Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

O objetivo geral deste procedimento é simplificar a leitura de ensaios de gotículas digitais usando um instrumento de PCR convencional em tempo real para medir a fluorescência em massa do ensaio. Isso é feito primeiro preparando reações de amplificação das amostras de interesse, dois padrões e formando gotículas para dividir cada uma em milhares de reatores do tamanho de nanolitros. O segundo passo é incubar as gotículas para amplificar os ácidos nucléicos dentro de cada gota.

Em seguida, a fluorescência em massa de cada amostra ou padrão é medida com um QPC ou termociclador padrão. A etapa final é prever a fração de gotículas fluorescentes nas amostras de interesse usando uma curva padrão gerada a partir das amostras padrão. Para verificar o desempenho deste método, a microscopia fluorescente pode ser usada para avaliar independentemente o desempenho de quantificação do ensaio de fluorescência em massa.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a contagem de gotículas, é que ela não requer instrumentação especializada antes de iniciar este reparo de ensaio. Todos os reagentes necessários, conforme descrito no texto do protocolo, dois padrões são necessários. Um, nenhum controle do molde, tal como a água livre da nuclease e uma concentração alta do molde tal como o lambda, ADN, desnaturam 3,3 microlitros de cada padrão com 3,3 microlitros do tampão da desnaturação no tubo de A-Q-P-C-R.

Incube em temperatura ambiente por três minutos. Resfrie cada um com 3,3 microlitros de tampão de neutralização. Da mesma forma, desnature 3,3 microlitros do modelo de interesse com 3,3 microlitros de tampão de desnaturação incubado em temperatura ambiente por três minutos.

Tempere com 3,3 microlitros de tampão de neutralização. Prepare 11 microlitros de mistura mestre por amostra para menos positivos ou falsos positivos. Exponha a mistura principal à luz UV antes de formar gotículas.

Primeiro, prepare 10 microlitros de mistura pré-misturada por amostra em um tubo transparente de 0,5 mililitro ou 1,5 mililitro no gelo. A mistura de pré-mistura consiste em oligo aleatório, tampão de reação da polimerase B-S-A-D-N-A, DN, NTPs e água livre de nuclease. Coloque o tubo em água sobre gelo e exponha à luz ultravioleta após a exposição aos raios UV.

A-D-S-D-N-A corante de ligação e dieta de referência à mistura de pré-mistura. Adicione a DNA polimerase PHI 29 por último para garantir que a polimerase não encontre níveis de pH muito maiores ou inferiores a 7,5. Misture bem combine 10 microlitros de modelo desnaturado ou padrão e 10 microlitros da mistura mestre misture bem.

Como as gotículas podem ser muito sensíveis à eletricidade estática e ao estresse absoluto, o experimentador deve remover as roupas que podem causar eletricidade estática e se aterrar no lugar antes de formar gotículas. O dispositivo microfluídico usado para esta demonstração foi produzido internamente e possui uma entrada de óleo e duas entradas aquosas com uma junção de foco de fluxo para gerar gotículas. Use duas bombas de seringa para controlar as vazões de 55 microlitros de óleo com surfactante e 20 microlitros de mistura de reação através do chip microfluídico.

Para gerar gotículas de 20.001 nanolitros, uma das etapas mais difíceis é coletar gotículas sem perturbar a emulsão. É importante pipetar lenta e preferencialmente. Use uma ponta de tábua larga.

Colete todas as gotículas em tubos de PCR para cada amostra. Alíquota de 30 microlitros de óleo em tubos de PCR novos com tampas ópticas usando uma ponta de furo largo e pipetando muito lentamente. Transfira 20 microlitros de gotículas para cima do óleo.

Os volumes consistentes garantem que o ensaio seja o mais preciso possível. Feche bem as tampas dos tubos, pois as tampas soltas permitirão que o óleo evapore os tubos de emulsão da parte superior do tubo o mais longe possível da emulsão. Um termociclador PCR, um termociclador A-Q-P-C-R ou uma placa quente podem ser usados para amplificação isotérmica.

O termociclador A-Q-P-C-R é usado nesta demonstração. Incubar as amostras por sete horas a 30 graus Celsius e inativar por um minuto a 75 graus Celsius. Imediatamente após a reação e ativação.

Meça os níveis de fluorescência di para todas as amostras usando o termociclador QPCR. Para cada amostra. Divida a intensidade de fluorescência do corante de ligação ao DNA D DS pela intensidade de fluorescência do corante de referência.

Subtraia a fluorescência de fundo ou a fluorescência normalizada do controle sem modelo de todas as amostras. Crie uma curva padrão linear usando as medições corretivas de fluorescência dos padrões. O padrão de controle sem modelo representa a fluorescência para uma amostra com gotículas de 0% fluorescentes e a alta concentração de molde.

A medição de fluorescência é a fluorescência esperada para uma amostra com gotículas 100% fluorescentes usando a curva padrão correspondente. Preveja as proporções intermediárias de gotículas positivas e negativas com base em sua fluorescência em massa. Este método usa um instrumento convencional de PCR em tempo real para medir a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas.

Gotículas fluorescentes e não fluorescentes foram pré-misturadas em diferentes proporções e foi feita uma comparação entre a fluorescência em massa e a fração de gotas positivas. Como esperado, a fluorescência em massa e as contagens de gotículas positivas escalam linearmente com a fração de entrada de gotículas fluorescentes. As razões previstas com base nos padrões foram comparadas com as frações de entrada fluorescentes esperadas.

A linha indica o valor esperado dado um relacionamento linear. Os resultados mostram um bom desempenho na quantificação da razão de gotículas em dois logs de faixa dinâmica. Para testar este método em um ensaio quantitativo real de amplificação do genoma inteiro, níveis de fluorescência e frações de gotículas positivas de uma gota digital.

Foram medidos ensaios de MDA com concentrações crescentes de DNA Lambda modelo. A linha indica a fração fluorescente esperada usando a distribuição de poissant para modelar os dados do experimento. Imagens fluorescentes representativas das gotículas são mostradas tanto na fração fluorescente quanto na fração positiva da escala digital de amostras MDA, conforme esperado, com o modelo médio por gota, indicando que a leitura em massa pode capturar fielmente o resultado de uma avaliação digital.

Este método pode beneficiar outros ensaios digitais, como PCR digital, acelerando a paralelização e simplificando a leitura do ensaio.