Name: Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a preparar monólitos poliméricos macroporosos revestidos com polímeros de coordenação microporosos para extração seletiva de fosfopeptídeos. Este método avançado utiliza cromatografia de afinidade por íons metálicos.

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Este trabalho foi realizado na Fundição Molecular, Laboratório Nacional Lawrence Berkeley e apoiado pelo Escritório de Ciência, Escritório de Ciências Básicas de Energia, Divisão de Instalações de Usuários Científicos do Departamento de Energia dos EUA, sob o Contrato No. DE-AC02–05CH11231. O apoio financeiro de FM por uma bolsa ME-Fulbright e AS pela Comissão de Ensino Superior do Paquistão é reconhecido com gratidão.

NOTA: Antes de começar, verifique todas as fichas de dados de materiais relevantes (MSDSs). Muitos dos produtos químicos usados ​​nos procedimentos de síntese e de aplicação são tóxicos. Por favor, siga todas as práticas de segurança apropriadas e utilizar equipamentos adequados de proteção (jaleco, calças compridas, sapatos fechados, óculos de segurança, luvas). Por favor, use todos os equipamentos de protecção individual criogênico ao manusear nitrogênio líquido para as medições de adsorção de nitrogênio (luvas isolantes, protetor facial). 1. Porous Polymer Monolith Preparação em massa e Capilar formato de coluna <ol><li> Massa de polímero Monolith para Caracterização <ol><li> Purifica-se o estireno, divinilbenzeno e ácido metacrílico através de uma coluna de alumina básica, de modo a remover os inibidores de polimerização. Colocar 10 g de alumina básica em 25 ml de uma seringa de plástico descartável com um tampão de lã de vidro embalado na ponta da seringa. Fazer passar cerca de 10 ml do monómero através da coluna. </li><li> Carregar os monómeros de estireno (50 mg, 100 mg de divinilbenzeno e 50 mg de ácido metacrílico) e os agentes de formação de poros (300 mg de tolueno e 300 mg de isooctano) em um frasco de vidro de 1 ml. Adicionar o iniciador da polimerização, 4 mg de 2,2&#39;-azobisisobutironitrilo (AIBN, 1% em relação aos monómeros). </li><li> Homogeneizar a mistura por ultra-sons durante 10 min. Remover o oxigénio dissolvido por borbulhamento de azoto através do líquido durante 10 min. Fecha-se o frasco com tampa de película de parafina e colocá-lo num banho de água a 60 ° C durante 6 horas para polimerizar a mistura. </li><li> Arrefecer à temperatura ambiente e quebrar o frasco cuidadosamente. Transferir o monólito de polímero em um cartucho de extracção de celulose. Colocar o dedal de extracção para uma câmara de extracção de Soxhlet e montá-lo para um balão de fundo redondo que contém um volume de metanol, que é pelo menos três vezes o volume da câmara de extracção. Montar um condensador para a parte superior da câmara de extracção. Realizar a extração Soxhlet fervendo o metanoldurante 16 h, assegurando a completa remoção dos monómeros que não reagiram e agentes de formação de poro. </li><li> Secar durante a noite numa estufa de vácuo a 60 ° C. Confirmar a presença de grupos funcionais carboxílicos para anexar o PCP por Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Medir a área de superfície por adsorção de porosimetria de azoto. </li></ol></li><li> Funcionalização da sílica Capilares para a preparação de colunas monolíticas <ol><li> Corte de 2 m de uma ID de 100 uM capilar de sílica fundida revestido com poliimida. Ligue-o a uma seringa de vidro de 0,25-0,50 ml e lava-se o capilar com acetona. Remover a acetona por lavagem da coluna capilar com água. </li><li> A fim de activar o revestimento de sílica interno do capilar, utilizar uma bomba de seringa a fluir uma solução aquosa de NaOH 0,2 M em 0,25 mL / min durante 30 min. Lavar com água até o efluente estar neutro. </li><li> Use tiras de papel de pH para verificar efluente pH. Em ordem para protonar os grupos silanol do capilar, uma bomba aqueo 0,2 Msolução de HCl-nos através do capilar em 0,25 mL / min durante 30 min. Lavar com água até o efluente estar neutro. Enxágüe com etanol. </li><li> Bombear a 20% (w / w) de uma solução de etanol 3- (trimetoxisilil) metacrilato de propilo (pH 5 ajustado com ácido acético) a 0,25 mL / min durante 1 hora. Neste passo, o capilar de sílica funcionalizado com grupos de vinil, a fim de fixar o monólito de polímero para a superfície interior dos capilares. </li><li> Lavar com acetona e seco numa corrente de azoto e deixar à temperatura ambiente durante a noite antes da utilização. Corte o capilar em pedaços mais curtos de comprimento 20 cm. </li></ol></li><li> Preparação das colunas capilares Monolithic <ol><li> Prepara-se uma mistura de polimerização idêntico para o monólito de polímero a granel (secção 1.1), num frasco de vidro de 1 ml com um septo de borracha. Adicionar iniciador AIBN 1% em relação aos monómeros. Homogeneizar a mistura por ultra-sons durante 10 min. </li><li> Purgar a mistura com azoto polimerização por acoplamento de um capilar de sílica não-funcionalizadoa um fluxo de azoto. <ol><li> Inserir o capilar corrente de azoto, através do septo de borracha do frasco e mergulhá-lo na mistura de polimerização, de modo que o azoto bolhas através do líquido. Deixe a tampa do frasco levemente solto para evitar excesso de pressão. Purgar para 10 min. </li><li> Levantar o capilar corrente de azoto a partir da mistura de polimerização para o espaço superior do frasco, e fechar firmemente a tampa. Inserir um capilar funcionalizada através do septo para dentro da mistura de polimerização. O excesso de pressão gerada no capilar através do azoto injectado na câmara de expansão bombeia a mistura de polimerização através do capilar funcionalizado. </li><li> Recolha algumas gotas de mistura de polimerização a partir do efluente do capilar para assegurar que ele está completamente cheio e fechá-lo com um septo de borracha. Aqui o capilar para fora do frasco com muito cuidado e fechar a entrada do tubo capilar com um septo de borracha. </li></ol></li><li> Polimerizar o mixtura contido no capilar em um banho de água a 60 ° C durante 6 h. Arrefecer à temperatura ambiente e corte de alguns milímetros de ambas as extremidades do capilar. Remover os monómeros não reagidos e agentes de formação de poros através de lavagem da coluna com acetonitrilo utilizando uma bomba de HPLC em 3 mL / min durante 30 min. Verifique contrapressão da coluna capilar. </li></ol></li></ol> 2. Crescimento da Ferro-benzenetrycarboxylate (FeBTC) PCP <ol><li> Crescimento do FeBTC MOPH em um polímero Monolith massa para Caracterização <ol><li> Moer o monólito previamente seca utilizando um almofariz e pilão. </li><li> Imergir 100 mg do pó monólito em 5 ml de 2 mM de FeCl 3 .6H 2 O em etanol durante 15 min. Filtro de vácuo utilizando um filtro de nylon (0,22 um) e lava-se o pó com etanol. Mergulha-se o pó monólito em 5 ml de mM de ácido benzeno- 1,3,5-2 (BTC) em etanol durante 15 min. Filtro de vácuo utilizando um filtro de nylon (0,22 um) e lava-se o pó com etanol.</li><li> Repita o passo número 2 como desejar. O crescimento do revestimento orgânico-metálico final será definido pelo número de ciclos aplicados. Normalmente, entre 10 e 30 ciclos são realizados. Confirmar a presença de novos poros por porosimetria de adsorção de azoto. Medir a quantidade de locais adicionais de metal por análise termogravimétrica (TGA). </li></ol></li><li> Crescimento do FeBTC MOPH numa coluna capilar monolítico para o enriquecimento de fosfopéptidos <ol><li> Utilizando uma bomba de seringa. Lavar o monólito capilar com 2 mM de FeCl 3 .6H 2 O em etanol durante 15 minutos a 2 uL / min. Lava-se com etanol durante 15 minutos a 2 uL / ​​min. Lavar o monólito capilar com uma BTC 2 mM em etanol durante 15 minutos a 2 uL / ​​min. Lava-se com etanol durante 15 minutos a 2 uL / ​​min. </li><li> Repita o passo 1 se o desejar. O crescimento do revestimento orgânico-metálico final será definido pelo número de ciclos realizados. </li></ol></li></ol> 3. Proteína A digestão e Enrichment de Fosfopeptídeos <ol><li> A digestão de proteínas <ol><li> Dissolve-se 0,5 ml de leite não gordo em 1 ml de água e dividi-lo em fracções de 200 uL. </li><li> Para a digestão de proteínas adicionar 160 ul de 1 M de bicarbonato de amónio e 50 ul de 45 mM de ditiotreitol a cada fracção, a fim de clivar as ligações dissulfureto. Incubar a 50 ° C num Thermomixer durante 15 min. </li><li> Adicionar gradualmente 50 mL de uma solução aquosa de iodoacetamida 100 mM, enquanto que a solução foi arrefecida até à temperatura ambiente. Iodoacetamida irá evitar a formação de novas ligações dissulfureto. </li><li> Incubar no escuro durante 15 min à temperatura ambiente. Adicionar 1 ml de água desionizada. Adicionar 2 mg de tripsina e digerir proteínas num termomisturador a 37 ° C durante 14 h. </li><li> Terminar a digestão por acidificação com 10 ul de ácido trifluoroacético a 1% e colocando-o no termomisturador durante 5 min à temperatura ambiente. Armazenar as proteínas digeridas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Enriquecimento de fosfopéptidos usando uma coluna capilar MOPH. <ol><li> Lavar a coluna com 100 mL de uma mistura 4: 1 de acetonitrilo contendo um ácido trif luoroacético a 0,1% durante 10 min a um caudal de 1 mL / min. Bombear a digestão da proteína através da coluna a 2 mL / min durante 30 min. </li><li> Lavar os peptídeos não fosforilados novamente com uma mistura 4: 1 de acetonitrilo contendo um ácido trif luoroacético a 0,1% durante 10 min a um caudal de 1 mL / min. Lava-se com água durante 10 min a um caudal de 1 mL / min. </li><li> Fosfopéptidos eluir usando uma solução tampão de pH 7 fosfato 250 mM bombeada a 1 mL / min durante 15 min. Recolhe-se o eluente num frasco e dessalinizar a solução utilizando um protocolo padrão de 19. Preparar um ácido / ml 2,5-di-hidroxibenzóico 2 mg a usá-lo como a matriz para a espectrometria de massa de laser assistida por matriz dessorção / ionização de tempo-de-voo (MALDI-TOF-MS). Tirado 2 ul de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico em ponta para eluir o phosphopeptides e identificá-los diretamente sobre a placa MALDI. </li><li> Analisar as manchas por MALDI-TOF-MS e regenerar a coluna por lavagem com água e em seguida com metanol. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O monólito de polímero original contém grupos funcionais carboxílicos capazes de ligar-se a metais. Coordenando os locais de metal iniciais sobre o material original, somos capazes de crescer um revestimento PCP (Figura 1A), que incorpora uma série de sites de metal adicionais moldando uma rede microporosa. Isso faz com que os materiais apresentados MOPH atraentes para os procedimentos de extracção ou purificação, onde estão envolvidas as espécies metálicas, tais como a técnica de cromatografia de afini...

Polímeros de coordenação poroso (PCPS) são compostos de coordenação com base em centros metálicos ligados por ligantes orgânicos com repetição de entidades de coordenação que se estende em uma, duas ou três dimensões, que pode ser amorfa ou cristalina 1-3. Nos últimos anos, esta classe de materiais porosos tem atraído a atenção geral devido à sua elevada porosidade, de largura tunability química, e a sua estabilidade. PCP têm sido explorados para uma gama de aplicações incluindo a armazenagem de gás, a separação de gás, e catálise 3-6 e, muito recentemente, as primeiras aplicações analíticas de PCP têm sido descritos 7. Por causa de sua funcionalidade química e alta porosidade PCP avançados têm sido alvo de seu enorme potencial para a melhoria dos processos de purificação e separações cromatográficas, e uma série de relatórios sobre este assunto têm sido publicados 7-13. No entanto, o desempenho de PCP não está neste momento a um equivalenível nt com materiais cromatográficos existentes provavelmente devido à rápida difusão através de grandes espaços vazios interpartículas em camadas preenchidas com estes sólidos devido às suas morfologias tipicamente de forma irregular de suas partículas ou cristais. Esta embalagem irregularmente distribuída leva a um desempenho inferior ao esperado, assim como contrapressões alta coluna e indesejáveis ​​morfologias formato de pico 14,15. A fim de resolver o problema da rápida difusão através dos espaços vazios entre partículas e concomitantemente aumentar o desempenho de PCP para aplicações analíticas, o desenvolvimento de um material híbrido baseado em um monólito de polímero macroporoso 16 que contém o PCP na superfície dos macroporos seria ser desejável. Monólitos de polímero são auto-suficientes, materiais de peça única que possam sustentar fluxo convectivo através de seus poros, o que os torna uma das alternativas mais eficientes para talão de embalagens e têm sido comercializados com sucesso por vários c<html> ompanies 17,18. Monólitos polímero poroso são geralmente baseados na polimerização de um monómero e um agente de reticulação na presença de porogénios, que são tipicamente misturas binárias de solventes orgânicos. Os materiais monolíticos obtidos têm uma estrutura microglobular e uma porosidade elevada e permeabilidade ao fluxo. Uma abordagem simples para unificar destes materiais para preparar um monólito de polímero contendo um PCP baseia-se na adição directa de PCP tal como sintetizada na mistura de polimerização do monólito. Esta abordagem resultou em PCPs principalmente enterrado dentro de um andaime do polímero, e não estar ativo para a continuação da aplicação do material final 14,15. Uma abordagem sintética diferente é claramente necessário, a fim de, por exemplo, desenvolver filmes uniformes de PCP, ou estruturas de metal-orgânicos cristalinos (MOF) onde a maioria dos poros contidos no interior do cristal são acessíveis a partir dos macroporos do monólito de polímero. t &quot;&gt; Aqui relatamos um protocolo simples para a preparação de um material híbrido de polímero orgânico-metálico (MOPH) com base num suporte de polímero macroporosas com grupos funcionais adequados para a ligação do PCP, que podem ser facilmente implementados como um auto-contido única monólito de polímero -Peça num formato de coluna com propriedades óptimas para aplicações de escoamento. O procedimento de síntese do polímero é seguida por uma solução com base em temperatura ambiente simples &#160; método para crescer um revestimento PCP sobre a superfície interna dos poros do monólito 19-20. Como primeiro exemplo, descreve-se a preparação de uma película de polímero de coordenação de ferro (III) benzenotricarboxilato (FeBTC) dentro de um poli macroporosa (estireno-ácido metacrílico-divinilbenzeno) monólito. Este método é eficaz para a preparação de pós a granel, bem como a coluna capilar e o protocolo descrito é facilmente exequível a outros PCP. Como um exemplo do potencial de MOPHs como materiais funcionais para o fluxo atra-aplicações gh, aplicou-se o desenvolvido FeBTC MOPH que contém um revestimento denso de Fe (III) para enriquecer fosf centros de misturas de proteínas digeridas que exploram a afinidade de ligação de fosfopéptidos a Fe (III). O protocolo desenvolvido 21 compreende três partes principais: Preparação do suporte macroporous monólito de polímero orgânico; crescimento do revestimento PCP sobre a superfície dos poros do monolito; aplicação para o enriquecimento de fosfopeptídeos.

<table><tbody><tr><td>Capilares revestidos com poliimida</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>100 &mu; m i.d.</td></tr><tr><td>3-(trimetoxissilil) propil metacrilato, 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td></td></tr><tr><td>estireno, 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>W323306</td><td></td></tr><tr><td>Divinilbenzeno de grau técnico, 80%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>414565</td><td></td></tr><tr><td>ácido metacrílico, 98%</td> <td>Mallinckrodt</td><td>MK150659</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno, etc; 99,5%</td> <td>EMD produtos químicos</td><td>MTX0735-6</td><td></td></tr><tr><td>Isooctano, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>650439</td><td></td></tr><tr><td>2,2 '-azobisisobutironitrila, 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>441090</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de alumínio (alumina básica)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado, 97%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>ácido 1,3,5-benzenotricarboxílico, 95%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>482749</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>360457</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de amônio, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético, &ge; 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, &ge; 99,8%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida, &ge; 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol, &ge; 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico di-hidratado, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico di-hidratado, &ge; 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico, &ge; 85%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>438081</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2,5-dihidroxibenzóico, &ge; 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>85707</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>Pâncreas</td></tr><tr><td>&beta; -caseína</td><td>bovina Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td>Leite bovino</td></tr><tr><td>ZipTip ponteiras de pipeta</td><td>Merck Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td>resina C18</td></tr></tbody></table>

preparação de altamente poroso coordenação polymer revestimentos em macroporosas polymer monólitos para o enriquecimento avançado de fosfopeptídeos

Preparation of Highly Porous Coordination Polymer Coatings on Macroporous Polymer Monoliths for Enhanced Enrichment of Phosphopeptides

Descrevemos um protocolo para a preparação de materiais híbridos baseados em revestimentos poliméricos de coordenação altamente porosos na superfície interna de monólitos poliméricos macroporosos. A abordagem desenvolvida é baseada na preparação de um polímero macroporoso contendo grupos funcionais de ácido carboxílico e no subsequente crescimento controlado baseado em solução passo a passo de uma camada de um polímero de coordenação porosa na superfície dos poros do monólito polimérico. O híbrido de polímero metal-orgânico preparado tem uma alta área de superfície específica de microporos. A quantidade de sítios de ferro (III) é aumentada por meio da coordenação metal-orgânica na superfície dos poros do suporte funcional do polímero. O aumento de sites metálicos está relacionado ao número de iterações do processo de revestimento.
O esquema de preparação desenvolvido é facilmente adaptado a um formato de coluna capilar. O polímero poroso funcional é preparado como um monólito poroso autônomo de bloco único dentro do capilar, produzindo um dispositivo de separação de fluxo contínuo com excelente permeabilidade de fluxo e contrapressão modesta. A coluna híbrida de polímero metal-orgânico apresentou excelente desempenho para o enriquecimento de fosfopeptídeos a partir de proteínas digeridas e sua posterior detecção usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz. O protocolo experimental apresentado é altamente versátil e pode ser facilmente implementado em diferentes suportes e revestimentos de polímeros orgânicos com uma infinidade de polímeros de coordenação porosa e estruturas metal-orgânicas para múltiplas aplicações de purificação e/ou separação.

Uma ilustração esquemática do crescimento PCP sobre a superfície dos poros do monólito de polímero orgânico é mostrado na Figura 1. Nesta figura, ilustra-se o inicial de Fe (III) átomos retido sobre a superfície dos poros do monólito de polímero original é coordenado com grupos funcionais carboxílicos . Utilizando o protocolo descrito aqui ligando orgânico adicional e iões Fe (III) são adicionados à superfície, formação de uma rede de coordenação porosa dentro do monólito de polímero. A Figura 1...

Um procedimento para a preparação de meios de separação híbridos porosos compostos por um monólito de polímero macroporoso revestido internamente por um polímero de coordenação microporosa de alta área superficial é apresentado.

Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos

We describe a protocol for the preparation of hybrid materials based on highly porous coordination polymer coatings on the internal surface of macroporous ...

O objetivo geral do experimento a seguir é preparar um novo material de suporte com desempenho aprimorado na extração seletiva de peptídeos fosforilados. Isso é alcançado pela adequada preparação de um monólito macroporoso de polímero com grupos funcionais apropriados. Primeiramente, uma espécie metálica é imobilizada nos grupos funcionais de um monólito polimérico, tornando o suporte seletivo para a extração de peptídeos fosforilados.O próximo crescimento passo a passo de múltiplas camadas do estrutura metaloorgânica é realizado com o objetivo de aumentar a quantidade de sítios metálicos, aumentando assim a seletividade para fosfopeptídeos. Os resultados mostram uma seletividade aprimorada para a extração de fosfopeptídeos de digestões proteicas com base na espectrometria de massas por dessorção e ionização a laser assistida por matriz e tempo de voo. O enriquecimento de peptídeos fosforilados é geralmente realizado por cromatografia de afinidade com íons metálicos, que é realizada em partículas de sílica convencionais ou partículas poliméricas, as quais são empacotadas em uma coluna cromatográfica.O nosso material combina as vantagens de um monólito polimérico macroporoso, que possui boas propriedades de transporte de massa, com a alta capacidade de ligação de uma estrutura organometálica. Conseguimos isso ao crescer sequencialmente a estrutura organometálica a partir da superfície do monólito, de modo que, ao final, tenhamos múltiplas camadas de linhas metálicas disponíveis para interagir com o analito. A demonstração visual da preparação do monólito polimérico e do crescimento da estrutura organometálica é importante, pois ambos são muito difíceis de aprender. Existem várias etapas importantes às quais se deve prestar atenção para obter um monólito com boas propriedades superficiais e porosidade.Para começar, corte dois metros de uma capilar de sílica fundida revestida com poliamida e com diâmetro interno de 100 microns conectada a uma seringa de vidro de 25 mililitros e lave a capilar com acetona. Em seguida, remova a acetona lavando a capilar com água. A seguir, coloque uma seringa de vidro de 250 microlitros cheia com hidróxido de sódio aquoso 0,2 molar na bomba de seringa e faça a solução fluir a 0,25 microlitros por minuto através da capilar durante 30 minutos, a fim de ativar o revestimento interno de sílica.Após 30 minutos, enxágue o capilar com água até que o efluente esteja neutro. Utilize tiras de papel pH para verificar o fluxo com pH neutro. Em seguida, carregue a seringa com ácido clorídrico aquoso 0,2 molar e bombeie a solução através do capilar a uma taxa de 25 microlitros por minuto para protonar os grupos ciol; após 30 minutos de fluxo, enxágue novamente o capilar com água até que o fluxo esteja neutro.Uma vez que o pH esteja neutro, enxágue os capilares com uma seringa de 250 microlitros preenchida com etanol a 100%. Em seguida, bombeie uma solução a 20% de trimetil propil metacrilato em etanol a uma taxa de 25 microlitros por minuto durante uma hora para funcionalizar a superfície com grupos vinila. A seguir, enxágue os capilares com acetona e depois seque-os com um fluxo de nitrogênio.Deixe as amostras repousarem à temperatura ambiente durante a noite e, em seguida, corte-as em seções de 20 centímetros de comprimento. Prepare a mistura de polimerização em um vial de vidro de um mililitro com septo de borracha conforme descrito no protocolo de texto complementar. Adicione 1% de AIBN em relação aos monômeros como iniciador e sonique a mistura por 10 minutos.Em seguida, conecte um capilar de sílica não funcionalizado a uma corrente de nitrogênio e insira-o através do septo de borracha até a mistura de polimerização. Afrouxe levemente a tampa do vial e borbulhe nitrogênio lentamente pela mistura durante 10 minutos. Após 10 minutos, levante o capilar da corrente de nitrogênio da mistura de polimerização até o espaço sobrenadante do vial e feche a tampa firmemente.Insira uma das capilares funcionalizadas através da tampa de borracha até a mistura de polimerização. Utilize o excesso de pressão gerado pelo nitrogênio para bombear a mistura de polimerização para dentro da capilar funcionalizada. Deixe escorrer várias gotas da mistura de polimerização pela saída da capilar para garantir que ela esteja completamente preenchida e, em seguida, feche-a com uma tampa de borracha.Retire o capilar do frasco com muito cuidado e feche a entrada com um septo de borracha. Coloque a mistura contida no capilar em um banho-maria aquecido a 60 graus Celsius por seis horas para polimerizar. Após a conclusão, resfrie o capilar até a temperatura ambiente e, em seguida, corte alguns milímetros de ambas as extremidades do capilar. Em seguida, utilize uma bomba de CLAE para lavar a coluna com acetonitrila a quatro microlitros por minuto durante 30 minutos.Isso removerá quaisquer monômeros não reativos e agentes formadores inadequados. Verifique a pressão de retorno da coluna capilar. Em seguida, lave o monólito capilar em ciclos com os reagentes mostrados aqui para crescer o revestimento final de metal orgânico.A espessura do revestimento é determinada pelo número de ciclos realizados. Lave as capilares com o revestimento organometálico preparado utilizando 100 microlitros de uma mistura na proporção de quatro para um de acetonida trial e ácido tricloroacético aquoso 0,1%. Em seguida, empurre um digesto proteico através da coluna a dois microlitros por minuto.Por 30 minutos, lave novamente os peptídeos não fosforilados com uma mistura na proporção de quatro para um de acetonitrila e ácido trifluoroacético aquoso 0,1% durante 10 minutos a uma vazão de um microlitro por minuto. Lave com água por 10 minutos a uma vazão de um microlitro por minuto. Elua os peptídeos fosforilados utilizando uma solução tampão de fosfato 250 micromolar com pH 7, bombeando-a através da capilar a um fluxo de um microlitro por minuto durante 15 minutos, colete o eluato em um frasco e dessaline a solução usando um protocolo padrão.Em seguida, prepare uma solução de dois miligramas por mililitro de ácido dois cinco diidroxibenzóico em metanol e misture dois microlitros dessa solução com dois microlitros da solução de fosfopéptido mencionada. Em uma ponta de pipeta, aplique esta mistura diretamente na placa de ionização por dessorção a laser assistida por matriz, e deixe o ponto secar completamente. Analise os pontos por espectrometria de massas com ionização por dessorção a laser assistida por matriz e tempo de voo; finalmente, regenere a coluna lavando-a completamente com água, seguido de metanol em capilares modificados com múltiplas camadas de ferro disponível.Três grupos são ideais para uso na cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados; aqui são mostrados espectros obtidos de proteínas digeridas antes e após o enriquecimento, demonstrando notável seletividade para 12 diferentes peptídeos fosforilados. Experimentos representativos de caracterização fornecem informações valiosas sobre o surgimento de novas porosidades. Esta é uma imagem de um monólito em pó em grande escala após 30 ciclos de polímero coordenado poroso, conhecidos como ciclos PCP, obtida por microscopia eletrônica de varredura.Após 30 ciclos de PCP, verificou-se que o tamanho das larguras dos poros no material era inferior a três nanômetros de diâmetro em comparação com o polímero em massa. O material híbrido apresenta uma grande quantidade de área incremental com poros pequenos. Isso leva a um aumento na absorção de nitrogênio em uma faixa de pressões utilizando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier.A incorporação inicial dos grupos funcionais carboxílicos foi visível, bem como o crescimento do revestimento após 10, 20 e 30 ciclos de PCP. Por fim, a análise termogravimétrica foi utilizada para medir a quantidade de sítios metálicos adicionais que se acumularam a cada ciclo. É mostrada aqui a análise gravimétrica em uma faixa de temperaturas, que confirma a presença de um número aumentado de sítios metálicos com o aumento do número de ciclos.Após seguir este protocolo, pode-se desenvolver um procedimento semelhante para diferentes centros metálicos em ligantes orgânicos, com o objetivo de obter separações eficientes de analitos distintos com base em sua afinidade por uma estrutura específica. Acredito que materiais compostos como o nosso, que combinam polímeros macrosculares com estruturas organometálicas, apresentam grande potencial no campo da ciência da separação, pois podem melhorar significativamente a seletividade, a capacidade de ligação e a eficiência geral das separações, tanto em escala analítica quanto preparativa.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Usámos plasma melhorada deposição de vapor químico para depositar películas finas que variam de um nm poucos a vários 100 nm sobre nano-partículas de vários materiais. Nós subsequentemente etch o material do núcleo para produzir nanoshells ocos cuja permeabilidade é controlado pela espessura da casca. Nós caracterizar a permeabilidade destes revestimentos para solutos pequenas e demonstram que estas barreiras podem proporcionar uma libertação sustentada do material do núcleo durante vários dias.

Encapsulamento e Permeabilidade características das partículas de plasma polimerizados ocas

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Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos

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