Correlativo Confocal e Microscopia Eletrônica 3D de uma célula sensorial específica

O objetivo geral deste procedimento é documentar a ultraestrutura completa de uma célula sensorial intestinal específica espalhada entre outras células epiteliais no tecido intestinal nativo. Isso é feito obtendo primeiro um segmento de tecido de 300 por 50 mícrons do intestino. Em seguida, são obtidas pilhas Z ópticas do segmento usando microscopia confocal.

Em seguida, os dados confocais servem como um guia para processar e obter imagens do tecido usando microscopia eletrônica de varredura facial em bloco serial ou SBEM. Finalmente, os dados do SBEM são segmentados para renderizar a ultraestrutura de uma célula sensora intestinal específica em 3D. Em última análise, microscopia confocal correlativa e varredura facial de bloco serial.

A microscopia eletrônica é usada para mostrar uma célula específica em seu tecido nativo e revelar sua ultra estrutura em 3D. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia celular, como as interações específicas célula a célula que não poderiam ser visualizadas de outra forma em um nível de microscopia de luz. Ao usar este método, relatamos anteriormente uma relação físico-química oculta entre as células sensoriais que entram na endocrina e entram na ggl.

Depois de isolar o cólon do camundongo, de acordo com o protocolo de texto, coloque-o em PBS frio e agradável e, enquanto submerso, corte o tecido aberto ao longo da mescenria, transfira o tecido para algumas gotas de PBS em uma folha de cera dentária e, usando um bisturi, xinge cerca de seis pequenos segmentos de tecido do cólon distal. Depois de preparar 5% de baixo derretimento em PBS, use-o para incorporar os segmentos de tecido em um pequeno recipiente de plástico, como o molde criogênico de tecnologia de tecido de tamanho padrão, monte as seções embutidas em um micrótomo de lâmina vibratória e use PBS gelado para encher a bandeja tampão. Em seguida, corte tiras de tecido de 300 mícrons na amplitude de 0,8 e velocidade de 0,04 milímetros por segundo.

Penteie as tiras de tecido de 300 mícrons em aros e monte-as em um microtom perpendicular à lâmina. Em seguida, corte tiras de tecido com uma espessura de 50 mícrons, referindo-se ao protocolo de texto para obter detalhes antes de armazenar os blocos em PBS a quatro graus Celsius. Após a imagem dos blocos de tecido usando microscopia confocal de acordo com o protocolo de texto para infiltrar e incorporar seções de tecido em resina.

Remova o tecido do PBS e use tampão de co-revestimento 0,1 molar para enxaguá-lo três vezes por cinco minutos cada. Uma vez que a resina tenha sido preparada e os tecidos tenham sido corados para microscopia eletrônica, de acordo com o protocolo de texto, use-a para colocar blocos de tecido entre lâminas de vidro curadas com um agente desmoldante líquido após os blocos de tecido terem sido incorporados, cure os blocos por mais 48 horas a 60 graus Celsius. Em seguida, separe as lâminas para liberar os blocos sob um escopo de dissecação, combine a orientação dos blocos de tecido embebidos em resina com a das micrografias confocais.

Para facilitar a identificação das regiões que contêm as células de interesse, monte o bloco em um pino contendo um epóxi condutor e seque por 30 minutos. Em seguida, coloque o bloco sobre uma superfície e seque durante a noite a 60 graus Celsius no dia seguinte. Cubra o bloco com líquido de prata coloidal.

Mantenha as seções de tecido planas para garantir o corte do bloco no ângulo certo para facilitar a correlação da face do bloco serial e das micrografias confocais. Depois de realizar a microscopia eletrônica de varredura de acordo com o protocolo de texto, converta as imagens SPEM do formato DM bruto de três para imagens TIFF de oito bits usando um filtro de desfoque gaussiano de 0,8 em Fiji. Filtre as imagens TIFF.

Reduza o conjunto de dados para 25% do tamanho original e salve-o como uma pilha TIFF para minimizar a quantidade de memória RAM necessária para lidar com o conjunto de dados com o alinhamento de pilha linear do plug-in Fiji com sift no modo de tradução. Alinhe a pilha de imagens SPEM e use o plug-in crop 3D para cortá-las. Para renderizar os dados, use a ferramenta superfícies no modo de desenho e a opção de contorno no modo de desenho de 50 milissegundos para segmentar e renderizar manualmente o volume da célula de interesse.

Trace contornos em cada fatia da célula para uma renderização mais suave ou a cada cinco fatias para uma renderização mais rápida. Use a ferramenta de instantâneo para exportar as imagens finais com uma resolução de 300 DPI ou mais usando o mouse P-Y-Y-G-F-P. Todas as células enteroendócrinas da parte distal do intestino delgado são identificadas e processadas para SBEM, conforme mostrado aqui.

Um segmento de tecido selecionado foi fotografado por microscopia confocal para obter imagens de Zack, que são espaçadas opticamente em um mícron. A otimização das dimensões dos blocos de tecido é fundamental para a correlação topográfica entre os dados confocais e SBEM. Este volume renderizado vista de uma célula enteroendócrina no íleo do camundongo mostra um neuro pod proeminente estendido sob células epiteliais de aproximadamente 60 mícrons.

Ao correlacionar as pilhas Z confocais com uma imagem SBEM de toda a face do bloco, a célula de interesse é identificada aqui em um bloco do cólon distal do camundongo A-P-Y-Y-G-F-P. É importante manter a orientação do bloco o mais plana possível para corresponder às fatias ópticas nas imagens SBEM. Uma vez que a célula tenha sido identificada, a imagem SBEM é feita com uma resolução alta o suficiente para identificar lesmas secretoras e outras organelas celulares.

Este vídeo contém uma renderização em 3D da célula enteroendócrina. O conjunto de dados contém 643 imagens que abrangem 45 mícrons da profundidade do tecido. A célula contém um neuropod repleto de les secretores, bem como microvilosidades.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como documentar a ultraestrutura completa de um intestino específico A célula sensorial está espalhada entre outras células epiteliais no tecido intestinal nativo usando a fluorescência como um guia para identificar a célula ou células de interesse e processar o tecido para microscopia eletrônica de varredura de fase de bloco serial.