Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

O objetivo geral deste procedimento é simplificar a leitura de ensaios em gotas digitais utilizando um instrumento convencional de PCR em tempo real para medir a fluorescência global do ensaio. Isso é realizado primeiramente preparando reações de amplificação das amostras de interesse, dois padrões e formando gotas para particionar cada uma em milhares de reatores de tamanho nanolitro. O segundo passo é incubação das gotas para amplificar os ácidos nucleicos dentro de cada gota.

Em seguida, a fluorescência em massa de cada amostra ou padrão é medida com um QPC padrão ou termociclador. O passo final é prever a fração de gotículas fluorescentes nas amostras de interesse utilizando uma curva padrão gerada a partir das amostras padrão. Para verificar o desempenho deste método, pode-se usar microscopia fluorescente para avaliar independentemente o desempenho da quantificação no ensaio de fluorescência em massa.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a contagem de gotas, é que ela não exige instrumentação especializada antes de iniciar o reparo deste ensaio. Todos os reagentes necessários, conforme descritos no texto do protocolo, exigem dois padrões. Um controle sem molde, como água livre de nucleases, e uma alta concentração de molde, como DNA lambda. Desnaturar 3,3 microlitros de cada padrão com 3,3 microlitros de tampão de desnaturação em um tubo A-Q-P-C-R.

Incube em temperatura ambiente por três minutos. Pare a reação com 3,3 microlitros de tampão de neutralização. Da mesma forma, desnature 3,3 microlitros do molde de interesse com 3,3 microlitros de tampão de desnaturação incubado em temperatura ambiente por três minutos.

Quenche com 3,3 microlitros de tampão de neutralização. Prepare 11 microlitros da mistura mestra por amostra para reduzir falsos positivos. Exponha a mistura mestra à luz UV antes da formação de gotículas.

Primeiro, prepare 10 microlitros de mistura-pré-pronta por amostra em um tubo transparente de 0,5 mililitro ou 1,5 mililitro sobre gelo. A mistura-pré-pronta consiste em oligo aleatorizado, tampão de reação da polimerase B-S-A-D-N-A, dn, NTPs e água livre de nucleases. Coloque o tubo em água sobre gelo e exponha à luz UV após a exposição à UV.

Adicione o corante ligante de A-D-S-D-N-A e a dieta de referência à mistura pré-pré-misturada. Adicione a DNA polimerase PHI 29 por último para garantir que a polimerase não entre em contato com níveis de pH muito superiores ou inferiores a 7,5. Misture bem e combine 10 microlitros do molde desnaturado ou padrão com 10 microlitros da mistura mestra; misture bem.

Como as gotículas podem ser muito sensíveis à eletricidade estática e ao esforço de cisalhamento, o pesquisador deve remover roupas que possam gerar eletricidade estática e aterrar-se no local antes de formar as gotículas. O dispositivo microfluídico utilizado nesta demonstração foi produzido internamente e possui uma entrada para óleo e duas entradas aquosas com uma junção de foco de fluxo para a geração de gotículas. Utilize duas bombas de seringa para controlar as taxas de fluxo de 55 microlitros de óleo com surfactante e 20 microlitros de mistura de reação através do chip microfluídico.

Para gerar 20.001 gotas de nanolitros, um dos passos mais difíceis é coletar as gotas sem perturbar a emulsão. É importante pipetar lentamente e, preferencialmente, usar uma ponteira de diâmetro largo.

Coletar todas as gotas em tubos de PCR para cada amostra. Aliquotar 30 microlitros de óleo em tubos de PCR novos com tampas ópticas utilizando uma ponteira de grande diâmetro e pipetando muito lentamente. Transferir 20 microlitros de gotas para cima do óleo.

Os volumes consistentes garantem que o ensaio seja o mais preciso possível. Feche as tampas dos tubos firmemente, pois tampas soltas permitirão a evaporação do óleo; manipule os tubos de emulsão pela parte superior do tubo, o mais distante possível da emulsão. Um termociclador PCR, um termociclador A-Q-P-C-R ou uma placa aquecedora podem ser usados para amplificação isotérmica.

Um termociclador A-Q-P-C-R é usado nesta demonstração. Incube as amostras por sete horas a 30 graus Celsius e inative por um minuto a 75 graus Celsius. Imediatamente após a reação e ativação.

Meça os níveis de fluorescência para todas as amostras utilizando o termociclador QPCR. Para cada amostra, divida a intensidade de fluorescência do corante fluorescente específico para DNA de dupla fita pela intensidade de fluorescência do corante de referência.

Subtraia a fluorescência de fundo ou a fluorescência normalizada do controle sem molde de todos os amostras. Crie uma curva padrão linear utilizando as medidas corrigidas de fluorescência dos padrões. O padrão de controle sem molde representa a fluorescência de uma amostra com 0% de gotículas fluorescentes e alta concentração de molde.

A medição de fluorescência corresponde à fluorescência esperada para uma amostra com 100% de gotículas fluorescentes, utilizando a curva-padrão correspondente. Preveja as proporções intermediárias de gotículas positivas e negativas com base em sua fluorescência global. Este método utiliza um instrumento convencional de PCR em tempo real para medir a fluorescência global de ensaios digitais baseados em gotículas.

Gotículas fluorescentes e não fluorescentes foram pré-misturadas em diferentes proporções, e foi feita uma comparação entre a fluorescência em massa e a fração de gotículas positivas. Como esperado, a fluorescência em massa e as contagens de gotículas positivas aumentam linearmente com a fração de entrada de gotículas fluorescentes. As proporções previstas com base em padrões foram comparadas às frações de entrada fluorescente esperadas.

A linha indica o valor esperado dada uma relação linear. Os resultados demonstram bom desempenho na quantificação da proporção de gotículas ao longo de duas décadas de faixa dinâmica. Para testar este método em um ensaio real de amplificação do genoma inteiro quantitativo, níveis de fluorescência e frações de gotículas positivas de uma gotícula digital.

O ensaio de MDA com concentrações crescentes de DNA molde Lambda foi medido. A linha indica a fração fluorescente esperada utilizando a distribuição de Poisson para modelar os dados do experimento. Imagens fluorescentes representativas das gotículas são mostradas, tanto a fluorescência em massa quanto a fração de gotículas positivas a partir das amostras digitais de MDA, que variam conforme o esperado com o número médio de molde por gotícula, indicando que a leitura em massa pode capturar fielmente o resultado de um ensaio digital.

Este método pode beneficiar outros ensaios digitais, como a PCR digital, acelerando a paralelização e simplificando a leitura do ensaio.