Preparação de altamente poroso Coordenação Polymer Revestimentos em macroporosas Polymer Monólitos para o enriquecimento avançado de Fosfopeptídeos

O objetivo geral do experimento a seguir é preparar um novo material de suporte com melhor desempenho na extração seletiva de peptídeos fosfo. Isso é conseguido pela preparação adequada de um monólito capilar de polímero poroso com grupos funcionais adequados. Primeiro, uma espécie metálica é imobilizada nos grupos funcionais de um monólito polimérico, tornando o suporte seletivo para a extração de peptídeos fosfo.

Em seguida, o crescimento passo a passo de várias camadas da estrutura orgânica metálica é realizado para aumentar a quantidade de sítios metálicos, aumentando assim a seletividade para fosfopeptídeos. Os resultados mostram melhor seletividade para a extração de peptídeos fosfofólicos de digestos de proteínas com base em ionização por dessorção a laser assistida por matriz, espectrometria de massas por tempo de voo. O enriquecimento do peptídeo O geralmente é feito por cromatografia de afinidade de leão metálico, que é realizada em partículas de sílica convencionais ou partículas de polímero, que são embaladas em uma coluna cromatográfica.

Nosso material combina as vantagens de um monólito de polímero macroporoso, que possui boas propriedades de transporte de massa com a alta capacidade de ligação de uma estrutura orgânica metálica. A maneira como conseguimos isso é cultivando sequencialmente a estrutura orgânica metálica a partir da superfície do monólito, de modo que, no final, tenhamos várias camadas de linhas metálicas disponíveis para interagir com o analito A demonstração visual da preparação do monólito de polímero e o crescimento da estrutura orgânica metálica são importantes porque são muito difíceis de aprender. Existem várias etapas importantes às quais é preciso prestar atenção para obter um monólito com boas propriedades de superfície e porosidade.

Para começar, corte dois metros de um capilar de sílica fundida que é revestido de poliamida e tem um diâmetro interno de 100 mícrons conectado a uma seringa de vidro de 25 mililitros e lave o capilar com acetona. Em seguida, remova a acetona enxaguando o capilar com água. Em seguida, coloque uma seringa de vidro de 250 microlitros cheia de hidróxido de sódio aquoso de 0,2 molar na bomba da seringa e flua a solução no ponto 25 microlitros por minuto através do capilar por 30 minutos para ativar o revestimento interno de sílica

Após 30 minutos, enxágue o capilar com água até que o efluente fique neutro. Use tiras de pH de papel para verificar o fluxo de pH neutro. Em seguida, carregue a seringa com cloreto de hidrogênio aquoso 0,2 molar e bombeie a solução através do capilar no ponto 25 microlitros por minuto para protonar os grupos ciol após 30 minutos de fluxo, novamente, enxágue o capilar com água até que o fluxo seja neutro.

Quando o pH estiver neutro, enxágue os capilares com uma seringa de 250 microlitros cheia de etanol a 100%. Em seguida, bombeie uma solução a 20% de três metacrilato de trimetilpropila em etanol a 25 microlitros por minuto por uma hora para funcionalizar a superfície com grupos vinílicos. Em seguida, enxágue os capilares com acetona e seque-os com um jato de nitrogênio.

Deixe as amostras descansarem em temperatura ambiente durante a noite e, em seguida, corte-as em seções de 20 centímetros de comprimento. Prepare a mistura de polimerização em um frasco de vidro de um mililitro com um septo de borracha, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Adicionar 1%A IBN em relação aos monómeros como iniciador e sonicar a mistura durante 10 minutos.

Em seguida, anexe um capilar de sílica não funcionalizado a um fluxo de nitrogênio e insira-o através do septo de borracha na mistura de polimerização. Afrouxe ligeiramente a tampa do frasco e borbulhe lentamente nitrogênio através da mistura por 10 minutos. Após 10 minutos, levante o capilar do fluxo de nitrogênio da mistura de polimerização para o espaço livre do frasco e feche bem a tampa.

Insira um dos capilares funcionalizados através do septo na mistura de polimerização. Use o excesso de pressão gerado pelo nitrogênio para bombear a mistura de polimerização para o capilar funcionalizado. Deixe várias gotas da mistura de polimerização fluírem do efluente do capilar para garantir que ele esteja completamente preenchido e, em seguida, feche-o com um septo de borracha.

Retire o capilar do frasco com muito cuidado e feche a entrada com um septo de borracha, coloque uma mistura contida no capilar em banho-maria aquecido a 60 graus Celsius por seis horas para polimerizar. Quando terminar, resfrie o capilar à temperatura ambiente e corte alguns milímetros de ambas as extremidades do capilar. Em seguida, use uma bomba de HPLC para lavar a coluna com acetonitrila a quatro microlitros por minuto por 30 minutos.

Isso removerá quaisquer monômeros não reativos e agentes de formação inadequados. Verifique a contrapressão da coluna capilar. Em seguida, lave o monólito capilar em ciclos com os reagentes mostrados aqui para aumentar o revestimento orgânico metálico final.

A espessura do revestimento é determinada pelo número de ciclos realizados. Lave os capilares com o revestimento orgânico metálico preparado usando 100 microlitros de uma mistura quatro para um de teste de acetonido e ácido trioracético aquoso a 0,1%. Em seguida, bombeie um digestor de proteína através da coluna a dois microlitros por minuto.

Por 30 minutos, lave os peptídeos não fosforilados novamente com uma mistura de quatro para um teste de acetil NI e ácido tricílico Trifluor aquoso a 0,1% por 10 minutos a uma taxa de fluxo de um microlitro por minuto. Lave com água por 10 minutos a uma vazão de um microlitro por minuto. Eluir os peptídeos fosfográficos usando uma solução tampão fosfato 250 micromolar a pH sete, bombeando-o através do capilar a um microlitro por minuto por 15 minutos, coletar o ellu em um frasco e dessalinizar a solução usando um protocolo padrão.

Em seguida, prepare uma solução de dois miligramas por mililitro de dois cinco ácidos di-hidroxibenzóicos em metanol e misture dois microlitros dessa solução com dois microlitros da solução de fosfopeptídeo aludida. Dentro de uma ponta de pipeta, coloque essa mistura diretamente na placa de ionização de dessorção a laser assistida por matriz e deixe o local secar completamente. Analise os pontos por espectrometria de massa de ionização de ionização de dessorção assistida por matriz, finalmente regenere a coluna lavando-a completamente com água, seguida por capilares de metanol modificados com várias camadas de ferro disponível.

Três grupos são ideais para uso em cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados mostrados aqui são espectros obtidos de proteínas digeridas antes e depois do enriquecimento, mostrando notável seletividade para 12 fosfopeptídeos diferentes. Experimentos de caracterização representativos fornecem informações valiosas sobre o surgimento de novos poros. Aqui está uma imagem de um monólito de pó a granel após 30 ciclos de polímero de coordenação porosa conhecidos como ciclos de PCP usando um microscópio eletrônico de varredura.

Após 30 ciclos de PCP, o tamanho das larguras dos poros no material foi inferior a três nanômetros de diâmetro em comparação com o polímero a granel. O híbrido tem uma grande quantidade de área incremental com poros pequenos. Isso leva a um aumento na absorção de nitrogênio por meio de uma variedade de pressões usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier.

A incorporação inicial dos grupos funcionais carboxílicos foi visível, bem como o crescimento do revestimento após 10, 20 e 30 ciclos de PCP. Finalmente, a análise termogravimétrica foi usada para medir a quantidade de sítios metálicos adicionais que se acumularam a cada ciclo. Aqui é mostrada a análise gravimétrica através de uma faixa de temperaturas, o que confirma a presença de um número aumentado de locais de metal com o aumento do número de ciclos.

Seguindo este protocolo, um procedimento semelhante pode ser desenvolvido para diferentes centros metálicos em ligantes orgânicos, a fim de direcionar separações eficientes de diferentes analitos com base em sua afinidade por uma estrutura específica. Acredito que materiais compósitos como o nosso, que combinam polímeros macroporosos com estruturas orgânicas metálicas, são uma grande promessa no campo da ciência da separação porque podem melhorar muito a capacidade de ligação da seletividade e a eficiência geral das separações, tanto em escala analítica quanto preparativa.