Name: A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a expressão de granzimas em células HEK293T com alta produção e baixo custo. Este método utiliza transfecção com fosfato de cálcio e cromatografia de afinidade para obter proteases glicosiladas e enzimaticamente ativas.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Novartis para Pesquisa Médico-Biológica e do Research Pool da Universidade de Friburgo (para MW). Agradecemos a Li Zhao, Zhan Xu e Solange Kharoubi Hess pelo suporte técnico, bem como a Radu Aricescu e Yvonne Jones (Universidade de Oxford, Reino Unido) por fornecerem o plasmídeo pHLsec e a Thomas Schürpf (Harvard Medical School) pelas discussões úteis.

1. Produção do plasmídeo de expressão pHLsec-GZM <ol><li> Preparar ARN total a partir de células NK humanas (células primárias preparadas como no 26 ou a linha celular NK NK-92 expressando os cinco Gzms humanos) utilizando um método de isolamento de ARN adequada e transcrever reversa usando um kit de ADNc de primeira cadeia a sintetizar seguintes manufacturer` s recomendações. GZM amplificar ADNc utilizando PCR e o clone em pHLsec como descrito em 23 (presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, Universidade de Oxford, Reino Unido) utilizando os locais AgeI e KpnI (Figura 1). NOTA: Use os seguintes iniciadores indicados na Tabela 1. </li><li> Confirme inserções corretas por sequenciação. Expandir os plasmídeos de expressão em células DH5a e purifica-se utilizando um kit de isolamento de plasmídeo isento de endotoxinas e seguir as instruções do fabricante. </li><li> Ressuspender os plasmídeos purificados em meio isento de endotoxina, água estéril a uma concentração de 2 mg / ml e armazenar a -20 ° C until uso. </li></ol> 2. Expressão de Gzms em células HEK293T <ol><li> Preparação de reagentes <ol><li> Prepare meio de cultura padrão. Para Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) contendo glucose elevada (25 mM), de GlutaMax (4 mM), piruvato de sódio (1 mM), adicionar 10% de padrão de soro de vitelo fetal (FCS), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina ( 100 ug / mL). </li><li> Prepare meio de transfecção. Para meio de cultura sem penicilina-estreptomicina adicionar 25 ug / ml de cloroquina (adicionar fresco no dia da transfecção de 1000X existências em PBS, armazenado a -20 ° C). </li><li> Prepare meio de cultura isento de soro: para meio isento de soro para células HEK293 adicionar glutamina (4 mM), penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 ug / ml), e 2,5 mg / L de anfotericina B. </li><li> Preparar as soluções descritas na Tabela 2 e filtro com um filtro de 0,45 um antes da utilização: </li></ol></li><li> Expansão de células HEK293T <ol><li> Cultivar células HEK293T em 20 ml de cultoforma ure utilizando 150 x 25 mm pratos de cultura de tecidos. </li><li> Dividir células a 80% de confluência (split-proporção de 1: 4, normalmente todos os dias 3ª). Células vagamente anexar, eles podem ser destacadas mecanicamente, sem tripsinização rigorosamente pipetando para cima e para baixo. </li><li> Células da placa a noite antes da transfecção para dar 60-70% de confluência no dia da transfecção (densidade de sementeira de 2 x 10 ~ 5 células / mL). Um tamanho habitual de preparação consiste em 20 a 25 placas de cultura. </li></ol></li><li> Transfecção com fosfato de cálcio <ol><li> 1 h antes da transfecção, mudar o meio de cultura padrão de 20 ml de meio de transfecção. Perto do final deste passo de incubação 1 h, misturar 400 ug de ADN de plasmídeo com 10,95 ml DDH 2 0 e 1,55 ml de CaCl2 2M em tubos de 50 ml (um tubo / 5 pratos). </li><li> 1-2 minutos antes da transfecção, adicionar 12,5 mL 2x HBS a 12,5 ml da solução de ADN-cálcio, misturar por inversão dos tubos e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente. </li><li> Adicionar the mistura preparada em 2.3.2 directamente para as células (5 ml por placa), gota a gota para o meio. Polvilhe uniformemente sobre toda a área, transformando a forma de uma cor ligeiramente laranja. </li><li> Incubar as placas de cultura de 7 a 11 horas numa incubadora de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO 2 em ar humidificado). Após a incubação, um precipitado fino é visível. Remover o meio de transfecção, lavar cuidadosamente com PBS pré-aquecido e adicionar 20 ml de meio de cultura isento de soro preparado em 2.1.3. Incubar durante 72 h numa incubadora de cultura de tecidos. </li><li> Analisar a eficiência de transfecção e expressão executando uma amostra (~ 20 ul) do sobrenadante das células em SDS-PAGE e coloração com Azul Brilhante de Coomassie para visualizar uma banda granzima. </li></ol></li><li> A purificação do Gzms do sobrenadante de cultura por níquel-IMAC <ol><li> Após a incubação, decanta-se os sobrenadantes de cultura de células em tubos de 250 ml por centrifugação e clara. Realizar uma primeira rotação (400 xg, 10 min, 4 °C) que irá limpar o meio de células isoladas. Transferir o sobrenadante em tubos frescos e 250 ml de centrifugação a 4000 xg, 30 min a 4 ° C para remover todos os restos de células remanescente. </li><li> Adicionar 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 mL de 2 M de Tris-Base (pH 8) e 1 ml de 0,25 M de NiSO4 por 250 ml de sobrenadante clarificado. Filtra-se o sobrenadante utilizando uma unidade de filtro de vácuo de 500 ml (0,45 mm). </li><li> Equilibrar a coluna de Níquel-His-IMAC, com tampão de ligação A (10 volumes de coluna, CV), utilizando um sistema de FPLC adequado. </li><li> Aplicar o sobrenadante clarificado para a coluna equilibrada a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C. </li><li> Depois o sobrenadante foi aplicado, lavagem da coluna com tampão A de ligação até que a absorvância de UV de linha de base é atingido (geralmente 10 CV). </li><li> Eluir com uma Gzms linear 20 ml de gradiente (0 a 250 mM de imidazole), a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min durante a recolha de 2 ml-frações. Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. </li></ol></li><li> Enteroquinase (EK)tratamento e limpeza final por cromatografia de permuta catiónica <ol><li> Piscina GZM contendo frações em um tubo de diálise com ≤10 MWCO. Armazenar uma pequena amostra a -20 ° C como controlo pré-EK. </li><li> Adicionar EK a 0,02 unidades / 50 ml de sobrenadante inicial directamente para a fracção combinada no tubo de diálise e diálise O / N (pelo menos 16 horas) à temperatura ambiente em tampão de EK-(4 L, tampão de mudança, uma vez). </li><li> No dia seguinte, analisar EK Gzms tratados em comparação com o pré-EK controlo por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. </li><li> Quando o processamento N-terminal está completa, a mudança de tampão de diálise S tampão A (4 L) e dializar durante mais 4 horas à temperatura ambiente. Filtrar dialisado (0,45 um). </li><li> Equilibrar a coluna de S-S com tampão A. Colocar a amostra na coluna com a uma taxa de fluxo de 0,5 mL / min a 4 ° C. </li><li> Após o carregamento da amostra, lava-se a coluna com tampão A até S absorvância de UV de linha de base é atingido (cerca de 10 CV). Eluir os Gzms com um gradiente linear de 30 ml (150 a 1000 mM de NaCl). GzmA ealaúdes em ~ 650 mM de NaCl, GzmB na ~ NaCl e GzmM mM 700 a ~ 750 mM de NaCl. </li><li> Analisar as fracções de eluição por SDS-PAGE e ensaios colorimétricos (ver abaixo). Piscina fracções contendo Gzms e concentrado (cerca de 30 vezes, a uma concentração de cerca de 100 uM) em filtros de spin (15 ml, 10 MWCO). Alíquota os preparativos GZM concentrados e armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Teste de atividade GZM <ol><li> Preparação de reagentes <ol><li> Preparar tampão de ensaio colorimétrico: 50 mM de base Tris, pH 7. <ol><li> Para a medição de GzmA, adicionar Na-CBZ-L-Lisina tiobenzilo éster (S-Bzl) (BLT) para o tampão de ensaio até uma concentração final de 0,2 mM e 5,5&#39;-ditio-bis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) a uma concentração de 0,22 mM. Para GzmB, incluem 0,2 mM de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl mM de DTNB (DAA) e 0,22. Para GzmM, incluem 0,2 mM Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (pNA) (AAPL). Os péptidos sintéticos são adicionados a partir de soluções de reserva apropriadas (em DMSO, storEd a -20 ° C) para a memória intermédia de fresco antes do ensaio. </li></ol></li><li> Preparar tampão de ensaio de clivagem: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Base, pH 7,5 </li></ol></li><li> Ensaios colorimétricos <ol><li> Distribuir pequenas amostras GZM (&lt;5 ul) de fracções de eluição ou de estoque concentradas nos 96 poços de fundo plano de placas. Incluir um controlo positivo (GZM preparações testadas em bruto ou lisados ​​de células NK) e um controlo negativo (tampão apenas). </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de ensaio a cada poço (com uma pipeta multi-canal). Incubar durante 10 min a 37 ° C. Medir OD a 405 nm num leitor de microplacas. </li></ol></li><li> Ensaio de clivagem <ol><li> Para os ensaios de clivagem utilizando substratos purificados, co-incubação de um substrato proteico (nativo ou recombinante, 100-400 nM; alguns exemplos de substratos GZM eficientes são apresentados na secção de resultados e na nota no final desta secção) com diluições em série de um GZM (a partir de 400 nM) em tampão de ensaio para várias vezes.Analisar por SDS-PAGE e coloração com Coomassie ou prata; ou por western blotting utilizando anticorpos específicos. </li><li> Para os ensaios de clivagem usando lisados ​​de células, suspender as células HeLa 10 6 (ou qualquer linha de células de tumor disponível) em 1 ml de tampão de ensaio e lise por congelação em uma / banho de gelo seco e etanol descongelação a 37 ° C três vezes. Remover os detritos celulares por centrifugação (15.000 xg durante 10 min a 4 ° C). </li><li> A co-incubação do ligado clarificado com Gzms a várias concentrações e tempos que anteriormente. A clivagem é detectada por imunotransf erência utilizando anticorpos apropriados. NOTA: Alguns exemplos de substratos de boa fé para a qual anticorpos comerciais estão disponíveis: Licitação (BH3-interagindo agonista morte de domínio) e caspase 3 clivada por GzmB 27,28; vários ribonucleoproteínas nucleares heterogêneos (hnRNPA1, A2 e U) clivada por GzmA 29; citomegalovírus phosphoprotein 71 por GzmM 30. </li></ol></li></ol>

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<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O papel clássico e extensivamente estudada de GzmA e GzmB é a indução de apoptose em células de mamífero após a sua entrega por citosólico da proteína formadora de poros PFN 1. Recentemente, o espectro citotóxica dos Gzms foi alargado significativamente a partir de células de mamíferos para bactérias 9,10, bem como para certos parasitas 11. Além disso, as funções não clássicos, extracelulares de GzmA e GzmB, bem como a significância biológica dos vários Gzms órfãos ainda são obscuros. Po...

Os Gzms são uma família de serina-proteases altamente homólogas localizadas nos lisossomas especializados de CTL e as células NK 1. Os grânulos citotóxicos destas células assassinas, também contêm as proteínas de membrana de desregulação e PFN GNLY que são libertadas em simultâneo com as Gzms no reconhecimento de uma célula alvo destinado à eliminação 2,3. Existem cinco Gzms em seres humanos (GzmA, B, H, K e M), e 10 em ratos (Gzms GzmA - G, K, M e N). GzmA e GzmB são os mais abundantes e extensivamente estudados em humanos e ratos 1. No entanto, estudos mais recentes começaram a investigar os percursos de morte celular, bem como os efeitos biológicos adicionais mediadas pelos outros, os chamados Gzms órfãos na saúde e na doença 4. A função mais conhecida das Gzms, em particular de GzmA e GzmB, é a indução de morte celular programada em células de mamífero quando entregue nas células alvo por PFN 5,6. Porém, Estudos mais recentes também demonstraram efeitos extracelulares dos Gzms com profundo impacto sobre a regulação imune e inflamação, independentemente da entrega cytosolic pela PFN 7,8. O espectro de células que são mortos de forma eficiente após a entrada cytosolic dos Gzms também foi recentemente alargado a partir de células de mamíferos para 9,10 bactérias e até mesmo certos parasitas 11. Estas descobertas recentes abriu um novo campo para pesquisadores GZM. Portanto, um, de alto rendimento do sistema de expressão de mamífero custo-eficiente irá facilitar significativamente o caminho para esses estudos futuros. Humanos, ratos e de camundongos Gzms nativas foram purificados com sucesso a partir da fracção de grânulos de CTL e células NK linhas 12-14. No entanto, nas nossas mãos o rendimento de tais técnicas de purificação está na gama de menos do que 0,1 mg / L de cultura de células (observação não publicada e 12). Além disso, a resolução cromatograf ica de um único GZM sem contaminação por outrr Gzms e / ou proteínas que também estão presentes nos grânulos é um desafio (dados não publicados) e 12,14. Gzms recombinantes foram produzidas em bactérias, leveduras 15 16 17, células de insecto e em ainda em células de mamífero, tais como células HEK 293 18,19. Apenas os sistemas de expressão de mamífero suportar o potencial para produzir enzimas recombinantes com modificações pós-tradução idêntica à proteína nativa citotóxico. Modificações pós-tradução têm sido implicados com a captação especifica por endocitose e a localização intracelular da protease dentro das células alvo 20-22. Portanto, usando pHLsec 23 (um presente tipo de Radu Aricescu e Yvonne Jones, da Universidade de Oxford, Reino Unido) como a espinha dorsal do plasmídeo para a expressão GZM, foi estabelecido um sistema simples, tempo e custo-eficiente para a produção de proteínas de alto rendimento em HEK293T células. pHLsec combina um intensificador de CMV com um frango Β-actina promotor; juntos, esses elementos demonstrated a actividade do promotor mais forte em várias linhas de células 24. Além disso, o plasmídeo contém um intrão de coelho Β-globina, os sinais de secreção e de Kozak optimizada, um-6xHis-tag Lys e um sinal poli-A. As inserções podem ser convenientemente clonados entre o sinal de secreção e a-6xHis-tag Lys (Figura 1) assegurar a expressão óptima e eficiência de secreção para proteínas que não possuem domínios N-terminais adequados. Para a expressão das Gzms, que substituiu a sequência de sinal de secreção endógena com o sinal de secreção fornecida pelo vector, seguido por uma enteroquinase (EK) local (DDDDK), de modo que o tratamento EK activou a Gzms secretadas (Gzms activas começar com o N-terminal sequência de aminoácidos IIGG 25). Além disso, em favor deste método, as células HEK293T crescer rapidamente em baixa preço-médio, como meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), e são adequados para o método de transfecção com fosfato de cálcio eficiente em termos de custo.

<table><tbody><tr>Kit <td>de isolamento de RNA total</td>do <td>reagente TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase reversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 Meio sem soro para células HEK 293</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta, Suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Diálise SnakeSkin, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Enteroquinase do intestino bovino</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>recombinante, &ge; 20&nbsp; unidades/mg de proteína</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml coluna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>Níquel IMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP coluna de 5 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>Coluna S</td></tr><tr><td>N-&alfa;-Cbz-L-lisina tiobenziléster (BLT)</td><td>Substrato Sigma</td><td>C3647</td><td>GzmA</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>substrato GzmB</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilida (AAPL)</td><td>Substrato Bachem</td><td></td><td>GzmM</td></tr><tr><td>5,5&prime;-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB)</td><td>Reagente de Ellman</td> <td>Sigma</td><td>D8130</td></tr></tbody></table>

a high yield e custo-eficiente sistema de expressão de granzimas humanos em células de mamíferos

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Quando os linfócitos T citotóxicos (CTL) ou células natural killer (NK) reconhecem células tumorais ou células infectadas com patógenos intracelulares, eles liberam seu conteúdo de grânulos citotóxicos para eliminar as células-alvo e o patógeno intracelular. A morte das células hospedeiras e patógenos intracelulares é desencadeada pelas proteases de serina do grânulo, granzimas (Gzms), entregues ao citosol da célula hospedeira pela proteína formadora de poros perforina (PFN) e em patógenos bacterianos pela granulisina proteica disruptora da membrana procariótica (GNLY). Para investigar os mecanismos moleculares de morte de células-alvo mediadas pelo Gzms em ambientes experimentais in vitro, são necessários sistemas de expressão e purificação de proteínas que produzam grandes quantidades de enzimas ativas. Os sistemas de expressão de proteínas secretadas em mamíferos implicam o potencial de produzir proteínas totalmente funcionais e dobradas corretamente que apresentam modificações pós-traducionais, como a glicosilação. Portanto, usamos um método de precipitação de cálcio econômico para transfecção transitória de células HEK293T com Gzms humano clonado no plasmídeo de expressão pHLsec. A purificação de Gzm do sobrenadante da cultura foi obtida por cromatografia de afinidade de níquel imobilizado usando a marca de poli-histidina C-terminal fornecida pelo vetor. A inserção de um sítio de enteroquinase no terminal N da proteína permitiu a geração de protease ativa que foi finalmente purificada por cromatografia de troca catiônica. O sistema foi testado produzindo altos níveis de Gzm A, B e M humanos citotóxicos e deve ser capaz de produzir praticamente todas as enzimas do corpo humano em altos rendimentos.

Na seção seguinte, vamos apresentar uma documentação completa de uma preparação GzmA para iluminar o método. Nós também purificado com sucesso GzmB e GzmM, produzindo resultados semelhantes em relação à eficiência e atividade purificação. No entanto, a partir dessas preparações posteriores só vamos mostrar algumas peças seleccionadas de dados. Preparações GzmB de células 293T seguintes actual protocolo foram utilizados em vários estudos publicados, com destaque para a sua actividade em vários sistemas de ensaio biológic...

Descrevemos aqui um sistema de expressão de granzima econômico usando células HEK293T que produz altos rendimentos de protease pura, totalmente glicosilada e enzimaticamente ativa.

A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

O objetivo geral deste procedimento é obter altos rendimentos de granzimas glicosiladas folicamente e enzimaticamente ativas em células de rim embrionário humano 293T. Isso é conseguido primeiramente expandindo as células HEK 293T em placas de cultura tecidual apropriadas. O tamanho usual do preparo após a expansão consiste em 20 a 25 placas de cultura.O segundo passo é transfectar temporariamente as células expandidas com um plasmídeo de expressão de granzima utilizando o método eficiente de fosfato de cálcio. Em seguida, os sobrenadantes celulares são coletados e as enzimas granzimas secretadas são purificadas por cromatografia de afinidade com metal imobilizado. Os passos finais consistem em activar as enzimas granzimas mediante tratamento com enteroquinase e realizar uma purificação adicional das proteases por meio de cromatografia de troca catiónica.Por fim, a atividade enzimática é testada utilizando um ensaio colorimétrico rápido e confiável. Como a disponibilidade de protease ativa em quantidades suficientes é um fator limitante na pesquisa de granzimas, este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área, como a caracterização de novas vias de morte celular em diferentes organismos ou a identificação de novos substratos de protease em abordagens de proteoma completo para expressar enzimas granzimas. Primeiro, cultive células HEK 293T em 20 mililitros de meio de cultura, utilizando placas de cultura tecidual de 150 por 25 milímetros, dividindo as células em 80% de confluência. As células aderem fracamente, mas podem ser destacadas mecanicamente sem tripsina, pipetando vigorosamente para cima e para baixo na placa.As células na noite anterior à transfeção para atingir 60 a 70% de confluência no dia da transfeção. Um preparo típico consiste em 20 a 25 placas de cultura. Uma hora antes da transfeção, substitua o meio de cultura padrão por 20 mililitros de meio de transfeção. Quase ao final do passo de incubação de uma hora, misture 400 microgramas de DNA plasmidial com 10,95 mililitros de água bidestilada e 1,55 mililitros de cloreto de cálcio 2 molar em tubos de 50 mililitros, um a dois minutos antes da transfeção.Adicione 12,5 mililitros de solução salina tamponada com fosfato duas vezes a 12,5 mililitros da solução de DNA com cálcio, misturando por inversão dos tubos antes de incubar por 30 segundos. À temperatura ambiente, adicione esta mistura gota a gota diretamente às células, usando cinco mililitros por placa, distribuindo uniformemente por toda a área, fazendo com que o meio fique levemente cor de laranja. Incube as placas de cultura por sete a onze horas em um incubador de cultura de tecidos.Após a incubação, um precipitado fino é visível. Remova o meio de transfeção. Lave cuidadosamente com PBS pré-aquecido e adicione 20 mililitros de meio de cultura sem soro antes de incubar por 72 horas em uma incubadora de cultura de tecidos. Analise a eficiência de transfeção e expressão realizando uma amostra do sobrenadante celular em gel de SDS-PAGE e corando com azul de Comassie.Azul brilhante. Para visualizar uma faixa de granzima. Após a incubação, decante os sobrenadantes do cultivo celular para tubos de 250 mililitros e clarifique por centrifugação.Realize uma primeira centrifugação para remover o meio das células destacadas. Transfira o sobrenatante para tubos novos de 250 mililitros e centrifugue a 4.000 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover qualquer resíduo celular remanescente. Em seguida, adicione cinco mililitros de cloreto de sódio, 6,25 mililitros de tris base e um mililitro de sulfato de níquel, além de 250 mililitros do sobrenatante clarificado.Filtre o sobrenadante utilizando uma unidade de filtração a vácuo de 500 mililitros. Equilibre uma coluna de cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados em níquel com o tampão de ligação his. A utilizando um sistema FPLC apropriado.Em seguida, aplique o sobrenadante clarificado à coluna equilibrada a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto a quatro graus Celsius. Após a aplicação do sobrenadante, lave a coluna com o tampão de ligação até que a linha de base de absorvência ultravioleta ou UV seja alcançada. Elua as granzimas com um gradiente linear de 20 mililitros de ILE a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto, coletando frações de dois mililitros.Analisar as frações elucianas por eletroforese SDS-PAGE e coloração com kumasi. Reunir as frações contendo a enzima grand em um tubo de dazing. Armazenar uma pequena amostra a menos 20 graus Celsius como controle pré-enteroquinase.Adicione enterocinase na concentração de 0,02 unidades por 50 mililitros do sobrenadante inicial diretamente à fração agrupada no tubo de diálise e realize a diálise durante a noite à temperatura ambiente em tampão de enterocinase. No dia seguinte, analise a fração tratada com enterocinase em comparação com o controle pré-enterocinase por eletroforese em gel de SDS e coloração com azul de Comassie. Quando o processamento da extremidade terminal estiver completo.Altere o tampão de diálise para tampão S A e realize a diálise por mais quatro horas à temperatura ambiente antes de filtrar o DIALATE oito. Em seguida, equilibre uma coluna S com o tampão S. A. Carregue a amostra na coluna a uma vazão de 0,5 mililitros por minuto a quatro graus Celsius após a aplicação da amostra.Lave a coluna com tamp&atilde;o S A at&eacute; que a linha de base da absor&ecirc;ncia UV seja atingida. Elua as granzimas com um gradiente linear de cloreto de s&oacute;dio de 30 mililitros; a granzima A elui a aproximadamente 650 milimolar de cloreto de s&oacute;dio, a granzima B a aproximadamente 700 milimolar de cloreto de s&oacute;dio e a granzima M a aproximadamente 750 milimolar de cloreto de s&oacute;dio. Re&uacute;na as fra&ccedil;&otilde;es contendo granzimas e concentre at&eacute; cerca de 100 micromolar em filtros de centrifuga&ccedil;&atilde;o, al&iacute;quota os preparos concentrados de granzima e armazene a menos 80 graus Celsius.Em seguida, analise as frações elucianas por SDS-PAGE e ensaios colorimétricos; para realizar os ensaios colorimétricos, distribua pequenas amostras de granzima das frações elucianas ou de estoques concentrados em placas de 96 poços com fundo plano, incluindo um controle positivo e um controle negativo. Adicione 100 microlitros de tampão de ensaio a cada poço.Incube bem a placa por 10 minutos a 37 graus Celsius. Por fim, meça a densidade óptica a 405 nanômetros em um leitor de microplacas. Este protocolo produzirá altos rendimentos de granzimas purificadas, conforme demonstrado neste gel representativo de eletroforese SDS-PAGE corado com kumassi, mostrando a granzima BE da coluna S.As granzimas recombinantes exibem atividade semelhante às preparações nativas de protease, conforme demonstrado neste ensaio colorimétrico que compara a atividade da granzima B recombinante e nativa. Importante, o tratamento com endo H indica que as granzimas produzidas nas células HEC 293T estão completamente glicosiladas. As granzimas recombinantes são capazes de clivar substratos proteicos macromoleculares, como demonstrado neste ensaio representativo de clivagem da granzima A utilizando o substrato proteico bacteriano e UOCD.Aqui, a banda que representa a clivagem de N-O-U-C-D desaparece lentamente com o aumento da concentração de granzima. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir enzimas granzima completamente glicosiladas e pró-ativas com altos rendimentos em células HK 2 93 T.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Na era pós-genômica humana, a disponibilidade de proteínas recombinantes em conformações nativas é crucial para a investigação estrutural, funcional e terapêutico e desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um-teste e em grande escala sistema de expressão de proteínas em células humanas embrionárias de rim 293T que podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas recombinantes.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

A expressão de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos está se tornando um método atraente para a produção de complexos proteicos para biologia estrutural. Aqui apresentamos um sistema de expressão simples, mas altamente eficiente, usando células de mamíferos cultivadas em suspensão para purificar complexos de proteínas para estudos estruturais.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

Descrevemos um ensaio colorimétrico simples e quantitativo que mede especificamente a atividade proteolítica da Granzyme B (GzmB) humana, de camundongo ou de rato. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para determinar a atividade da protease de outras proteases de serina de grânulos pela hidrólise de outros substratos peptídicos sintéticos com uma sequência de reconhecimento apropriada.

Um ensaio colorimétrico que mede Especificamente granzima B Actividade proteolítica: Hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Neste estudo, a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em diferentes plataformas de produção foi comparada. Focamos em culturas tradicionais baseadas em fermentadores e em plantas, descrevendo a configuração de cada sistema e destacando, com base nos resultados relatados, os limites e vantagens inerentes a cada plataforma.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Expressão de proteínas da malária em sistemas baseados em células permanece um desafio. Nós demonstramos dois sistemas de célula livre expressão de passo e um passo IVT (em tradução vitro) para expressar proteínas recombinantes rhoptry malária a partir de células HeLa. Nós usamos um sistema de purificação baseado afinidade Ni-resina para purificar as proteínas rhoptry.

Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Este é um protocolo rápido e econômico para a produção de proteínas de mamíferos glicosiladas secretadas e subsequente purificação em uma única etapa com rendimentos suficientes de proteína homogênea para cristalografia de raios-X e outros estudos biofísicos.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .

Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos

Fornecemos protocolos escaláveis que abrangem a conceção de construções, transfecção transitória e expressão e purificação de variantes da proteína huntingtina humana de comprimento total em células HEK293.

Produção Eficiente e Escalável de Variantes de Huntingtina Humana de Comprimento Completo em Células de Mamíferos utilizando um Sistema de Expressão Transitória

Sua marca purificação, diálise e ativação são empregadas para aumentar os rendimentos da expressão proteica de domínio catalítico de matriz solúvel-3 em bactérias. As frações proteicas são analisadas através de géis SDS-PAGE.

Expressão bacteriana e purificação da matriz humana Metaloproteinase-3 usando cromatografia de afinidade

Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Aprenda a expressão de granzimas em células HEK293T com alta produção e baixo custo. Este método utiliza transfecção com fosfato de cálcio e cromatografia de afinidade para obter proteases glicosiladas e enzimaticamente ativas.

A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

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