Preparação fácil e eficiente de glicopolímeros fluorescentes Tri-componente via polimerização controlada pelo JANGADA

O objetivo geral deste procedimento é a síntese bem controlada de polímeros glicossilares lineares estatísticos fluorescentes utilizando a polimerização por transferência de fragmentação com adição reversível, ou polimerização por raft. Isso é realizado primeiramente pela síntese do monômero glicossilado dois lacto bio etil metacrilamida, ou L-A-E-M-A. O segundo passo consiste em utilizar a polimerização por raft de L-A-E-M-A-N duas etil metacrilamidas amino, ou A EMA, e N duas acrilamidas hidroxietílicas ou a GAA para sintetizar o polímero glicossilado correspondente com baixa dispersidade.

Em seguida, o glicopolímero é modificado em uma de suas aminas primárias por reação com o éster intermediário do ácido carboxifluoresceína, produzindo um glicopolímero marcado com fluoresceína. O passo final consiste em ligar o glicopolímero marcado com fluoresceína a microesferas revestidas com lectina, com especificidade conhecida de ligação a carboidratos. Por fim, utiliza-se microscopia de fluorescência para analisar a ligação dos glicopolímeros às microesferas, confirmando que o glicopolímero possui o carboidrato de interesse e está marcado com uma etiqueta fluorescente.

A vantagem da polimerização RAF em relação aos métodos existentes que empregam polimerizações livres convencionais é que o processo wrath é uma técnica de polimerização controlada que minimiza o número de cadeias derivadas do iniciador. Isso resulta em polímeros com massas moleculares predeterminadas e uma dispersão muito estreita. As polimerizações podem ser aplicadas a uma mistura definida de monômeros para a preparação de glicopolímeros fluorescentes específicos.

Esses glicopolímeros possuem capacidades de ligação definidas que podem ser verificadas pelo uso de microesferas revestidas com lectina. A preparação eficiente de glicopolímeros fluorescentes deverá revelar-se de grande valor para a pesquisa em glicobiologia no futuro. Para começar, dissolva dois gramas de ácido lactobiónico em três mililitros de metanol anidro.

Em seguida, adicione etanol absoluto gota a gota à solução lentamente até que ela fique levemente turva. Utilize um evaporador rotativo para remover todos os solventes. Repita este processo três vezes para produzir 1,94 gramas de lacto bioo um cinco lactona com rendimento de 98%.

Adicione uma solução de um grama de lacto bio lactona em três mililitros de metanol a uma solução de A EMA e MEHQ em dois mililitros de metanol. Em seguida, adicione um mililitro de trietilamina e agite a mistura à temperatura ambiente. Após 48 horas, adicione 20 mililitros de água desionizada à mistura e transfira-a para um evaporador rotativo.

Evapore até completa secagem. Dissolva o resíduo em 20 mililitros de água deionizada e aplique a solução sobre a parte superior de uma coluna de troca aniônica de 10 por 20 milímetros. Posicione um béquer contendo um miligrama de MEHQ sob a saída e elua a coluna para dentro do béquer.

Após evaporar a solução em evaporador rotativo, dissolva o resíduo em 20 mililitros de água desionizada e adicione alíquotas de um miligrama de resina de troca iônica. Prossiga até que o teste de hidrante seja negativo, realizado em testes de hidrante removendo-se um microlitro da solução e aplicando-o em uma placa de cromatografia em camada delgada. Pulverize a placa com uma solução de 2% de anidrina em etanol e aqueça a 90 graus Celsius por um minuto em uma placa aquecedora.

O ponto final é atingido quando nenhuma cor azul se forma. Em seguida, filtre a solução através de um funil de vidro sinterizado em um tubo de ensaio. Congele a solução a menos 80 graus Celsius e, depois, transfira-a para um liofilizador para ser liofilizada.

Dissolva o resíduo em uma quantidade mínima de metanol e precipite o produto adicionando acetona anidra a menos 20 graus Celsius. Colete o L-A-E-M-A precipitado por filtração através de um funil de vidro sinterizado. Transfira o funil e o precipitado para um dessecador a vácuo para secagem, adicionando inicialmente 0,5 gramas de nanopartículas de óxido de alumínio de aproximadamente 150 mesh a um mililitro de HEAA de grau comercial em um tubo de ensaio de dois mililitros.

Centrifugue o tubo a 300 vezes G durante 30 segundos e utilize a camada superior como HEAA livre de inibidor. Dissolva cuidadosamente 32,8 miligramas de L-A-E-M-A, 1,7 miligramas de a EMA e 27,5 microlitros de HEAA livre de inibidor e 0,4 mililitros de água desionizada e transfira a solução para um tubo cônico bem limpo de um mililitro. Em seguida, adicione 50 microlitros do reagente raft e 50 microlitros do reagente iniciador ao tubo e misture batendo suavemente na lateral do tubo com a válvula fechada. Conecte o tubo a uma linha de vácuo e congele o conteúdo utilizando um banho de etanol com gelo seco.

Em seguida, reduza a pressão do tubo até atingir aproximadamente 50 militorr com uma bomba e feche a válvula. Remova o banho de gelo seco e deixe o conteúdo descongelar. Repita cuidadosamente o ciclo de congelamento, vácuo e descongelamento mais duas vezes.

Inspecione o tubo para garantir que o conteúdo esteja completamente dissolvido e vortexe suavemente, se necessário. Antes de selar, remova o tubo fechado da linha de vácuo e coloque-o em um saco plástico transparente para vácuo. Remova o ar do saco com uma bomba de plástico manual.

Em seguida, coloque o saco em um banho-maria coberto a 70 graus Celsius por 24 horas. Depois, retire o tubo do saco e transfira o seu conteúdo para um saco de diálise com corte de peso molecular de 3.500 Daltons. Coloque o saco de diálise em um béquer e realize a diálise contra dois litros de água deionizada por 24 horas.

Transfira o conteúdo do saco de diálise para um tubo de ensaio e coloque-o em um congelador a 80 graus Celsius negativos. Após congelamento, transfira para um liofilizador e liofilize. Para obter o glicopolímero branco esbranquiçado PMA LA EMA, primeiro prepare uma solução de cinco miligramas de PMA LA EMA em 0,9 mililitros de PBS.

Em seguida, adicione lentamente 0,6 miligramas de carboxi-fluoresceína cin, éter médio em 100 microlitros de dimetilformamida à solução rapidamente agitada no tubo de microcentrífuga e com folha de alumínio, e agite lentamente por 16 horas à temperatura ambiente. Transfira a solução para uma bolsa de diálise com limite de peso molecular de 3.500 Daltons. Coloque a bolsa em um béquer e realize a diálise contra dois litros de água deionizada por 16 horas, mantendo-a protegida da luz. Transfira o conteúdo da bolsa de diálise para um tubo de ensaio.

Após congelar a solução a menos 80 graus Celsius, liofilize. Para obter o polímero glicosilado P-M-A-L-A-E-M-A marcado com fluoresceína amarela esponjosa, determine o peso molecular médio numérico, o peso molecular médio ponderal e a dispersidade dos polímeros glicosilados com um sistema de HPLC. Primeiro, adicione 1,5 mililitros de PBS a uma suspensão de 50 microlitros de microesferas revestidas com lectina de Erythrina cristagalli em um tubo de centrífuga.

Em seguida, centrifugue o tubo a 300 vezes G durante um minuto. Depois, descarte o sobrenadante e repita a lavagem mais duas vezes antes de, finalmente, adicionar 0,5 mililitros de PBS. Adicione uma solução de três microgramas de PMA LA EMA marcada com fluoresceína em seis microlitros de PBS ao tubo contendo as microesferas revestidas com lectina.

Utilize P-M-A-G-A-E-M-A marcado com fluoresceína como controle negativo. Em seguida, enrole os tubos com papel alumínio e incube-os à temperatura ambiente por uma hora. Centrifugue o tubo por um minuto e descarte o sobrenadante.

Em seguida, re-suspenda as microesferas em 1,5 mililitros de PBS fresco e repita a lavagem três vezes. Por fim, re-suspenda as microesferas em 0,2 mililitros de PBS. Transfira quatro microlitros das microesferas suspensas para um poço de uma lâmina para microscopia de imunofluorescência, cubra com uma lamínula de vidro e registre.

Imagens do lâmina utilizando um microscópio fluorescente equipado com filtro FITC de objetiva 10x e câmera. Os glicopolímeros foram analisados por cromatografia de permeação em gel. Os polímeros sintetizados sem o uso de raft apresentam dispersidade muito maior do que aqueles produzidos com o uso de raft.

Quando marcado com fluoresceína, a aparência física do glicopolímero muda de branca para uma cor amarela intensa, visível sob luz ultravioleta. Uma solução de polímero não marcado permanece escura, enquanto o polímero marcado com fluoresceína emite uma luz verde brilhante, confirmando a presença da marcação. A ligação específica aos microesferas revestidas com lectina ocorre apenas com polímeros que possuem resíduos açucarados pendentes; as microesferas brilham em verde ao se ligarem, enquanto permanecem escuras quando tratadas com polímeros que não possuem resíduos açucarados pendentes. Essa técnica de polimerização baseada em "raft" permite grande flexibilidade no tipo de glicopolímeros que podem ser sintetizados.

A marcação subsequente dos glicopolímeros também pode ser realizada com uma grande variedade de reagentes fluorescentes, capazes de reagir com aminas primárias em ambiente aquoso. Pesquisadores na área de glicobiologia podem utilizar esta técnica para obter prontamente glicopolímeros altamente versáteis e definidos. Esses glicopolímeros podem ser usados como ferramentas para explorar as especificidades de ligação a carboidratos, como as observadas na via respiratória de pacientes com fibrose cística ou aquelas envolvidas em muitos tipos de cânceres humanos.