A visualização imuno-histoquímica de Hippocampal Neuron Atividade Após Spatial Aprendizagem em um rato modelo de desordens do desenvolvimento neurológico

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar mudanças na fosforilação do hipocampo após o aprendizado espacial em camundongos nocaute Grailed como um modelo de distúrbios do neurodesenvolvimento. Isso é conseguido testando primeiro camundongos nocauteadores do tipo selvagem e do graal dois no labirinto aquático de Morris. Como segunda etapa, os cérebros dos camundongos são removidos e fatias de camundongos selvagens e knockout são preparadas por corte de vioma.

Em seguida, fatias de cérebro de camundongos selvagens e knockout são processadas para imuno-histoquímica e usadas para detectar alterações de fosforilação no hipocampo. Os resultados mostram diferenças na fosforilação do RC do hipocampo entre camundongos knockout do tipo selvagem e do grail dois com base na visualização por microscopia de luz da coloração imuno-histoquímica. Este método permite identificar subconjuntos específicos de neurônios do hipocampo que são ativados após uma tarefa de aprendizagem especial dependente do hipocampo, como o labirinto aquático de Maurice.

Adicionamos a ideia para este método pela primeira vez quando decidimos investigar a cascata molecular que sublinha o déficit molecular em camundongos knockout de grau dois, um modelo de camundongo para transtornos do espectro do autismo. Para começar, treine ratos de várias origens de interesse em uma tarefa de aprendizagem espacial, como o Morris Water Mae. Siga o regime de treinamento conforme descrito no protocolo de texto que acompanha no final do período de treinamento, eutanasiar os camundongos e, em seguida, corrigir e remover seus cérebros.

Quando estiver pronto para continuar com o procedimento, use um bisturi para remover o cerebelo. Em seguida, cole o resto do cérebro na vertical na placa de suporte do vibrato. Corte o cérebro em seções seriadas de 20 a 40 mícrons de espessura em todo o hipocampo dorsal.

Transfira cada fatia para um poço de uma placa de 24 poços preenchida com um mililitro de PBS 0,1 molar, transfira de três a cinco seções dorsais do hipocampo para cada camundongo nos poços de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de PBS de 0,1 molar para cada um. Lave bem as seções contidas em cada poço com 500 microlitros de PBS 0,1 molar, realize todas as lavagens e incubações à temperatura ambiente com agitação suave, salvo indicação em contrário. Sob uma capela de exaustão, incubar as seções em 40% de metanol, peróxido de hidrogênio a 1% em PBS 0,1 molar por 20 minutos para extinguir a atividade da peroxidase endógena.

Após mais três lavagens em PBS 0,1 molar perme as seções, incubando-as em 500 microlitros de 0,2% Triton X 100 por cinco minutos enquanto as seções estão incubando, prepare tampão de bloqueio suficiente para todo o experimento. Em seguida, remova a solução permeável e adicione 100 microlitros do tampão de bloqueio a cada um. Bem, incube as seções por uma hora.

Em seguida, remova o tampão de bloqueio e cubra as seções com quinase regulada extracelular fosforilada. O anticorpo primário diluído de um a 500 no tampão de bloqueio. Incube as seções durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave no dia seguinte após lavar as seções três vezes em PBS 0,1 molar por cinco minutos.

Cada um incuba as seções com um anticorpo secundário conjugado com biotina diluído de um a 250 em tampão de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente durante a incubação. Prepare o reagente A BC pelo menos 30 minutos antes do uso para dar tempo suficiente para que o complexo Aden e biotina se formem. Depois de lavar as seções mais três vezes com PBS 0,1 molar, adicione o reagente A, b, C e deixe-o incubar com a amostra por 45 minutos.

Durante a próxima série de três lavagens em PBS, preparar a solução de trabalho DAB na hotte de acordo com as especificações do fabricante, alíquota da solução de trabalho DAB na placa. Em seguida, transfira as seções para os poços que contêm a solução de trabalho DAB e gire lentamente a placa para permitir a exposição máxima das seções à solução. Monitore a reação DAB em um microscópio até que o sinal adequado se desenvolva.

Em cerca de dois a cinco minutos, pare a reação na intensidade de cor desejada lavando o tecido em PBS 0,1 molar. Após mais três lavagens em PBS, monte as seções em lâminas revestidas de gelatina e seque-as em temperatura ambiente por pelo menos três a quatro horas. Uma vez secas ao ar, transfira as corrediças na hotte e desidrate as seções, colocando-as sequencialmente em soluções integradas de etanol por dois minutos cada, depois limpe as lâminas em 100% xileno por cinco minutos.

Cubra, deslize as lâminas usando o meio de montagem e deixe-as na capela de exaustão durante a noite para transferir as lâminas a seco para um microscópio de campo claro, equipado com uma câmera e uma lente objetiva de 20 x. Adquira várias imagens de campo claro de cada seção com ampliação de 200 x cobrindo a imagem do hipocampo dorsal. Três a cinco seções de cada animal.

Aqui são mostradas seções das regiões dorsais dos campos de hipopótamos de um camundongo do tipo selvagem e um camundongo nocaute Grailed two corado para fosforilado. Extracelular regulou uma leitura molecular confiável da ativação neuronal dependente de aprendizado. Ambos os camundongos foram submetidos a um regime clássico de tarefas de aprendizado espacial dependente do hipocampo, o labirinto aquático de Morris antes do sacrifício.

No último dia de testes, os dois camundongos nocautes Grailed exibiram um déficit significativo de aprendizado espacial em comparação com os camundongos do tipo selvagem. Para analisar as fatias de cérebro dos camundongos, o número total de células positivas foi contado nas várias regiões do hipocampo. Na camada de três parâmetros CA, os camundongos do tipo selvagem apresentaram significativamente mais células RK positivas fosforiladas por área do que nos camundongos knockout.

Resultados opostos foram encontrados na camada de células hili e grânulos ou GCL. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar a formulação de phos em fatias de cérebro do hipocampo de modelos genéticos e farmacológicos de camundongos de distúrbios do neurodesenvolvimento caracterizados por déficits cognitivos. Essa técnica também pode ser usada para estudar mudanças na formulação da força de irritação em outras áreas do cérebro, bem como seguir tarefas cognitivo-comportamentais diferentes do labirinto de Maurice Water.

Não se esqueça de que trabalhar com benzina DIA pode ser extremamente desertor e por precauções, como usar proteções adequadas, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.