A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

O objetivo geral deste procedimento é produzir altos rendimentos de granzimas glicosiladas fólicos e enzimaticamente ativas em células T 2 93 do rim embrionário humano. Isso é feito expandindo primeiro as células T HEC 2 93 em placas de cultura de tecidos apropriadas. O tamanho normal da preparação após a expansão consiste em 20 a 25 placas de cultura.

O segundo passo é transfectar transitoriamente as células expandidas com um plasmídeo de expressão de granzima usando o método eficiente de fosfato de cálcio. Em seguida, o supernat celular é colhido e as grandes enzimas secretadas são purificadas por cromatografia de afinidade de metal imobilizado. As etapas finais são ativar as grandes enzimas por meio do tratamento com quinase e purificar ainda mais as proteases por cromatografia de troca catiônica.

Em última análise, a atividade enzimática é testada usando um ensaio métrico chole rápido e confiável, pois a disponibilidade de protease ativa em quantidades suficientes é um fator limitante na pesquisa de granzima. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo, como a caracterização de novas vias de morte celular em diferentes organismos ou a identificação de novos substratos de protease em abordagens de proteoma completo para expressar grandes enzimas. Primeiro cultive células HEC 2 93 T em 20 mililitros de meio de cultura, usando placas de cultura de tecidos de 150 por 25 milímetros, divida as células a 80% de células de fluência de Co frouxamente ligadas, mas pode ser separada mecanicamente sem tripsina, pipetando rigorosamente para cima e para baixo a placa.

As células na noite anterior à transfecção para dar 60 a 70% de fluência no dia da transfecção. Um tamanho de preparação usual consiste em 20 a 25 pratos de cultura. Uma hora antes da transfecção mudou o meio de cultura padrão para 20 mililitros de meio de transfecção perto do final da etapa de incubação de uma hora, misturou 400 microgramas de DNA plasmático com 10,95 mililitros de água bidestilada e 1,55 mililitros de cloreto de cálcio dois molares em tubos de 50 mililitros um a dois minutos antes da transfecção.

A 12,5 mililitros de dois x heaps tamponados com solução salina a 12,5 mililitros da solução de DNA cálcio misturada por inversão dos tubos antes de incubar por 30 segundos. À temperatura ambiente, adicione esta mistura, gota a gota diretamente nas células a cinco mililitros por prato, polvilhe uniformemente sobre toda a área, transformando o meio em uma cor levemente alaranjada. Incube as placas de cultura por sete a 11 horas em uma incubadora de cultura de tecidos.

Após a incubação, um precipitado fino é visível. Remova o meio de transfecção. Enxágüe cuidadosamente com PBS pré-aquecido e adicione 20 mililitros de meio de cultura livre de soro antes de incubar por 72 horas em uma incubadora de cultura de tecidos, analise a transfecção e a eficiência de expressão executando uma amostra do sobrenadante celular na página SDS e corando com kumasi.

Azul brilhante. Para visualizar uma banda granzyme. Após a incubação, decantar os sobrenadantes da cultura de células para tubos de 250 mililitros e limpar por centrifugação.

Faça uma primeira rotação que limpará o meio das células separadas. Transfira o sobrenadante para tubos novos de 250 mililitros e gire a 4.000 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover quaisquer detritos celulares restantes. Em seguida, adicione cinco mililitros de cloreto de sódio, 6,25 mililitros de tris base e um mililitro de sulfato de níquel mais 250 mililitros de sobrenadante limpo.

Filtrar o sobrenadante com um filtro de vácuo de 500 ml. Equilibre uma coluna de cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados com níquel com seu tampão de ligação. A usando um sistema FPLC adequado.

Em seguida, aplique o sobrenadante limpo na coluna equilibrada a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto a quatro graus Celsius. Após a aplicação do sobrenadante, lavar a coluna com o tampão de ligação até atingir a linha de base absorvente de ultravioleta ou UV. Eluir as granzimas com um gradiente linear de 20 mililitros ILE a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto enquanto coleta frações de dois mililitros.

Analise as frações elucianas por SDS page e coloração de kumasi. Puxe o grande zimo contendo frações em um tubo de atordoamento. Armazene uma pequena amostra a menos 20 graus Celsius como controle pré-entero quinase.

Adicione entero quinase a 0,02 unidades por 50 mililitros de sobrenadante inicial diretamente à fração acumulada no tubo de diálise e dialise durante a noite à temperatura ambiente em tampão entero quinase. No dia seguinte, analise a quinase tratada em comparação com o controle da quinase pré-entrada por página SDS e coloração com azul de kumasi. Quando o processamento do terminal final estiver concluído.

Troque o tampão de diálise para o tampão S A e dialise por mais quatro horas em temperatura ambiente antes de filtrar o DIALATE oito. Em seguida, equilibre uma coluna S com o buffer S. A. Carregue a amostra na coluna a uma taxa de fluxo de 0,5 mililitros por minuto a quatro graus Celsius após o carregamento da amostra.

Lave a coluna com tampão S A até atingir a linha de base absorvente de UV. Eluir as granzimas com um gradiente linear de cloreto de sódio de 30 mililitros, a granzima A elui a aproximadamente 650 milimolares de cloreto de sódio, a granzima B a aproximadamente 700 milimolares de cloreto de sódio e a granzima M a aproximadamente 750 milimolares de cloreto de sódio. Agrupar as fracções que contêm granzimas e concentrar a cerca de 100 micromolares em filtros de centrifugação, alíquota das preparações concentradas de granzima e conservar a 80 graus Celsius negativos.

Em seguida, analise as frações elucianas por SDS page e ensaios métricos de chole para realizar os ensaios de métrica de chole distribua pequenas amostras de granzima de frações ellucianas ou estoques concentrados em 96. As placas de fundo plano incluem um controle positivo e um controle negativo. Adicione 100 microlitros de tampão de ensaio a cada um.

Bem, incube a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius. Finalmente, meça a densidade óptica em 405 nanômetros em um leitor de microplacas. Este protocolo produzirá altos rendimentos de granzimas puras, conforme demonstrado neste gel de página SDS corado com kumasi representativo mostrando granzima BE da coluna S.

As granzimas recombinantes exibem atividade semelhante às preparações de protease nativa, conforme mostrado neste ensaio métrico de cores comparando a atividade da granzima B recombinante e nativa. É importante ressaltar que o tratamento com endo H indica que as granzimas produzidas nas células T HEC 2 93 são totalmente glicosiladas. As grandes enzimas recombinantes são capazes de clivar substratos de proteínas macromoleculares, conforme demonstrado neste ensaio de clivagem de granzima representativa usando o substrato de proteína bacteriana e UOCD.

Aqui, a faixa que representa o N-O-U-C-D clivado desaparece lentamente com o aumento da concentração de granzima. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir grandes enzimas totalmente glicosiladas e pró-ativas com altos rendimentos em células T HK 2 93.