processo de autoorganização não prossiga por tempo excessivo.

Interrompa a síntese dos biocompósitos assim que estruturas lineares forem observadas no frasco, fechando firmemente a tampa do frasco de síntese, rotulando o frasco com as condições de síntese, incluindo a data utilizada para a síntese e incubação, e o tempo de síntese antes da interrupção. Em seguida, armazene o recipiente em geladeira, uma vez que as estruturas geradas permanecem estáveis nesta forma por pelo menos um ano. Alternativamente, para realizar a síntese por autoagregação utilizando sulfato de cobre, substitua os CMPs pelo sal de sulfato de cobre usando técnica estéril, dissolvendo pelo menos dois miligramas de sulfato de cobre em um volume suficiente de água desionizada estéril para obter uma solução de dois miligramas por mililitro.

Os cristais de sulfato de cobre se dissolvem facilmente nesta concentração, mas agite o frasco em vórtex, se necessário, e inspecione visualmente para garantir que todos os cristais tenham sido dissolvidos após o preparo do sulfato de cobre. Realize a síntese conforme acabou de ser demonstrado, mas substitua os CMPs pelo sulfato de cobre. Caracterize os biocompósitos derivados dos CMPs e do sulfato de cobre por microscopia de luz branca e por microscopia eletrônica para caracterização e inspeção dos biocompósitos.

A parasíntese por microscopia de luz branca utiliza um microscópio invertido. Os compósitos sedimentarão na superfície inferior do frasco em poucos minutos após o frasco ser colocado na posição horizontal e, então, poderão ser focalizados. Utilize a configuração de campo claro no microscópio para maximizar o contraste entre os biocompósitos e o meio líquido. Os compósitos derivados de CMPs e sulfato de cobre aparecerão com coloração transparente a opaca, enquanto os agregados de CNP não reagidos aparecerão com coloração muito escura.

Utilize microscopia invertida de luz branca para avaliar a eficácia da síntese em um determinado experimento. Por exemplo, documente a presença ou ausência de CMPs não reativos na síntese. Frascos utilizados para biocompósitos derivados de CNP provenientes de frascos com diferentes parâmetros, como tempo de incubação ou duração da sonicação.

Os CMP individuais são pequenos demais para serem observados com um microscópio óptico, mas os agregados de CNP não reativos aparecerão como objetos escuros e com formato arredondado. Isso contrasta com os compostos de CNP sintetizados com sucesso, que terão alta razão de aspecto, forma linear e uma variedade de comprimentos diferentes. Evite realizar a síntese por um período excessivamente longo antes da interrupção, pois isso resultará em estruturas altamente ramificadas do tipo ouriço, que são difíceis de dispersar em estruturas individuais uma vez formadas.

Utilize também microscopia invertida com luz branca para avaliar a eficácia da síntese em um determinado experimento usando sulfato de cobre. Como o sulfato de cobre se dissolve completamente, ao utilizar este protocolo, a solução parecerá menos escura do que a solução obtida pela síntese utilizando CMPs.

Documente o tamanho e a extensão dos compósitos de sulfato de cobre comparando frascos com diferentes condições de síntese, como o tempo de síntese antes da interrupção. Para concentrar primeiramente os compósitos bio por parasíntese, adicione seis mililitros de estruturas derivadas de CNP ou estruturas derivadas de sulfato de cobre a um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue por 10 minutos a 500 vezes G e temperatura ambiente para formar um pellet em volumes menores.

Adicione 500 microlitros de estruturas em solução a tubos de 0,6 mililitros, centrifugue a 2000 ×g e temperatura ambiente por pelo menos 10 minutos para formar um pellet. Coloque as estruturas em água estéril desionizada e sonique por pelo menos 10 minutos para ressuspender. Com o uso desse processo ao longo do tempo, as estruturas tornam-se fragmentadas e menores no comprimento médio.

Documente as alterações nos tamanhos dos compostos com diferentes tempos de sonicação utilizando um microscópio invertido de luz branca e uma câmera digital. Nossos resultados representativos mostram que, na descoberta de biocompósitos em meio de cultura celular ao longo de 82 horas, dispersões iniciais uniformes de CMPs se agregam em microestruturas. Com o tempo, as partículas são eliminadas e formam-se agregados maiores. Por fim, aparecem agregados maiores com estruturas lineares, formando estruturas do tipo ouriço.

É mostrada a transformação de CMPs em biocompósitos lineares. CMPs foram combinados com cisteína e água a partir de dispersões iniciais homogêneas de CMPs. Agregados formam microestruturas após três horas, e estruturas intermediárias se formam em seis horas.

Estruturas de alta razão de aspecto formam microscopia eletrônica. A caracterização dos biocompósitos sintetizados é mostrada por microscopia eletrônica de transmissão, que revela o material inicial de CNP com os compósitos lineares formadores; os CMPs iniciais são arredondados, conforme mostrado por microscopia eletrônica de varredura ou MEV. Características nano e micro de compósitos formados a partir de CMPs e cisteína são mostradas por MEV.

As características dos compósitos formados a partir de sulfato de cobre e cisteína também são mostradas por espectroscopia dispersiva de energia de microscopia eletrônica de varredura. A análise elementar por espectroscopia de raios X de materiais iniciais e componentes lineares sintetizados é apresentada. Os CMPs iniciais mostram um pico acentuado de cobre sem enxofre.

Os biocompósitos de CMPs e cistina mostram o surgimento de picos de enxofre e carbono devido à cistina a partir do sulfato de cobre. O material apresenta picos para cobre e enxofre. Os biocompósitos de sulfato de cobre e cistina mostram o surgimento de picos de carbono devido à cistina. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 12 a 24 horas se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de monitorar o progresso da síntese tanto a olho nu quanto pelo microscópio, para que as estruturas sintetizadas não fiquem excessivamente agregadas. Após este procedimento, outros métodos, como a marcação fluorescente das estruturas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como se as estruturas sintetizadas se ligam a células. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar reagentes para a síntese, combiná-los corretamente, monitorar o progresso da síntese e concentrar e modificar as estruturas após a síntese.