Name: Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a induzir lesão de isquemia-reperfusão em corações isolados de rato usando o sistema de perfusão Langendorff. Este método permite avaliar a função miocárdica por meio da geração de pressão ventricular em tempo real.

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Esta publicação foi apoiada pela Pesquisa Clínica e Translacional (SCTR) Institute Carolina do Sul, com uma casa acadêmico na Universidade de Medicina da Carolina do Sul, NIH / NCATS Grant Número UL1 TR000062. Um apoio adicional foi fornecida pela VA prémio de mérito BX002327-01 de DRM. DJH foi apoiado pelo NIH / NCATS Grant Número TL1 TR000061 e pelo NIH Grant Número T32 GM008716. SEA foi apoiado pelo NIH Grant Número T32 HL07260.

Todos os procedimentos listados aqui foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Medicina da Carolina do Sul. As experiências aqui descritas são, experiências agudas não-sobrevivência. Como tal, não há uso de pomada e uma suíte de cirurgia estéril não é necessária. A eutanásia por exsanguinação é conseguida durante a colheita do coração. 1. Experimental Preparação <ol><li> Configure ou uma pressão constante ou fluxo constante de perfusão Langendorff Aparelho 4. </li><li> Prepare a 4 L de Krebs Henseleit modificado (em mM: NaCl 112, KCl 5, MgSO4 1,2, 1 K 2 HPO 4, 1,25 de CaCl2, 25 de NaHCO3, 11 de D-glicose, 0,2 de ácido octanóico, pH = 7,4). <ol><li> Faça 10x buffers de ações. <ol><li> Dissolve-se NaCl, KCl, MgSO4, e K 2 HPO 4 em 3 L de água ultrapura. </li><li> Dissolver CaCl2 em 500 ml de água ultrapura with 40 ml de 1 N de HCl. </li><li> Adiciona-se lentamente solução de CaCl2 ao tampão feito em 1.2.1.1. Adiciona-se água ultra-pura o suficiente para o total de 4 L. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de um filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Dissolver NaHCO 3 em 4 L de água ultrapura. Deixar a agitar durante 1 h antes de se filtrar através de pelo filtro de 0,8 um. Armazenar a 4 ° C </li></ol></li><li> Combinar 400 mL de 10x tampão de Krebs Henseleit com 400 ml de 10x tampão de NaHCO3. Adicionar água ultrapura suficiente para totalizar 4 L. Dissolver glicose e ácido octanóico, sob agitação. Filtrar através de filtro de 0,8 um. </li></ol></li><li> Sistema de preparar-se para o coração. <ol><li> Adicionar 2 L de tampão de filtrado para um frasco de 4 L 38 colocado em cima da torneira de passagem ligado à cânula aórtica. Isto irá proporcionar uma pressão de perfusão de 70-80 mmHg para o coração, que é a pressão de perfusão recomendado 4. </li><li> Insira gás dispersão bubbler para o buffer na garrafa. </li><li> Execute o tampão através do sistema, tendo a certeza de eliminar quaisquer bolhas de dentro da tubulação. </li><li> Ligue gás (95% de O2 / 5% de CO 2), pelo menos, 30 min antes do coração está a ser colocado no sistema. Use uma sonda de fluxo de gás e analisador de gases de sangue para verificar a saturação de oxigênio. </li></ol></li><li> Preparar material cirúrgico e balão. <ol><li> Para a colheita de coração, prepare um par de tesouras cirúrgicas 6,75 &quot;, um par de 4.5&quot; tesouras, dois pares de hemostats, dois conjuntos de fórceps caramalt, duas seringas com agulhas de 27 G, 2 peças de 0-medidor fio de seda (cerca de 15 cm de comprimento), uma cânula farpado 1/16 polegadas, e uma cânula traqueal. </li><li> Para montar cânula traqueal, colar um pequeno pedaço de 1/16 de polegada de diâmetro tubo de plástico a um conector Y. </li><li> Para montar aparelhos balão: anexar uma agulha gavagem a uma peça de 1/16 de polegada tubulação, em seguida, anexar a tubulação para habitação transdutor de pressão. Uma pequena seringa ligada ao outro lado da pressão transducer habitação vai permitir que a inflação ea deflação do balão. <ol><li> Corte um quadrado de envoltório e local ponta de plástico de uma agulha gavage no centro. Envolva o envoltório de plástico em torno da agulha por sonda. </li><li> Encha o balão com soro fisiológico e amarrar com duas suturas. Inflar balão para garantir que não haja vazamentos. O volume de solução salina dentro do balão inflado deve ser de aproximadamente 200 ul, mas pode variar dependendo do tamanho do rato. </li><li> Como alternativa, use um berço dedo de látex no lugar do plástico. Coloque agulha gavage dentro dedo berço, encha com solução salina e amarrar. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Colheita do coração <ol><li> Contenha um rato Sprague Dawley utilizando um decapicone ou outro dispositivo de segurança manual. Pesar rato. </li><li> Administrar cetamina / mistura de xilazina (0,85 mg / kg de cetamina e 0,15 mg / kg de xilazina) através de injecção intraperitoneal para anestesiar ratos. Esta dose de anestésico irá fornecer suficientes para anestesia20-40 min, mas o procedimento deve ser concluído o mais rapidamente possível após a anestesia é confirmada. </li><li> Confirme grau adequado de anestesia pelo teste toe pitada reflexo. </li><li> Traqueotomia <ol><li> Retirar pele de meados de forepaw à base de mandíbula, utilizando hemostats para elevar pele e tesoura para fazer incisão. Manter a pele elevada para separá-lo do músculo subjacente, permitindo que um corte ao longo da pele e removê-lo. </li><li> Usando hemostats, levante o tecido glandular e fazer uma incisão horizontal na fáscia inferior ao tecido glandular. Use hemostats para espalhar incisão aberta, tomando cuidado para não nick as veias jugulares. </li><li> Usando pinças hemostáticas, músculo sobrejacente pitada traqueia, e usando uma tesoura fazer uma incisão transversal no músculo logo abaixo da ponta das pinças hemostáticas. Usando pinças hemostáticas, espalhar tecido para além de revelar traqueia. </li><li> Insira com cuidado hemostats sob traquéia, limpando fáscia enquanto progredindo suavemente avançar e recuar hemostats. </li><li>Uma vez hemostats são colocados com sucesso por trás da traquéia, beliscar 0-0 sutura de seda com hemostats e hemisect a traqueia com um pequeno par, de tesoura afiada. </li><li> Insira cânula traqueal na traquéia hemisected, puxe sutura por trás da traquéia, e amarrar a sutura ao redor da traqueia canulada, ancorando a sutura com o Y-virilha da cânula com um nó cirurgiões. </li><li> Usando uma agulha de 27 G, injectar 1.000 U / kg de heparina na veia jugular e permitir a circular durante 30 seg. </li></ol></li><li> Toracotomia <ol><li> Retirar pele de meados de abdômen para região mid-pata dianteira por compressão com hemostats e corte com tesoura. </li><li> Adicione uma incisão transversal ¾ de polegada na parede muscular abdominal, imediatamente abaixo do diafragma. </li><li> Faça uma incisão vertical até a parede a parede abdominal e torácica, cortando ao longo do esterno. </li><li> Corte o diafragma volta bilateralmente, em seguida, espalhar caixa torácica para revelar coração, ribcage braçadeira com hemostats para garantir que ele permanece spread. </li&gt; <li> Usando hemostats, remova gentilmente timo, expondo a aorta ascendente. </li><li> Tease hemostats através de loop aórtica, avançar e recuar hemostats e gentilmente espalhando fascia para permitir ponta de hemostats completamente. </li><li> Use hemostats para puxar 0-0 sutura de seda por trás da aorta ascendente, amarre sutura em um meio-quadrado nó frouxo. </li><li> Virar a torneira para iniciar o fluxo de tampão de perfusão, hemisect aorta e imediatamente inserir uma cânula para lúmen da aorta. Rapidamente apertar um nó meia-quadrado e completar o nó, apertando bem. </li><li> Use a tesoura para dissecar coração longe dos grandes vasos, remova coração do peito e fixe a coluna de perfusão. </li><li> Corte o excesso de tecido pulmonar e permitir que o coração se equilibrar em coluna por cerca de 15 min antes da inserção de balão. Usar uma taxa de fluxo normal do tampão por meio de coração de 10-20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. Langendorff de perfusão e isquemia-reperfusão Lesão <ol><li> Colocação de pré LVssure balão <ol><li> Desinflar o balão ao rolar em forma de cone e vire torneira para garantir balão continua a ser esvaziado. </li><li> Excise átrio esquerdo com um pequeno par de tesouras para expor o acesso à válvula mitral. </li><li> Insira balão através do átrio esquerdo e da válvula mitral em ventrículo esquerdo. </li><li> Inicie o software de monitoramento de pressão (LabChart Pro). </li><li> Encher o balão através da abertura de válvula e suavemente o aumento da quantidade de solução salina em balão até que a pressão diastólica leitura de micromanómetro excede zero. </li><li> Para verificar a resposta comprimento-tensão, inflar o balão lentamente a uma pressão diastólica de 75 mmHg, desinflar lentamente, repetir uma vez. </li><li> Regule a pressão diastólica de 10 mm Hg através da modulação da quantidade de solução salina no balão. Vire torneira para selar balão a este nível de inflação, e manter sistema de pressão fechado entre balão LV e transdutor de pressão. </li><li> Lower coração em câmara câmara ea tampa aquecida com plástico. </li></ol></li><li> De Anúnciosministração de isquemia-reperfusão Lesão <ol><li> Ligue o fundo da câmara de aquecimento e câmara de permitir a encher-se com tampão de Effused. </li><li> Quando o buffer tenha submergido coração, virar a torneira para parar o fluxo de tampão para o coração, induzindo isquemia global. Tempo de isquemia pode variar de acordo com os objetivos do experimento. </li><li> Após 30 min de isquemia, virar a torneira para restaurar o fluxo de tampão para o coração, o início da reperfusão. </li><li> Permitir reperfusão do coração durante 1 hora antes de terminar o experimento. Use tempos de reperfusão variáveis, dependendo dos objetivos do experimento. </li></ol></li><li> Rescisão de Experiência e de colheita de Tissue <ol><li> Usando a porta lateral de torneira, administrar 10 ml de solução salina tamponada com fosfato a 4 ° C para o coração a uma taxa de 10 ml / min para parar o coração. </li><li> Remover coração da coluna perfusão, aparar restante tecido atrial. </li><li> Coloque coração em uma matriz de tecido corte de aço inoxidável, cubra com Parafilm, e colocar a -80 ° C durante 8 minutos, ou até que o coração tem uma consistência como marshmallows. </li><li> Remova o bloco do freezer e coloque razorblades em cortar matriz de cortar o coração em fatias de 2 mm. Blocos de tecido também pode ser comprado com outros que 2 mm tamanhos fatia. </li><li> Remover fatias um de cada vez e soltar em nitrogênio líquido a piscar congelar por estudos bioquímicos. Reter a fatia ventricular terceira a partir do ápice para a coloração do enfarte. </li><li> Remover o tecido a partir de azoto líquido e armazenar a -80 ° C até à utilização em experiências bioquímicas. </li></ol></li><li> Enfarte Coloração <ol><li> Incubar a terceira fatia ventricular em 10 mL de 1% w / v de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) a 37 ° C durante 15 min. Nota: A incubação no TTC pode ser realizada durante 15 ou 30 min, sem qualquer alteração na eficácia 15. </li><li> Transferir fatia de tecido de TTC a 10% de formalina tamponada e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante a noite. Para melhores resultados, ouvirts deve ser retirado de formalina e fotografada dentro de 24 horas 4. </li><li> Fotografia manchado fatia e uso de software como o ImageJ para estimar o tamanho do infarto de acordo com o protocolo do fabricante. Tirar fotografias, logo que possível após a sua fixação, como o corante vai desaparecer com o tempo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bainey, K. R., Armstrong, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+perspectives+on+reperfusion+injury+in+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Clinical perspectives on reperfusion injury in acute myocardial infarction.</a> American Heart Journal. 167 (5), 637-645 (2014).</li>
<li>Beyersdorf, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+controlled+reperfusion+strategies+in+cardiac+surgery+to+minimize+ischaemia%2Freperfusion+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">The use of controlled reperfusion strategies in cardiac surgery to minimize ischaemia/reperfusion damage.</a> Cardiovascular Research. 83 (2), 262-268 (2009).</li>
<li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchugen+am+%C3%BCberlebenden+S%C3%A4ugethierherzen%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archives%22%5BJournal%5D)">Untersuchugen am überlebenden Säugethierherzen.</a> Pflügers Archives. 61, 291-307 (1895).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+The+langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: The langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li>
<li>Tyers, G. F., Todd, G. J., Neely, J. R., Waldhausen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+myocardial+protection+from+ischemic+arrest+by+intracoronary+tetrodotoxin+administration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The mechanism of myocardial protection from ischemic arrest by intracoronary tetrodotoxin administration.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 69 (2), 190-195 (1975).</li>
<li>Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconditioning+with+ischemia%3A+A+delay+of+lethal+cell+injury+in+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Preconditioning with ischemia: A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium.</a> Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).</li>
<li>Kolwicz, S. C., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiac+function+and+energetics+in+isolated+mouse+hearts+using+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy.</a> The Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).</li>
<li>Fishbein, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+phase+acute+myocardial+infarct+size+quantification%3A+Validation+of+the+triphenyl+tetrazolium+chloride+tissue+enzyme+staining+technique%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique.</a> American Heart Journal. 101 (5), 593-600 (1981).</li>
<li>Aune, S. E., Herr, D. J., Mani, S. K., Menick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+class+I+but+not+class+IIb+histone+deacetylases+exerts+cardiac+protection+from+ischemia+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of class I but not class IIb histone deacetylases exerts cardiac protection from ischemia reperfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 138-145 (2014).</li>
<li>Yellon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protective+role+of+heat+stress+in+the+ischaemic+and+reperfused+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The protective role of heat stress in the ischaemic and reperfused rabbit myocardium.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 24 (8), 895-907 (1992).</li>
<li>Khaliulin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+preconditioning+of+isolated+rat+hearts--a+potent+cardioprotective+mechanism+involving+a+reduction+in+oxidative+stress+and+inhibition+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Temperature preconditioning of isolated rat hearts--a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 3), 1147-1161 (2007).</li>
<li>Molojavyi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ketamine+and+its+isomers+on+ischemic+preconditioning+in+the+isolated+rat+heart%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Effects of ketamine and its isomers on ischemic preconditioning in the isolated rat heart).</a> Anesthesiology. 94 (4), 623-629 (2001).</li>
<li>Asfour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Sill, B., Hammer, P. E., Cowan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+langendorff-perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of langendorff-perfused rat hearts.</a> The Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Ferrera, R., Benhabbouche, S., Bopassa, J. C., Li, B., Ovize, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+hour+reperfusion+is+enough+to+assess+function+and+infarct+size+with+TTC+staining+in+langendorff+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">One hour reperfusion is enough to assess function and infarct size with TTC staining in langendorff rat model.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 23 (4), 327-331 (2009).</li>
<li>Sutherland, F. J., Shattock, M. J., Baker, K. E., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isolated+perfused+heart%3A+Characteristics+and+cautions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mouse isolated perfused heart: Characteristics and cautions.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (11), 867-878 (2003).</li>
<li>Reichelt, M. E., Willems, L., Hack BA,, Peart, J. N., Headrick, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+and+coronary+function+in+the+langendorff-perfused+mouse+heart+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac and coronary function in the langendorff-perfused mouse heart model.</a> Experimental Physiology. 94 (1), 54-70 (2009).</li>
<li>Xie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+blunts+ischemia%2Freperfusion+injury+by+inducing+cardiomyocyte+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition blunts ischemia/reperfusion injury by inducing cardiomyocyte autophagy.</a> Circulation. 129 (10), 1139-1151 (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O coração perfundido isolado de rato pode ser utilizado com êxito para estudar o efeito da intervenção farmacológica no pré-condicionamento cardíaco em lesão de reperfusão de isquemia 9. No entanto, existem alguns passos essenciais para o procedimento que deve ser normalizados, a fim de assegurar a reprodutibilidade dos resultados. A manutenção de uma temperatura de 37,4 ° C no interior do sistema é crítica, já que mesmo a hipotermia e hipertermia pode causar pré-condicionamento cardíaco 10,11. O t...

A elucidação dos eventos subjacentes à resposta cardíaca tanto para isquemia e reperfusão são essencial para melhorar o tratamento de enfarte 1 e procedimentos cirúrgicos cardíacos do miocárdio que necessitam pinçamento aórtico 2. Embora os modelos in vivo de lesão de reperfusão de isquemia permitir análise de ponto final muito úteis, eles não são tão eficazes para estudar os efeitos funcionais da isquemia lesão de reperfusão aguda em tempo real. Além disso, em modelos de isquemia reperfusão in vivo geralmente produzem uma variabilidade significativa da dimensão do enfarte e a entrega directa de drogas para o coração no momento da reperfusão é um desafio. A utilização de um sistema de coração de Langendorff isolado para estudar a lesão por isquemia reperfusão permite a avaliação funcional em tempo real dos tratamentos farmacológicos, área uniforme do tecido enfartado e entrega instantânea de fármaco directamente ao miocárdio. Descrita pela primeira vez by Oscar Langendorff em 1895 3, o coração de Langendorff isolado é um modelo robusto para o estudo da lesão de reperfusão de isquemia, tendo sido utilizado na pesquisa de isquemia reperfusão durante os últimos 40 anos 4,5. Aqui, algumas modificações são feitas para aperfeiçoar o coração isolado para análise funcional. Em situ canulação da aorta, enquanto o coração está a bater garante que o coração não experimentar o pré-condicionamento isquémico, que iria alterar os resultados dos ensaios isquemia reperfusão 6. Para facilitar isto, uma traqueotomia é efectuada, permitindo a ventilação e garantir a estabilidade fisiológica do rato durante a cirurgia. O coração é depois ligado a uma coluna em espiral com camisa de água de vidro através da qual tampão de Krebs Henseleit é entregue através de perfusão retrógrada directamente para a aorta. Um balão cheio de soro fisiológico é inserido no ventrículo esquerdo e ligado a um transdutor de pressão, que permite a medição das pressões em tempo real a partir do um ventrículod cálculo de vários parâmetros funcionais. Na conclusão do experimento, o coração é lavada com solução salina fria para prender contração e flash congelado em nitrogênio líquido para permitir a análise a jusante dos níveis de DNA, RNA e proteínas. Assim modificado, o coração de Langendorff perfundido serve como um sistema eficaz para a monitorização directa do efeito fisiológico de intervenções farmacológicas, em qualquer momento de forma aguda durante a lesão por isquemia-reperfusão.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Bicarbonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G8270</td><td></td></tr><tr><td>Ácido octanóico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de pressão médica</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Bomba peristáltica</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Cabeça de bomba de carga fácil Masterflex</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria circulante aquecido</td> Módulo de fluxo de tubulação <td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr> Console de pesquisa modular <tr><td></td><td>transônico</td><td>TS410</td><td></td></tr> Sensor <tr><td>de fluxo em linha</td><td></td> transônico T402 <td></td> Transonic ME2PXN <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> PowerLab <td></td></tr><tr><td> Instrumento</td> PL3508 da aquisição de dados <td>do dispositivo da aquisição</td> de dados do dispositivo <td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart instrumentos</td><td>MLU60/8</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> do anúncio

indução e avaliação de isquemia-reperfusão em langendorff-perfundidos rato corações

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Os eventos bioquímicos que envolvem a lesão de isquemia e reperfusão no cenário agudo são de grande importância para promover novas opções de tratamento para infarto do miocárdio e complicações cardíacas da cirurgia torácica. A capacidade de certos medicamentos de pré-condicionar o miocárdio contra a lesão de isquemia e reperfusão levou a vários ensaios clínicos, com pouco sucesso. O modelo de coração isolado permite a observação aguda dos efeitos funcionais da lesão de isquemia-reperfusão em tempo real, incluindo os efeitos de várias intervenções farmacológicas administradas em qualquer momento antes ou dentro da janela de lesão de isquemia-reperfusão. Como breves períodos de isquemia podem pré-condicionar o coração contra lesão isquêmica, a canulação aórtica in situ é realizada para permitir a avaliação funcional do miocárdio não pré-condicionado. Um balão cheio de solução salina é colocado no ventrículo esquerdo para permitir a medição em tempo real da geração de pressão. A lesão isquêmica é simulada pela cessação do fluxo do tampão de perfusão, seguida de reperfusão. A duração da isquemia e da reperfusão pode ser modulada para examinar eventos bioquímicos em um determinado momento. Embora o modelo cardíaco isolado de Langendorff não permita a consideração de eventos sistêmicos que afetam a isquemia e a reperfusão, é um excelente modelo para o exame de eventos funcionais e bioquímicos agudos dentro da janela de lesão de isquemia e reperfusão, bem como o efeito da intervenção farmacológica no pré e pós-condicionamento cardíaco. O objetivo deste protocolo é demonstrar como realizar a canulação aórtica in situ e a excisão cardíaca seguida de lesão de isquemia/reperfusão no modelo de Langendorff.

O aparelho de balão do ventrículo esquerdo permite a monitorização em tempo real da pressão desenvolvida pela entidade ventrículo esquerdo (Figura 1). Como descrito anteriormente 7, este traçado da pressão pode ser usado para calcular muitos dos parâmetros da função ventricular. Estes cálculos podem ser realizados na fase de linha de base, bem como a fase de reperfusão, em média, em traços múltiplos dentro de cada grupo, e comparadas a fim de determinar se a intervenção farmacológica resultou...

O coração isolado de rato é um modelo duradouro para lesão de isquemia e reperfusão. Aqui, descrevemos o processo de coleta do coração batendo de um rato por meio de canulação aórtica in situ, perfusão de Langendorff do coração, lesão simulada de isquemia-reperfusão e coloração de infarto para confirmar a extensão do insulto isquêmico.

Indução e Avaliação de isquemia-reperfusão em Langendorff-perfundidos Rato Corações

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

O objetivo geral deste procedimento é modelar a isquemia e a lesão por reperfusão ex vivo. Isso é realizado primeiramente anestesiando um rato e abrindo o tórax para canular a aorta em C dois, impedindo assim o condicionamento isquêmico do miocárdio. Em seguida, o coração é removido e conectado a um aparelho de perfusão de Langendorff.O passo final consiste em induzir uma lesão por isquemia e reperfusão interrompendo o fluxo do tampão por um determinado período e, em seguida, restaurando o fluxo. Por fim, a geração de pressão ventricular é utilizada para demonstrar o efeito da lesão por isquemia e reperfusão na função miocárdica. Este método pode ser empregado para ajudar a responder perguntas fundamentais na área da isquemia cardíaca e reperfusão, como quais eventos moleculares ocorrem nas primeiras horas dinâmicas da lesão por isquemia e reperfusão.Para começar, calcule o anestésico necessário após confirmar que o rato está anestesiado. Inicie a traqueotomia abrindo primeiramente a pele da região mediana das quatro patas até a base da mandíbula. Use pinças hemostáticas para afastar os tecidos, expondo a musculatura.Em seguida, com pinças hemostáticas, levante o tecido glandular e use tesoura para fazer uma incisão inferior na fáscia. Abra o tecido exposto com outro par de pinças hemostáticas. E tenha cuidado para não lesar a jugular.Agora, faça uma incisão transversal no músculo que recobre a traqueia com tesoura e com a ajuda de hemostatos. Em seguida, use os hemostatos para expor cuidadosamente a traqueia, posicionando os hemostatos sob a traqueia e removendo a fáscia no processo. Depois, prenda uma sutura de seda zero, zero com os hemostatos atrás da traqueia.Em seguida, use uma tesoura para realizar a hemiseção. Disseque a traqueia até alcançar a traqueia. Insira a cânula traqueal e fixe-a com o ponto, sem amarrar o ponto à bifurcação em Y da cânula.Agora, com uma seringa e agulha de 27 gauge, injete 1000 unidades de heparina por quilograma na veia jugular. Aguarde 30 segundos antes de prosseguir com a toracotomia. Inicie a toracotomia removendo a pele entre o abdômen médio e o quarto par médio usando pinças hemostáticas e tesoura.Em seguida, faça um corte de três quartos de polegada na parede abdominal logo abaixo do diafragma. Continue o corte verticalmente ao longo do esterno. Em seguida, corte o diafragma bilateralmente para expor a caixa torácica.Agora, abra a caixa torácica e fixe-a para o lado com pinças hemostáticas, revelando assim o coração. A posição da dupla cânula na aorta é a etapa mais crítica do procedimento. A cânula deve ser inserida com precisão e amarrada rapidamente para evitar que o coração sofra um breve período de isquemia, o que alteraria os resultados da reperfusão após isquemia subsequente.Experimente com hemostatos. Remova cuidadosamente o timo para acessar a aorta ascendente. Maneje os hemostatos através do laço aórtico e pela fáscia.Em seguida, passe um fio de seda 00 através da abertura e amarre um nó simples solto. Agora, inicie o fluxo do tampão de perfusão através da cânula. A seguir, realize a hemissecção, dissecando a aorta e inserindo imediatamente a cânula na luz aórtica.Fixe a cânula apertando o nó e finalizando-o em um nó quadrado. Usando tesoura, disseque o coração dos grandes vasos. Uma vez liberado, remova-o e fixe-o na coluna de perfusão.Retire o tecido pulmonar em excesso. Após cerca de 15 minutos, o coração estará equilibrado com o fluxo normal de tampão entre 10 e 20 mililitros por minuto. Assim que o coração estiver conectado à coluna, o balão pode ser inserido.Primeiro, desinfle o balão, enrolando-o em formato de cone. Bloqueie o fluxo para o balão assim que ele estiver desinflado. Em seguida, acesse a válvula mitral mediante a excisão do átrio esquerdo do coração.Em terceiro lugar, insira o balão através da válvula mitral até o ventrículo esquerdo. Agora, comece a monitorar a pressão sistólica e diastólica com o software Lab Chart Pro, inflando o balão até que a pressão seja maior que zero. Em seguida, verifique a resposta de comprimento-tensão.Inflar o balão lentamente até que a pressão atinja 75 milímetros de mercúrio. Em seguida, desinflar lentamente e repetir. Reduzir a pressão novamente até 10 milímetros alterando o volume de soro fisiológico no balão.Em seguida, fixe o balão nesta pressão e mantenha um sistema de pressão fechado entre o balão e o transdutor. Por fim, abaixe o coração em uma câmara aquecida e feche-o com filme plástico. A câmara deve ser tampada para que se encha com um tampão fundido.Uma vez que o coração esteja submerso, pare o fluxo do tampão. Isso induz isquemia global pelo tempo necessário. Neste caso, 30 minutos.Após 30 minutos, interrompa a isquemia restaurando o fluxo do tampão no coração e desconectando a câmara. Permita a reperfusão pelo tempo desejado e, em seguida, encerre o experimento, que neste caso ocorrerá após uma hora de reperfusão a partir do orifício lateral da torneira de três vias. Administre 10 mililitros de PBS frio a 4 °C durante um minuto.Isso irá parar o coração. Em seguida, remova o coração da coluna e retire qualquer tecido atrial remanescente. Seque o coração com leve batida, transfira-o para uma matriz de corte e cubra com perfil.Congele o coração a menos 80 graus Celsius por oito minutos ou até que atinja a consistência de um marshmallow. Usando lâminas de barbear, corte o coração em fatias de dois milímetros ou, se preferir, remova cada fatia individualmente e congele-a em nitrogênio líquido. Para estudos bioquímicos, as fatias congeladas devem então ser armazenadas a menos 80 graus Celsius.Para a coloração de infarto, mantenha uma fatia sem congelar em nitrogênio líquido. Com o protocolo descrito. O aparelho com balão no ventrículo esquerdo permite o monitoramento em tempo real da pressão desenvolvida pelo ventrículo esquerdo contrátil.Em um coração normal, a pressão desenvolvida varia de 70 a 130 milímetros de mercúrio. Após uma lesão isquêmica, a pressão desenvolvida é reduzida e a pressão diastólica final aumenta quando os animais são tratados. Um agente de condicionamento como o inibidor de HDAC das classes um e dois B, saha, administrado antes da excisão, pode fazer com que a pressão basal varie e os efeitos da lesão por isquemia e reperfusão sejam atenuados.Outras medidas da função ventricular esquerda também podem ser diretamente obtidas ou calculadas a partir da saída do software. Ao investigar o coração lesionado com TTC, que cora de vermelho o tecido metabolicamente ativo, ficou evidente que os corações submetidos à lesão por isquemia e reperfusão eram substancialmente menos metabólicos, indicando que continham tecido infartado após este procedimento. Técnicas como PCR quantitativa em tempo real, Western blotting e espectrometria de massa podem ser usadas para responder perguntas como: quais são os efeitos bioquímicos e genéticos da isquemia, da lesão por reperfusão e do tratamento farmacológico no coração?

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Research

JoVE Journal

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