Preparação fácil e eficiente de glicopolímeros fluorescentes Tri-componente via polimerização controlada pelo JANGADA

O objetivo geral deste procedimento é a síntese bem controlada de glicopolímeros lineares estatísticos fluorescentes usando fragmentação de adição reversível, transferência de cadeia ou polimerização de jangada. Isso é feito sintetizando primeiro o glico monômero dois lacto bio etil metanfetamina acrilamida, ou L-A-E-M-A. O segundo passo é usar a polimerização em jangada de L-A-E-M-A-N dois amino etil metanfetamina, ou A EMA e N duas hidroxietilacrilamida ou um GAA para sintetizar o glicopolímero de baixa dispersão correspondente.

Em seguida, o glicopolímero é modificado em uma de suas aminas primárias por reação com éster médio de carboxifluoresceína xito para produzir um polímero de glico fluoresceína. A etapa final é ligar o polímero de glico nativo de fluoresceína a grânulos surgidos revestidos de lectina com especificidade conhecida de ligação a carboidratos. Em última análise, a microscopia fluorescente é usada para analisar a ligação dos glicopolímeros aos grânulos surgidos, confirmando que o glicopolímero possui o carboidrato de interesse e é marcado com uma etiqueta fluorescente.

A vantagem da polimerização RAF sobre os métodos existentes que empregam polimerizações convencionais de radicais livres é que o processo de ira é uma técnica de polimerização de controle que minimiza o número de cadeias derivadas do iniciador. Isso resulta em polímeros de pesos moleculares predeterminados e rack de polidispersão muito estreito. As polimerizações podem ser aplicadas a uma mistura definida de monômeros para a preparação de glicopolímeros fluorescentes específicos.

Esses glicopolímeros têm habilidades de ligação definidas que podem ser verificadas pelo uso de grânulos revestidos de lectina. A preparação eficiente de glicopolímeros fluorescentes deve ser de grande valor para a pesquisa em glicobiologia no futuro. Para começar, dissolva dois gramas de ácido lacto biônico em três mililitros de metanol anidro.

Em seguida, adicione lentamente etanol absoluto gota a gota à solução até que fique turva. Use um evaporador rotativo para remover todos os solventes. Repita este processo três vezes para produzir 1,94 gramas de lactona lacto bioo one five em 98% de rendimento.

Adicione uma solução de um grama de lacto biolactona em três mililitros de metanol a uma solução de A, EMA e MEHQ em dois mililitros de metanol. Em seguida, adicione um mililitro de trietilamina e mexa a mistura em temperatura ambiente. Após 48 horas, adicione 20 mililitros de água deionizada à mistura e transfira-a para um evaporador rotativo.

Evaporar até secar completamente. Dissolva o resíduo em 20 mililitros de água deionizada e aplique a solução no topo de uma coluna de troca aniônica de 10 por 20 milímetros. Coloque um béquer contendo um miligrama de MEHQ embaixo da saída e elua a coluna no béquer.

Depois de aspirar a solução em um evaporador rotativo, dissolver o resíduo em 20 mililitros de água deionizada e adicionar alíquotas de um miligrama de resina de troca iônica. Até que um teste de hidrante seja negativo, realizado em testes de hidrantes, removendo um microlitro da solução e aplicando-o em uma placa de cromatografia em camada fina. Pulverize a placa com uma solução de etanol a 2% de anhy e aqueça a 90 graus Celsius por um minuto em uma placa quente.

O ponto final foi atingido quando nenhuma cor azul se forma. Em seguida, filtre a solução através de um funil de vidro frito em um tubo de ensaio. Congele a solução a 80 graus Celsius negativos e depois transfira-a para um liofilizador para ser liofilizada.

Dissolver o resíduo numa quantidade mínima de metanol e precipitar o produto adicionando menos 20 graus Celsius e acetona anidra. Coletar o L-A-E-M-A precipitado por filtração através de um funil de vidro fritado. Transfira o funil e precipite para um dessecador a vácuo para secar primeiro a 0,5 gramas de aproximadamente 150 nanopartículas de óxido de alumínio mesh para um mililitro de HEAA de grau comercial em um tubo de ensaio de dois mililitros.

Centrifugue o tubo a 300 vezes G por 30 segundos e use a camada superior como HEAA livre de inibidores, dissolva cuidadosamente 32,8 miligramas de L-A-E-M-A, 1,7 miligramas de um EMA e 27,5 microlitros de HEAA livre de inibidores e 0,4 mililitros de água deionizada e transfira a solução para um tubo de flanco de um mililitro bem limpo. Em seguida, adicione 50 microlitros de reagente de jangada e 50 microlitros de reagente iniciador ao tubo e misture batendo suavemente na lateral do tubo com a válvula fechada. Conecte o tubo a uma linha de vácuo e congele o conteúdo usando um banho de etanol com gelo seco.

Em seguida, reduza a pressão do tubo para tender a 50 militorr com uma bomba e feche a válvula. Remova o banho de gelo seco e deixe o conteúdo descongelar. Repita o ciclo de congelamento, vácuo e descongelamento mais duas vezes com cuidado.

Inspecione o tubo para garantir que o conteúdo esteja totalmente dissolvido e bata suavemente, se necessário. Antes de assentar, remova o tubo fechado da linha de vácuo e coloque-o em um saco plástico transparente. Evacue o ar do saco com uma bomba manual de plástico.

Em seguida, coloque o saco em banho-maria coberto a 70 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, remova o tubo da bolsa e transfira seu conteúdo para uma bolsa de diálise com um corte de peso molecular de 3.500 Daltons. Coloque a bolsa de diálise em um béquer e dialise contra dois litros de água deionizada por 24 horas.

Transfira o conteúdo da bolsa de diálise para um tubo de ensaio e coloque-o em um freezer a 80 graus Celsius negativos. Depois de congelado, transfira para um liofilizador e liofilize. Para obter o glicopolímero branco fofo PMA LA EMA primeiro, prepare uma solução de cinco miligramas de PMA LA EMA em 0,9 mililitros de PBS.

Em seguida, adicione lentamente 0,6 miligramas de carboxifluoresceína cina, meio eter em 100, microlitros de dimetilformamida à solução rapidamente agitada, ao microtubo e ao papel alumínio, e mexa lentamente por 16 horas em temperatura ambiente, transfira a solução para uma bolsa de diálise com um corte de peso molecular de 3.500 Daltons. Coloque o saco em um béquer e dialise contra dois litros de água deionizada por 16 horas, mantendo-o protegido da luz. Transfira o conteúdo da bolsa de diálise para um tubo de ensaio.

Depois de congelar a solução a 80 graus Celsius negativos, liofilizar. Para obter o fluorescente amarelo fofo marcado com P-M-A-L-A-E-M-A, polímero de glico, determine o número de peso molecular médio, o peso, o peso molecular médio e a dispersão dos glicopolímeros com um sistema de HPLC. Primeiro com 1,5 mililitros de PBS para uma suspensão de 50 microlitros de contas de aro revestidas com lectina ery Krista galley em um tubo de centrífuga.

Em seguida, centrifugar o tubo a 300 vezes G durante um minuto. Em seguida, descarte o sobrenadante e repita a lavagem mais duas vezes antes de finalmente adicionar 0,5 mililitros de PBS. Adicione uma solução de três microgramas de fluoresceína marcada com PMA, LA EMA em seis microlitros de PBS ao tubo que contém as esferas revestidas de lectina.

Use fluoresceína marcada com P-M-A-G-A-E-M-A como controle negativo. Em seguida, embrulhe os tubos em papel alumínio e incube-os em temperatura ambiente por uma hora. Centrifugar o tubo durante um minuto e rejeitar o sobrenadante.

Em seguida, suspenda as contas em 1,5 mililitros de PBS fresco e repita a lavagem três vezes. Finalmente, reus suspenda as esferas em 0,2 mililitros de PBS Transfira quatro microlitros das esferas suspensas para um poço de microscópio de imunofluorescência. Deslize e cubra com um disco de lamínula de vidro.

Imagens da lâmina usando um microscópio fluorescente equipado com um filtro FITC de objetiva de 10 x e câmera. Os glicopolímeros foram analisados por cromatografia de permeação em gel. Os polímeros sintetizados sem o uso de jangada têm uma dispersão muito maior do que aqueles feitos com jangada.

Quando marcado com fluoresceína, a aparência física do polímero de glico muda de branco para uma cor amarela forte mostrada sob luz ultravioleta. Uma solução de polímero não marcado permanece escura enquanto o polímero marcado com fluoresceína brilha Verde brilhante, confirmando a presença da ligação específica do rótulo a grânulos revestidos de lectina ocorre apenas com polímeros que carregam resíduos de açúcar pendentes grânulos brilham em verde quando ligados, enquanto permanecem escuros quando tratados com polímeros sem resíduos de açúcar pendente. Esta técnica de polimerização baseada em jangada permite grande flexibilidade no tipo de glicopolímeros que podem ser sintetizados.

A marcação subsequente dos glicopolímeros também pode ser obtida com uma grande variedade de reagentes fluorescentes, capazes de reagir com meios primários em um ambiente aquoso. Pesquisadores no campo da glicobiologia podem usar essa técnica para obter prontamente polímeros de glico altamente versáteis e definidos. Esses glicopolímeros podem ser usados como ferramentas para explorar as especificidades de ligação a carboidratos, como as observadas no trato respiratório de pacientes com fibrose cística ou aqueles envolvidos em muitos tipos de câncer humano.