Name: A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a induzir endotélio hemogênico e células sanguíneas a partir de células-tronco pluripotentes humanas por sobre-expressão de fatores de transcrição. Este método permite estudar a transição endotelial-hematopoética in vitro.

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Agradecemos a Matt Raymond pela assistência editorial. Este trabalho foi apoiado por fundos do Instituto Nacional de Saúde (U01HL099773, R01HL116221 e P51 RR000167) e da Fundação Charlotte Geyer.

1. Preparações de vírus e fator de transcrição Combinações <ol><li> Prepare soluções com pSIN-EF1α lentiviral plasmídeo de expressão contendo ADN que codifica a proteína para ETV2, GATA1, GATA2, e TAL1 LMO2 (Tabela 1). </li><li> Medir a concentração e a pureza das preparações de plasmídeos usados ​​para a produção de lentivírus gravação por absorção de UV com um espectrofotómetro a 230 nm, 260 nm e 280 nm. Nota: preparações de DNA demonstrando A260 / 280 e A260 / 230 valores superiores a 1,8 são geralmente considerados de boa qualidade. Baixa A260 / 280 valores podem indicar contaminação de proteína, enquanto os menores valores A260 / 230 indicam impurezas com sais ou algum solvente tal como fenol. Plasmídeo concentração recomendada é 1-3 mg / mL. </li><li> Produção de lentivírus para transduções como descrito em protocolos previamente publicados 11. Indução de HE com potencial pan-mielóide requer co-expressão de ETV2 e GATA1, ou ETV2 e GATA2.Indução de HE com potencial eri e megakaryocytic requer GATA2 e TAL1. A adição de LMO2 melhora significativamente o rendimento de células a partir de eritro-megacariocítica hPSCs na presença de GATA2 e TAL1 10. </li></ol> 2. hPSCs Cultura Protocol <ol><li> Cultivar células-tronco pluripotentes em colônias apertados com bordas afiadas para 70-80% de confluência antes de subcultura. Mark e remover diferenciado espontaneamente colônias antes passaging células. </li><li> Dilui-se em gel de matriz extracelular comercial (ver Tabela 2) de acordo com as instruções do fabricante e as placas de revestimento de 6 poços durante a noite a 4 ° C, ou durante pelo menos uma hora a 37 ° C antes de usar. Antes passaging células, aspirar a matriz, adicionar 2 ml de culturemedium completa comercial fresco (ver Tabela 2) e manter a 37 placas ° C, 5% de CO2 até as células estão prontas para semeadura. </li><li> HPSCs Passage <ol><li> Aspirate meio de um poço de uma placa confluente de 6 poços com hPSCs e adicionar 1,5 ml de uma solução pré-aquecida Dispase II (2 mg / ml em DMEM / F12, esterilizado por filtração através de filtros de 0,22 um). Incubar durante 5-7 min a 37 ° C, 5% de CO2 até as bordas das colónias começam a levantar a partir da superfície. </li><li> Aspirar solução Dispase II e lava-se cuidadosamente as colónias duas vezes e, em seguida pela adição de aspiração 2 ml de meio DMEM / F12 fresco. Em seguida, usando uma pipeta de vidro de 5 ml serológico, dissociar hPSCs com 3 ml de meio de cultura completo comercial fresco (ver Tabela 2) suspensão de células por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Adicionar 0,5 ml de suspensão de células a cada poço de uma placa de 6 poços contendo 1,5 ml de meio de cultura completo comercial (ver Tabela 2). Agitar placa frente e para trás e para a direita para a esquerda várias vezes para assegurar uma distribuição uniforme de células quando situar a placa na incubadora. Manter as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 18-24 horas. </li><li> A próxima mudança de meio dia ao meio de cultura completo comercial fresco (ver Tabela 2) e examinar hPSCs morfologia. Passaging resultados bem sucedidos em pequenas colônias, bem-inscritos retenção HPSC morfologia. hPSCs deve ser alimentado com 2,5-3 ml freshmedium por poço, numa base diária e passadas a cada 4-5 dias a não mais do que 70-80% de confluência. NOTA: Se hiPSCs foram mantidas em fibroblastos embrionários de ratinho (MEFs), que necessitam de ser transferidos para condições isentas de alimentação e passadas 2-3 vezes antes de transdução para assegurar a diferenciação eficiente. </li></ol></li></ol> 3. Indução da Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (dia 0, transdução de hPSCs) <ol><li> Para preparar o meio de reacção combinar 1,3 ml de meio isento de soro comercial completa (ver Tabela 2), vírus, polibreno, e Y27632 inibidor ROCHA (Tabela 1): adicionar 1,3 mL de 10 mM de inibidor de rocha para 1,3 ml de meio a um Concentra definitivação de 10 uM, e polibreno a uma concentração final de 6 ug / ml. <ol><li> Adicionar uma quantidade apropriada de concentrado virai (s) a uma concentração final de 0,5-1,0 MOI (multiplicidade de infecção) de cada vírus por célula. Manter meio reaccional em gelo ou a 4 ° C até que a suspensão de célula única é pronto. NOTA: A mesma quantidade de MOI para cada vírus no GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, e misturas GATA2 / TAL1 / LMO2 reacção é óptima para a indução de diferenciação. Culturas No entanto, em ETV2 / GATA2 transduzidas dobrando para GATA2 MOI, em relação ao ETV2, aumenta a diferenciação. Por isso, para estas culturas, proporção de 1: 2 para MOI de ETV2 e uma MOI de GATA2 é recomendada (por exemplo, se concentrado virai é estimado de aproximadamente 6.8 x 10 7 partículas / ml, adicionar 10 ul de ETV2 e 20 ul de GATA2 concentrados virais para 0,68 x 10 6 culas por uma reacção ETV2 / GATA2 em um poço de 35 mm de uma placa de 6 poços). </li></ol></li><li> Prepare hPSCs em uma única célula suspension. <ol><li> HPSCs crescer em condições de livre-de alimentação, conforme descrito na seção 2. No dia 4 após a última passagem, observe densidade celular e morfologia sob um microscópio invertido. hPSCs deve crescer em colónias apertadas com arestas afiadas sem diferenciação espontânea e atingir ~ 60-70% de confluência no dia da transdução. </li><li> Aspirar o meio, adicionar 1,5-2 ml de reagente de dissociação de células comercial (Tabela 1) por poço e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 5-7 min. </li><li> Recolher as células em volumes iguais de meio completo comercial (ver Tabela 2) com 10 uM de inibidor de ROCK, contar as células e determinar a viabilidade. As células por centrifugação a 200 xg durante 5 min e em seguida ressuspender as células em meio completo comercial com 10 uM de inibidor de rocha para uma concentração de 3.4-5 x 10 6 culas por ml. NOTA: A viabilidade das células é crítico para a transdução viral bem sucedida e subsequente diferenciação.Tipicamente, a viabilidade das células antes de transdução deve ser superior a 90%. </li></ol></li><li> Adicionar 200 ul da suspensão de células, contendo 0.68-1 x10 6 células, em 1,3 ml do meio de reacção preparado em 3.1. </li><li> Aspirar a solução de matriz revestido do placa de 6 poços durante a noite preparado em 2.2., Transferir a mistura de reacção para um poço de uma placa de 6 poços e distribuir as células uniformemente. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas. Após 24 h, pelo menos, 80% das células devem ser ligados à matriz. </li></ol> 4. Indução de Hematoendothelial Precursores de hPSCs (dia 1-7) <ol><li> 24 horas após a transdução, remover o meio contendo vírus e lavar as células anexadas com meio de cultura celular incompleta comercial (ver Tabela 1) e, em seguida, adicionar 3 ml por poço de meio de cultura celular incompleta comercial contendo citocinas hematopoiéticas: SCF 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml, bFGF 20 ng / ml (doravante referidas como 3F-médio). </li><li> Substitua médio total, com frescos 3F-médio nos dias 2, 3 e 4 dias para remover as células mortas e detritos. Após o dia 4, quando as células hematopoiéticas flutuantes estão surgindo, substitua metade do 3F de médio a cada dois dias, mantendo o volume total em 4 ml. NOTA: pSIN-EF1α expressão lentiviral plasmídeos incorporar gene de resistência à puromicina permitindo assim a selecção positiva de células transduzidas. A 1 ug / ml de puromicina pode ser adicionado ao meio durante os primeiros 1-2 dias de diferenciação para eliminar os eventuais hPSCs indiferenciadas residuais. </li><li> Observar a morfologia das células no dia 4 sob um microscópio invertido: aglomerados apertados de células com morfologia típica endoteliais começam a aparecer (Figuras 2A, 3A). Glóbulos redondo é exibido a partir do dia 5 ao dia 7 de diferenciação, enquanto algumas áreas podem reter hPSCs morfologia. Analise HE e diferenciação hematopoiética, tal como descrito abaixo. NOTA: diferente hematoendothelial bem sucedidaiation resulta na produção de células sanguíneas que aparecem como células refrácteis redondos frouxamente ligado às células endoteliais planas subjacentes. Estas células proliferam activamente formar pequenos agregados, e, eventualmente, destacar e flutuador (Figuras 2A e 3A). Células do sangue ao vivo pode ser visualmente distinguida das células mortos e moribundos com base na sua capacidade para reflectir a luz e a expandir-se em condições de cultura. </li></ol> 5. Análise da hegemônicos endotélio (HE) estágio de diferenciação. <ol><li> Detectar a formação de HE entre os dias 3 e 4 de diferenciação por observação microscópica de células com morfologia endotelial. Não há glóbulos flutuantes em cultura nesta fase da diferenciação. A presença de HE pode ser confirmado pela coloração de imunofluorescência e citometria de fluxo análise utilizando anticorpos VE-caderina, CD73, CD226 e CD43. <ol><li> Avaliar a formação de células HE por usar a análise de citometria de fluxo no dia 3e dia 4 a partir de uma experiência. Recolher as células por incubação das culturas com reagente de dissociação de células comercial (ver Tabela 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO 2 e, em seguida, utilizar-se para 1 x 10 5 células por reacção de coloração (citometria de fluxo descrito no procedimento de coloração 12). NOTA: VE-caderina + HE células adquirem expressão de início hematopoiéticas marcador CD226, mas falta a expressão de CD73 e CD43 6. Em contraste, células não-HE expressam CD73 (Figuras 2B, 3B). </li></ol></li><li> Imunofluorescência para HPSC derivado HE. <ol><li> Lavar a monocamada de células de ligado de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e em seguida fixar as células em 4% de paraformaldeído de 30 a 60 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células novamente com PBS e depois permeabilizam utilizando 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as células com PBS, duas a três vezes e, em seguida, incuba-setampão consistindo em PBS com 10% de soro fetal de bovino (FBS) de bloqueio, durante 30 a 120 min. </li><li> Preparar a solução de coloração, contendo ambos os anticorpos primários (1: 1000 de diluição) rato CD43 anti-humano de coelho e anti-humanos VE-caderina em PBS com 5% de FBS, (Tabela 1). </li><li> Aspirar o tampão de bloqueio a partir das células e adicionar 1 ml por poço de tampão de coloração com os anticorpos primários adicionados; incubar 3 horas à temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as células três vezes por adição de 2 ml de PBS com 5% de FBS. </li><li> Preparar um segundo tampão de coloração, contendo anticorpos secundários na diluição 1: 500 em PBS com FBS a 5%: burro anti-coelho conjugado com corante fluorescente verde, e anti-ratinho conjugado com corante fluorescente vermelho (Tabela 1). Adicionar 1 ml por poço de tampão de coloração secundário e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Lavar três vezes com PBS sem soro. Células mancha com 300 nM DAPI solução de trabalho em dH2 O por 10-15 min. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS e adicionar 2-3 mL de PBS na cavidade com células coradas. Observe fluorescência com filtros microscópio verdes, vermelhas e azuis. </li></ol></li></ol> 6. Análise de Induzidos hematopoéticas Precursores <ol><li> Manter culturas de diferenciação até células flutuantes expanda significativamente, até 10-14 dias, mudando metade do 3F-forma, tal como descrito em 3.1, a cada dois dias. </li><li> Dissociar e recolher diferenciação monocamadas de células por tratamento das células com um reagente de dissociação de células comercial (ver Tabela 1) durante 5-10 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Realizar citometria de fluxo utilizando anti-VE-caderina, anticorpos CD43 e CD45 para avaliar a hematopoiese nas culturas 12. Note-se que uma grande fracção de células, até 40% das células transduzidas ETV2 e GATA2, co-expressa VE-CAD e CD43. Os seguintes anticorpos podem ser utilizados para detectar a linhagens celulares específicas e seguintesXpansion ou diferenciação de células progenitoras de sangue induzidos: CD235a (células eritróides), CD41a (megacariocítica), CD32 (todos os tipos de células mielóides), CD66b (neutrófilos) e CD163 (macrófagos). </li><li> Realizar CFC-ensaio utilizando um meio comercial clonogénicas (Tabela 1) de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Transferir 1-2 x 10 4 células em 3 ml de meio clonogénico comercial (ver Tabela 3) para avaliar o número de células formadoras de colónias e tipos de colónias hematopoiéticas. Densidade de sementeira óptima permite a identificação e isolamento de colónias únicas que crescem separadamente uns dos outros e não se sobrepõem. Densidade de sementeira podem variar entre experiências, dependendo da eficiência de diferenciação, mas não deve ser superior a 1 x 10 4 culas por 1 ml de meio clonogénico comercial. </li><li> Misture as células em meio clonogénico comercial em vórtice suave e transferir 3 ml de suspensão de dois pratos de 35 mm ultra-baixas de fixaçãoCFC para o ensaio, 1,5 ml de suspensão em cada prato. Distribuir uniformemente meio e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 14 dias. Evite perturbar os pratos; observar a formação de colónias no dia 7 e dia 10 de ensaio. </li><li> Identificar e contar colônias hematopoiéticas de acordo com suas morfologias no dia 14. </li></ol></li></ol>

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</ol>

IS é acionista fundador e consultor de Cynata.

O método acima descrito para a diferenciação hematopoiética da hPSCs por sobre-expressão de TF, representa uma abordagem rápida e eficiente para a geração de HE e mielóides e erytho-magakaryocytic progenitores de hESCs e iPSCs, permitindo assim a produção de até 30 milhões de células de sangue de um milhão de células-tronco pluripotentes 10. Este método exibiu diferenciação consistente em várias linhas de células estaminais embrionárias humanas e IPSCs 10. Durante a diferenciação por ETV2 e GATA2, ...

A capacidade única de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para auto-renovar e diferenciar em células das três camadas germinativas, incluindo sangue, torná-los uma ferramenta valiosa para os estudos sobre os mecanismos de desenvolvimento hematopoiético, modelagem de doenças do sangue, despistagem de drogas, Os estudos de toxicidade, e ao desenvolvimento de terapias celulares. Porque a formação do sangue no embrião receitas provenientes endotélio hegemônicos (HE) por meio de uma transição endotelial hematopoiéticas 1,2, a geração de HE em culturas seria essencial para estudar os mecanismos moleculares que regulam a endotelial a transição hematopoiético e especificação hematopoiético. Os métodos actuais para estudos de HE baseiam-se na indução de diferenciação hematoendothelial em agregados (EBS) com a adição de citocinas hematopoiéticas 3-5, e de co-cultura com células estromais hPSCs hematopoiese 6,7-suporte ou em culturas bidimensionais com extracelular matrizes e cytokines 8,9. Estes métodos clássicos de diferenciação são baseadas na introdução de sinais externos que actuam na superfície da célula e iniciar a cascata de vias moleculares que conduzem eventualmente à activação transcricional de programa que controla o desenvolvimento hematoendothelial. Assim, a eficiência do hPSCs diferenciações nestes sistemas depende de uma indução eficaz desses sinais, a transdução de sinal para o núcleo, e a resultante activação da transcrição específicas de reguladores. Além disso, o estudo de HE em culturas de diferenciação convencionais requer o passo adicional de isolar as células HE utilizando separação de células. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a indução direta de HE e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição hematopoiéticas. Este método permite a indução eficiente de HE em um prato e a observação directa da endotelial de transição hematopoiética sem a necessidade de isolamento de HE utilizando um procedimento de separação de células pesado. Formação de HE e sangue a partir de células-tronco pluripotentes humanas podem ser eficientemente induzida pela superexpressão apenas alguns fatores de transcrição (TFS). A combinação ideal de TFs capazes de induzir robusto hematopoiese pan-mielóide de hPSCs inclui ETV2 e GATA1 ou GATA2. Em contraste, a combinação de GATA2 e TAL1 induz erythromegakaryocytopoiesis 10. Programação hPSCs através da superexpressão desses fatores diferencia hPSCs diretamente para o VE-cad + CD43 - CD73 - HE células que gradualmente adquirir o fenótipo hematopoiéticas definido pela expressão do marcador CD43 cedo hematopoiéticas 7. Este método baseia-lentiviral para a programação directa das células estaminais pluripotentes humanas método é aplicável para a geração de HE e células do sangue para os estudos mecanicistas, estudos de transição para endotelial e hematopoiética, a regulação da transcrição de desenvolvimento hematopoiético e especificação. Embora o Current protocolo descreve a produção de sangue usando a expressão constitutiva dos transgenes, resultados semelhantes podem ser obtidos utilizando modificado mRNA 10.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabela 1. Indução de diferenciação de hPSCs com fatores de transcrição e análise de endotélio hemogênico e células sanguíneas.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61061</td><td>Vetor Lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>Vetor Lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Vetor Lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>Vetor Lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>Vetor Lentiviral</td></tr><tr><td>Brometo de hexadimetrina (Polybrene)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Polímero catiônico usado para aumentar a eficiência da infecção</td></tr><tr><td>Y-27632 (Dicloridrato) Inibidor de ROCK</td><td>Tecnologias STEMCELL</td><td>72302</td><td>Inibidor da via RHO/ROCK Inibe o</td></tr><tr><td>Reagente de Dissociação de Células ACCUTASE ROCK StemPro</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>Reagente</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de Dissociação Celular <tr><td>Incompleto (livre de fator de crescimento) meio de cultura&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 Formulação personalizada&nbsp;</td><td>Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td><a name="RANGE! D12">Meio mTeSR1 sem soro sem bFGF e TGFb&nbsp; </a></td></tr><tr><td>humano SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO humano</td> de grau premium <td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>Grau de pesquisa</td></tr><tr><td>humano FGF-básico</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Grau premium</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Marcador endotelial (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoiético ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Hematopoiética (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Marcador Endotelial (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoiética (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Ensaio Vivo/Morto (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldeído&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Fixação de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>Permeabilização&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Soro fetal bovino</td></tr><tr><td>Camundongo anti-humano CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Anticorpo primário puro para coloração de imunofluorescência (IF)</td></tr><tr><td>Coelho anti-humano VE-caderina</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primário (IF)</td></tr><tr><td>Anti-coelho Alexa Fluor 488-conjugado</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secundário (IF)</td></tr><tr><td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugado</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>Secundário (IF)</td></tr><tr><td>Coloração de ácido nucleico DAPI</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>Ensaio vivo/morto (IF)</td></tr><tr><td>Meio clonogênico MethoCult H4435 Enriquecido</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>Ensaio CFC</td></tr><tr><td>Wright Solução de coloração</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Coloração cytospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs)&nbsp;</td><td>Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI)</td> <td>hESCs (WA01, WA09) células-tronco embrionárias humanas; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) células-tronco pluripotentes induzidas por transgenes</td><td>As hPSCs são capazes de se auto-renovar e se diferenciar em células de três camadas germinativas</td></tr><tr><td>Meio completo sem soro para cultura de hPSCs&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Mídia mTeSR1 &nbsp;</td><td>Instituto de Pesquisa WiCell (Madison, WI)</td><td>M500&nbsp;</td><td>Meio sem soro com fatores de crescimento para cultura livre de alimentadores de ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences/ Corning&nbsp;</td><td>356234</td><td>Matriz para manutenção de ESC/iPSCs humanos</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, pó&nbsp;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>Basal Medium&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's PBS powder</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, powder</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>Protease neutra, Dissociação celular</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 3. Primers para detecção de integração genômica do vírus.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome do Primer</td><td><forte>Avançado (Fwd)&nbsp; 5' -->3' < / forte ></td> <td>< forte > reverso (Rev) 5 '--> 3 ' </td><td>Descrição&nbsp; </td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA-</td><td>-</td><td>EF1a sequência promotora</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td><td>&nbsp; Região de codificação&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&nbsp; Região de codificação&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp; Região de codificação&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGT AGA GGC</td><td>&nbsp; Região de codificação&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&nbsp;</td><td>&nbsp; Região de codificação&nbsp;</td></tr></tbody></table>

a indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas células-tronco

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Durante o desenvolvimento, as células hematopoiéticas surgem a partir de um subconjunto especializado de células endoteliais, endotélio hegemônicos (HE). Desenvolvimento de modelagem HE in vitro é essencial para estudos sobre os mecanismos da transição endotelial-hematopoiético e especificação hematopoiético. Aqui, nós descrevemos um método eficiente para a indução de HE partir de células humanas estaminais pluripotentes (hPSCs) por meio de sobre-expressão de diferentes conjuntos de factores de transcrição. A combinação de ETV2 e GATA1 ou GATA2 TF é utilizado para induzir HE com potencial pan-mielóide, enquanto uma combinação de factores de transcrição e GATA2 TAL1 permite a produção de HE com eritróide e potencial megacariocítica. A adição de LMO2 para GATA2 combinação e TAL1 acelera e aumenta substancialmente a diferenciação eritróide e células megacariocíticas produção. Este método proporciona um meio eficiente e rápida de indução HE de hPSCs e permite a observação do endotélio-hematopoietitransição C numa placa de cultura. O protocolo inclui procedimentos de transdução hPSCs e análise pós-transdução de HE e progenitores do sangue.

O diagrama esquemático de HE e indução de sangue hPSCs por sobre-expressão de factores de transcrição é apresentada na Figura 1. ETV2 combinação com GATA1 ou GATA2 induz a hematopoiese pan-mielóide, enquanto um GATA2, TAL1 +/- combinação LMO2 induz a hematopoiese predominantemente eritro-megacariocítica. Ambas as combinações TF diretamente induzida células o que, posteriormente, transformadas em células progenitoras de sangue com um espectro distinto de diferenciação hematopoiética. Dif...

Este protocolo descreve a indução eficiente de endotélio hemogênico e progenitores hematopoiéticos multipotenciais a partir de células-tronco pluripotentes humanas por meio da expressão forçada de fatores de transcrição.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar células sanguíneas eritroides e mieloides a partir de células-tronco pluripotentes humanas mediante a expressão forçada de fatores de transcrição. Este método é aplicável para a geração de endotélio homogênico em células sanguíneas para estudos da transição endotelial para hepo e da regulação transcricional do desenvolvimento e especificação de hepo. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece um meio ineficiente e rápido de indução de endotélio homogênico a partir de células-tronco humanas, permitindo a observação da transição hemática endotelial em uma placa de cultura celular.A Dra. Bruske, assistente de pesquisa no laboratório da Dra. Lin, demonstrará o procedimento. Antes de começar, revestir previamente placas de seis poços com uma matriz extracelular, como o Matrigel, diluindo-o de acordo com as instruções do fabricante e vertendo-o nos poços. Incubar as placas por 30 a 60 minutos a 37 graus Celsius para o meio de transdução. Primeiro, preparar alíquotas de lentivírus para cada conjunto de transdução, de modo que a multiplicidade de infecção estimada, ou MOI, de vírus para células, seja de um vírus por célula, e mantê-las a quatro graus Celsius.Em seguida, combine meio completo sem soro para vírus hbsc poly brain até uma concentração final de seis microgramas por mililitro e inibidor ROCK Y 2 7 6 3 2 até uma concentração final de 10 micromolares em um volume total de 1,3 mililitros para cada conjunto de transdução e coloque as misturas no gelo para preparar as células. Inicie com um lote saudável de células-tronco pluripotentes com cerca de 70% de confluência, aproximadamente quatro dias após a última passagem. Se as células-tronco pluripotentes humanas foram mantidas em MAPS, devem ser transferidas para condições livres de fibroblastos de alimentação, duas a três passagens antes dos experimentos de transdução, e devem representar culturas saudáveis de células-tronco pluripotentes.Isentas de diferenciação espontânea. Aspire o meio de CEPH e adicione dois mililitros de solução de dissociação enzimática, como Accutase, por poço de uma placa de seis poços, incubando a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante cinco a sete minutos. Em seguida, adicione dois mililitros de meio completo com 10 micromolares de inibidor de ROCK e colete as células destacadas.Após preparar uma suspensão celular homogênea, retire uma pequena alíquota e conte as células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano. Em seguida, centrifugue as células a 200 vezes G durante cinco minutos e re-suspenda o pellet em meio completo com inibidor de ROCK a 10 micromolar, na concentração final de 3,4 vezes 10 à sexta células vivas por mililitro. Então, adicione 200 microlitros da suspensão celular contendo 0,68 vezes 10 à sexta células a cada um dos 1,3 mililitros de meio de transdução preparado anteriormente.Remova a placa de seis poços revestida com matriz de 37 a graus Celsius. Em seguida, aspire a solução de matriz e transfira cada uma das misturas de transdução para um poço e gire a placa para distribuir as células uniformemente no poço. 24 horas.Após a transdução, visualize os poços ao microscópio para garantir que pelo menos 80% das células estejam aderidas. Descarte a solução viral e lave as células aderidas com meio incompleto sem quaisquer fatores de crescimento. Em seguida, adicione três mililitros do meio suplementado com citocinas, denominado meio três F, às células.Incube as células durante a noite no dia seguinte. Troque o meio por meio três F fresco contendo um micrograma por mililitro de puromicina. Para eliminar as células residuais não transduzidas.Substitua este meio a cada 24 horas para remover as células mortas. Após 48 horas do tratamento, descontinue a puromicina e utilize apenas meio três F fresco no quarto dia. Após a transdução, observe as células ao microscópio quanto ao aparecimento de células agrupadas com morfologia endotelial para determinar a formação de células hematoendoteliais.Primeiro, associe as células entre os dias três ou quatro da placa de cultura com a solução de desprendimento celular. Colete as células destacadas no meio completo e centrifugue-as, ressuspenda as células no tampão máximo à temperatura ambiente e conte as células em um hemocitômetro, em seguida, incube um vezes 10 à quinta potência de células por reação de marcação com anticorpos adequados para a detecção de v-catrína, CD226, CD73 e CD43. Marcadores de superfície celular.Realize a citometria de fluxo conforme descrito no protocolo textual a partir do quarto dia. Após a transdução, continue a diferenciação das células substituindo metade do meio de cada poço a cada 48 horas; entre cinco e sete dias, células sanguíneas redondas aparecerão levemente agregadas e flutuando acima da camada de células endoteliais. Mantenha as culturas por até 14 dias, período durante o qual as células em suspensão devem expandir significativamente.Análise por citometria de fluxo de ETV dois, gata um e ETV dois. Células transduzidas com Gata dois mostram a formação de hemofagocitos positivos para terin, que podem ser identificados pela expressão de CD 2 26 e ausência de expressão de CD 73 no terceiro ao quarto dia de diferenciação. Análise por citometria de fluxo de ETV dois, gata um e ETV dois. Células transduzidas com Gata dois mostram indução de células sanguíneas expressando CD 43 no sétimo dia.Após a transdução, a análise citométrica de fluxo de células induzidas por gata two TAL one LMO two no dia 14 após a transdução mostra a formação de células sanguíneas que expressam CD 2 35 A e CD 41 A. Preparações coradas com ácido periódico de células hematopoéticas induzidas por gata two TAL one lmo two revelaram morfologias de eritróides, macrófagos e células megacariocíticas. A transdução de células-tronco pluripotentes humanas pode ser realizada em menos de uma hora durante a execução do procedimento de transdução. É importante considerar sempre a viabilidade das células-tronco, incluir o inibidor de ROCK na mistura reacional e utilizar uma quantidade ótima de vírus por célula após os primeiros três dias.Após a transdução, métodos como imunomarcação, ensaio de formação de colônias e citometria de fluxo podem ser realizados para responder perguntas sobre a eficiência da diferenciação e o tipo de doença hematológica induzida. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manter e infectar células-tronco pluripotentes humanas e o que esperar em culturas em diferenciação nos primeiros sete a dez dias. Após os fatores de transcrição terem sido entregues com sucesso nas células-tronco humanas, as células perdem sua pluripotência e gradualmente se comprometem com um destino hematopoético.Assim, os pesquisadores terão um modelo in vitro conveniente para estudar os mecanismos moleculares da transição de endotelial para hematopoiética. Não se esqueça de que o trabalho com regiões contendo lentivírus pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual e a correta eliminação de vírus contendo regiões, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Foi desenvolvido um método para derivar directamente células estaminais neurais humanos a partir de células progenitoras hematopoiéticas enriquecidas de células do sangue periférico.

Indução direta de Neurais Human células-tronco de sangue periférico células progenitoras hematopoéticas

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Propomos um protocolo para reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Ao plaquear as células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz com centrifugação, as iPSCs são induzidas com sucesso a partir de células flutuantes. Esta técnica sugere um protocolo de reprogramação simples e eficaz para células como PBMCs e CBMCs.

Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

Apresenta-se aqui um protocolo simples para a diferenciação direcionada de células endoteliais hemogênicas de células-tronco pluripotentes humanas em aproximadamente 1 semana.

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Este protocolo descreve a geração de vasos sanguíneos auto-organizadores a partir de células-tronco pluripotentes e pluripotentes induzidas humanas. Essas redes vasculares exibem uma extensa e conectada rede endotelial circundada por pericitos, actina de músculo liso e membrana basal contínua.

Geração de Organoides de Vasos Sanguíneos Humanos a partir de Células-Tronco Pluripotentes

Descreve-se aqui um fluxo de trabalho simples para diferenciar células endoteliais de células-tronco pluripotentes humanas, seguido de um protocolo detalhado para sua estimulação mecânica. Isso permite o estudo da mecanobiologia do desenvolvimento das células endoteliais. Esta abordagem é compatível com ensaios a jusante de células vivas coletadas do chip de cultura após estimulação mecânica.

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

Aprenda a induzir endotélio hemogênico e células sanguíneas a partir de células-tronco pluripotentes humanas por sobre-expressão de fatores de transcrição. Este método permite estudar a transição endotelial-hematopoética in vitro.

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco (Vídeo) | JoVE Journal

A indução direta de hegemônicos endotélio e sangue por sobre-expressão de fatores de transcrição na pluripotentes humanas Células-Tronco

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