Name: Implantação de miniosmóticas Bombas e Entrega de Tracers Trato de Estudar Reorganização do cérebro em condições fisiopatológicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda a implantar minibombas osmóticas e injetar traçadores de trato para estudar reorganização cerebral em condições patológicas. Este método permite entrega contínua de agentes terapêuticos e análise de conectividade neural em pesquisa neurorestaurativa.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Dr. Werner Jackstädt (para Eduardo Sanchez-Mendoza), o Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD; para Jeismar Carballo), o Conselho Alemão de Pesquisa (HE3173/2-1, HE3173/2-2 e HE3173/3-1; para Dirk M. Hermann), Fundação Heinz Nixdorf (para Dirk M. Hermann).

Experimentos em animais foram realizados com a aprovação do governo (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 e G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) com base em orientações do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparação de bombas mini-osmóticas <ol><li> Em um ambiente estéril (por exemplo., Cultura celular capuz), obter a bomba, um cateter, regulador de fluxo, a infusão de cérebro cânula e os discos espaçadores para ser utilizado (Figura 1). </li><li> Para a entrega de drogas directamente nos ventrículos usar um disco espaçador, de modo que apenas a ponta da cânula da agulha está em contacto com o ventrículo. Segure a cânula de cabeça para baixo com uma pinça. Adicionar duas gotas de cola de cianoacrilato (CA) e introduzir um disco espaçador. </li><li> Deixar a cânula sobre uma superfície plana virada para cima de modo que a cola entre o disco espaçador e a secagem da cânula. </li><li> Cortar o cateter em secções de cerca de 2,5 cm. </li><li> Para eAbomba CH, preparar um mínimo de 300-350 ul da solução de interesse, uma vez que será necessária para preencher completamente a bomba de extrusão, assim, todo o ar dentro do mesmo para impedir a formação de bolhas no interior do cateter. bolhas irá impedir o fluxo do solução para o cérebro. </li><li> Conecte cuidadosamente o cateter ao moderador do fluxo. </li><li> Utilizando uma seringa de 2 ml conectado à agulha fornecida pelo kit de infusão cérebro, encher a bomba até que uma pequena quantidade de solução escapa a bomba, evitando bolhas de ar no seu interior. </li><li> Preencher cuidadosamente o regulador de fluxo e cateter prestar atenção para evitar quaisquer bolhas restantes dentro do cateter. </li><li> Introduzir o regulador de fluxo no interior da bomba. </li><li> Uma vez preenchido, ligar-se cuidadosamente a cânula para a extremidade do cateter. Se observa-se que uma bolha é formada remover a cânula e cuidadosamente encher o cateter com veículo ou solução do fármaco e, em seguida, reintroduzir a cânula. </li><li> Coloque o pupf num recipiente com solução salina estéril e deixá-lo a 37 ° CO / N. </li><li> Antes da implantação verifique novamente para a formação de bolhas. Se necessário (ie., As bolhas são observadas) remover a cânula e encher o tubo. Volte a ligar a cânula. Isso deve levar apenas alguns microlitros de solução. </li></ol> 2. Implantação de miniosmóticas Bombas Nota: Para estas experiências os animais foram anestesiados com isoflurano a 1% (30% de O2, 70% de N 2 O). No entanto, se este não está disponível, a utilização de injecções intraperitoneais de anestesia Também é possível 11. <ol><li> Localize o animal no dispositivo estereotáxico sob anestesia e cobrir os olhos com uma pomada de protecção para evitar a secura e sob anestesia. Confirmar anestesia por observação de uma falta de resposta na pata traseira quando pressionada com os dedos ou com uma pinça. Não continue até que o animal está completamente adormecido. </li><li> Corte a pele sobre o que eleanúncio, quer com tesoura ou uma máquina de barbear. Cortar, tanto quanto possível, sem danificar a pele. </li><li> Limpe a pele com etanol e 70% desinfetante com propriedades antibacterianas e fungicidas. </li><li> Com um bisturi abrir uma incisão de 1 cm ligeiramente para a direita da linha média e expor o crânio. </li><li> Limpe o crânio com um cotonete. Mergulhe-o com etanol 70% e passá-lo sobre o crânio. Isto irá induzir o crânio para secar. </li><li> Se o crânio tem sangramento leve, use uma cauterizador para eliminar todos os pontos de sangramento. Sangue impede que o CA de secar adequadamente sobre o osso uma vez que a cânula é implantada. </li><li> Utilizar o dispositivo estereotáxico para fazer uma marca no ponto do crânio onde a cânula vai ser implantado. Para infusões ventriculares nas coordenadas hemisfério esquerdo são -0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral em relação ao bregma (Figura 2A). </li><li> Suavemente broca sobre o crânio que faz um ângulo de 45 °; isto impede que a broca de entrar acidentalmente na Brain. Perfurar repetidamente por alguns segundos e, em seguida, verificar o quão profundo o buraco é. Pare de perfurar uma vez que o crânio foi diluído mas ainda não totalmente penetrado. </li><li> Ruptura das meninges com a ponta de uma agulha estéril até que o acesso completo ao cérebro é alcançada. Faça isso com cuidado para não danificar o cérebro. </li><li> Limpar o crânio com etanol a 70%, utilizando um cotonete. </li><li> Introduzir um fórceps simples, sob a pele do animal numa direcção ântero-caudal. Utilizar as pinças para abrir o espaço sob a pele no dorso do animal, em que a bomba vai ser implantado. Introduzir a bomba na parte de trás do animal deixando a cânula do cateter e do lado de fora (Figura 2B). A bomba permanecerá nesta posição até que seja removido e não necessita de qualquer tipo de fixação. </li><li> Colocar-se cuidadosamente quatro pequenas gotas de cola ao lado da agulha na cânula. </li><li> Introduzir cuidadosamente a agulha através do crânio sem movê-lo para o lado. Segurá-la na posição de 15-30 seg uté a cânula é completamente ligado (Figura 2C.1). Uma vez no lugar, a cânula vai atingir 2,5 mm no sentido ventral dorso se um disco espaçador foi usado. Se forem correctamente ligados, a cânula irá ficar aderente ao osso, até ao final da experiência. </li><li> Coloque um dedo sobre a guia removível e, em seguida, use a outra mão para cortá-lo por seu pescoço com um conjunto de tesouras (Figura 2C.2). </li><li> Fechar a ferida na pele com uma sutura 5-0 e adição de algumas gotas de uma solução de povidona-iodo (PVP-I) em cima da ferida para prevenir a infecção (Figura 2D). </li><li> Mova o animal em uma gaiola nova. Não coloque animais operados com animais que ainda não foram explorados. Manter os animais que foram implantados com bombas sozinho nas suas gaiolas durante o tempo de administração do fármaco. </li><li> Não deixe camundongos sem vigilância até que eles estão acordados e recuperaram decúbito esternal. </li></ol> 3. Bomba de tirar raeu Nota: Normalmente o experimento vai terminar no final do tempo de entrega autorizados pela bomba, no entanto, é possível retirar a bomba, a fim de fazer experiências secundárias como um acompanhamento para a entrega da droga. A fim de fazer injeções tracer trato é, portanto, necessária para remover a bomba. <ol><li> Colocar o animal no dispositivo seterotactic sob anestesia e cobrir os olhos com pomada de protecção para evitar a secura e sob anestesia. Confirmar anestesia por observação de uma falta de resposta na pata traseira quando pressionada com os dedos ou com uma pinça. Não continue até que o animal está completamente adormecido. </li><li> Abrir cuidadosamente a pele por corte através da incisão feita no dia da implantação da bomba. </li><li> Com uma pinça cirúrgica segurar a cânula e retire-o. Deve ser facilmente removida do crânio. Como o sangramento suave é esperado, pará-lo, colocando um cotonete e esperar por 1-2 min. </li><li> Puxe a bomba pelo cateter. Elelp-lo sair, empurrando-o, criando pressão sobre a pele. </li><li> Fechar a ferida novamente com uma sutura 5-0 e adição de algumas gotas de PVP-I. </li><li> Mova o animal em uma gaiola nova. Não coloque animais operados com animais que ainda não foram explorados. Os animais que foram submetidos a cirurgia podem ser colocados juntos. </li><li> Não deixe camundongos sem vigilância até que eles estão acordados e recuperaram decúbito esternal. </li><li> Permitir que o animal possa recuperar durante 10 dias antes de prosseguir para a injeção do radiofármaco trato. </li></ol> 4. Pressão Tract Tracer Injeção em ângulos de 45 ° sobre o Direito Motor Cortex <ol><li> Colocar o animal no dispositivo estereotáxico sob anestesia e cobrir os olhos com uma pomada de protecção para evitar a secura e sob anestesia. Confirmar anestesia por observação de uma falta de resposta na pata traseira quando pressionada com os dedos ou com uma pinça. Não continue até que o animal está completamente adormecido. </li><li> Abra o ferimento na cabeça. </li><li> Cinclinar o crânio com 70% de etanol com um cotonete. </li><li> Introduzir uma seringa de vidro de 5 mL (26S GA) no suporte vertical do dispositivo. Certifique-se a extremidade inferior do suporte de vidro é precisamente na peça de retenção. A seringa não deve estar muito abaixo que, em seguida, como será impossível para colocá-la em 45 ° a partir da posição vertical e fazer a injecção. </li><li> Orientar a seringa diretamente sobre bregma e em seguida, localize as coordenadas desejadas. Para uma injecção nas coordenadas do córtex motor são as seguintes: Ponto # 1: +0,5 mm rostral e 2,5 mm lateral em relação ao bregma. Ponto # 2: +1,34 mm rostral, 2,5 mm lateral em relação ao bregma. </li><li> Uma vez que as coordenadas foram localizados, indicar a sua posição sobre o crânio com um marcador com uma ponta fina. Faça apenas um ponto no crânio como liberação excessiva de tinta pode esconder coordenar a correta. </li><li> Perfurar o crânio segurando cuidadosamente a broca de 45 °. Como no passo 2.8, verifique o crânio com freqüência para que ele não é totalmente perforated, a fim de evitar danos no cérebro causadas pela broca. Utilizar a ponta de uma seringa para assegurar que todo o osso foi removida. </li><li> Coloque 600 nl de canal de diluição marcador dentro da seringa. </li><li> Ajustar a posição vertical a 45 ° para o lado direito do animal. Sob o microscópio, coloque a ponta da agulha da seringa a direita na frente do buraco. </li><li> Movê-lo na direcção vertical por 1,5 mm. Deixe a agulha firme nesta posição por 30 segundos a 1 minuto antes de fazer injeções de pressão. </li><li> Injectar 300 nl de diluição de marcador em três passos de 100 nl separadas umas das outras por 30 seg. Após a última injecção, deixar a seringa estável durante 30 segundos a 1 minuto, a fim de evitar o traçador a fluir para fora do cérebro. </li><li> Lentamente, retire a seringa, realocá-lo em relação ao segundo buraco e repetir o mesmo processo com o 300 nl restantes que estão dentro da seringa. </li><li> Após a segunda injecção, remover a seringa e prossiga para fechar a você estánd com uma sutura 5-0 e adicione algumas gotas de PVP-I. </li><li> Mova o animal em uma gaiola nova. Não coloque animais operados com animais que ainda não foram explorados. Os animais que foram submetidos a cirurgia podem ser colocados juntos. Não deixe camundongos sem vigilância até que eles estão acordados e recuperaram decúbito esternal. </li><li> Permitir que o animal possa recuperar durante 10 dias antes do sacrifício. </li></ol> 5. Tract Tracer Observação <ol><li> Anestesiar o animal totalmente as orientações institucionais. Confirmar anestesia por observação de uma falta de resposta na pata traseira quando pressionada com os dedos ou com uma pinça. Não continue até que o animal está completamente adormecido. </li><li> Perfundir os animais com paraformaldeído a 4% em PBS (pH 7) no âmbito de protocolos padrão 6. </li><li> Remover o cérebro e pós correção pelo O / N imersão em paraformaldeído a 4%. </li><li> Cryoprotect cérebros em sacarose a 30% até o cérebro afundar. Em seguida, retire os miolos e congelá-los por 10 seg Immersion em azoto líquido. Manter cérebros a -80 ° C até as secções são produzidos. </li><li> Produção de secções a 20 uM para análise traçador retrógrado e no tracto 40 um marcador para a análise tracto anterógrada por seccionamento em um cryostate. </li></ol> Nota: FG neurónios rotulados pode ser observado como as células brancas de excitação sob luz ultravioleta. BDA é detectado por O / N a incubação com um complexo de avidina-biotina peroxidase e-3,3 &#39;diaminobenzidina com a adição de níquel em 0.4% para aumentar o contraste das fibras de 6,7.

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</ol>

Produção e Open Access taxas de publicação fornecidas por DURECT Corporation, que produz as bombas miniosmóticas usado neste artigo.

Por muitos anos, a investigação sobre doenças neurodegenerativas, como acidente vascular cerebral isquêmico ou lesão cerebral traumática tem-se centrado no desenvolvimento de terapias neuroprotetoras que visam promover a sobrevivência neuronal na fase aguda acidente vascular cerebral. A grande maioria de drogas terapêuticas que têm sido encontrados para ser eficaz em modelos de roedores com falha quando traduzida para a clínica. As razões para esta falha terapêutica incluem, mas não se restringem à falta de efeitos de drogas sustentadas resultando na persistência da recuperação neurológica funcional. Assim, é importante para desenvolver estratégias que promovam a remodelação do cérebro no longo prazo. Como a promoção de sobrevivência neuronal por si só não é suficiente para permitir a recuperação bem-sucedida do curso, tal como sugerido pelo grande número de tentativas mal sucedidas de neuroproteção, a estimulação de plasticidade neuronal recentemente obteve grande interesse no campo. Meios para a entrega da droga são a injeção intraperitoneal, cauda i intravascularnjection, injecção femoral, a injecção estereotáxica de vectores única no cérebro e continuou entrega constante por bombas mini-osmóticas. Estes últimos podem incluir a entrega sistémica, se a bomba não tem uma cânula, ou que pode ser dirigido órgão, como mostramos para entrega no cérebro. Com a excepção das bombas mini-osmóticas e a utilização de vectores virais, todas as outras estratégias irá induzir concentrações de droga flutuantes. Para os experimentos de longa duração torna-se, assim, necessário apresentar o animal ao estresse de receber injecções frequentes. O BBB impõe um obstáculo importante para a captação no cérebro de proteínas ou fármacos a partir do sangue, resultando na necessidade de grandes dosagens de proteína ou de drogas, a fim de atingir as concentrações terapêuticas no cérebro. Por exemplo Pellegrini et al. (2013) 5 entregue rhEpo por injecção intraperitoneal com uma dose equivalente a 75 IU / dia para um animal, de 30 g (750 UI / dia para um rato de 300 g). Em comparação, a entrega de rhEp alvoo para o cérebro nos permitiu usar uma dose muito menor de apenas 10 IU / dia em nosso estudo para recuperação bem sucedida do curso, o que nos permitiu conseguir a recuperação através de uma escala de tempo grande em uma taxa fixa de 0,25 l / h. Neste trabalho, demonstraram que o método de implantação de mini-bombas com uma cânula ligada ao crânio, a fim de proporcionar a proteína de promover plasticidade rhEpo directamente no ventrículo, contornando assim a certificação. Por este método, rhEpo promoveu a recuperação neurológica em um número de maneiras, incluindo a redução do tamanho do enfarte, a redução da formação de cicatrizes gliais e a indução da angiogénese. rhEpo também promoveu a sobrevivência neuronal e aumento projeções do córtex motor contralesional para o núcleo vermelho desnervado e núcleos faciais. O surgimento das fibras foi revelado por injecção do traçador tracto anterógrada BDA no córtex motor (Figuras 4A e 5A). Um correlato funcional para o surgimento das fibras é provided pela melhora das habilidades motoras (Figura 5B). Além disso, mostrámos que a mesma abordagem para injecção tracto traçador pode ser aplicado para revelar ligações tálamo-corticais por injecção do traçador retrógrado tracto FG (Figura 6B). Na preparação da bomba mini-osmóticas, é importante considerar o ponto-alvo e a utilização de espaçadores. Usamos um espaçador para reduzir o comprimento da agulha por 0,5 milímetros como, desta forma a ponta da agulha está em contacto com o ventrículo nas coordenadas indicadas (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral, 2,5 mm ventral dorso, com relação ao bregma). No entanto, se estruturas mais profundas são o alvo da pesquisa, em seguida, será necessária sem espaçadores. Da mesma forma, se um ponto de distribuição mais externa é desejada (isto é., O córtex), em seguida, mais discos espaçadores será necessário. O cateter deve ser longa o suficiente para que a bomba não é muito perto da cabeça, uma vez que irá impedir o movimento do mouse, mas também comprimento excessivo não muito tempo, como uma vez implantado pode fazer com que o cateter de dobrar, aumentando assim o risco de a remoção da cânula pela circulação natural do rato. A secção de 2 cm de cateter dá muito bons resultados em termos de mobilidade e estabilidade do implante (Figuras 1 e 2). A incubação da bomba a 37 ° CO / N permite que a bomba comece imediatamente a bombear o fármaco no cérebro, no momento da implantação. No implante de bomba mini-osmóticas é crítico para assegurar que o crânio é bem seco antes da implantação da cânula. Normalmente, a limpeza com 70% de etanol, vai induzir o osso para secar, mas se a hemorragia contínua é encontrado, tocando o crânio suavemente com um cauterizador vai secar completamente. É crítico para assegurar que a introdução da agulha é como vertical e lenta quanto possível. Uma vez em posição, e ao mesmo tempo a cola está a secar, colocando o dedo no topo da cânula impede que se mova lateralmente OVer o crânio. Cuidado especial deve ser dado à ferida e colocação da cânula. É importante que a incisão não é realizada exactamente sobre a linha média do crânio, mas ligeiramente para o lado direito. Ao fechar a ferida, se a incisão na linha do meio, a pele será sobrecarregado, aumentando assim o risco de abertura da ferida. Fazer a incisão ligeiramente para um lado vai permitir que os pontos de sutura para ser longe da parte mais alta da cânula. Como consequência, haverá menos tensão sobre os pontos de sutura e a ferida irá curar devidamente. Os animais devem ser enjaulado sozinho verificado todos os dias, especialmente durante os primeiros 10-15 dias após a implantação. Em caso de deiscência da ferida, as feridas tem que ser fechado tão rapidamente quanto possível. Se a cânula for removida ou o animal apresenta uma infecção, a experiência tem que ser terminado. Re-implantação da cânula não é recomendado. É muito importante para o sucesso da implantação a utilização de quantidades adequadas de tecido anúncioadesiva (não muito!), uma vez que degrada o osso e aumenta o risco de a remoção de uma cânula. No entanto usando muito pouco adesivo também não vai segurar a cânula ligado ao osso. As bombas mini-osmóticas podem transportar drogas dissolvidas em uma ampla variedade de substâncias, sendo a única limitação a isto que o solvente é biocompatível. Além disso, dado que o volume é pequeno (200 ul) deve-se determinar se a concentração necessária para a experiência é adequado e não irá provocar a precipitação dentro da bomba. Rastreamento com qualquer anterógradas ou retrógradas traçadores trato é uma técnica muito bem estabelecido para estudar a conectividade cerebral e plasticidade. Cuidados devem ser tomados para os quadros uso estereotáxica quando se injecta para garantir a precisão na segmentação a área do cérebro que se deseja estudar (ou seja, para evitar a injeção no corpo caloso ao injetar o córtex). Para todas as intervenções cirúrgicas e de modo a reduzir a dor einflamação, os animais devem ser tratados com 0,1 mg / kg de buprenorfina antes da intervenção e Caprofen a 4 mg / kg uma vez por dia durante três dias após a intervenção. Em conclusão, esta abordagem proporciona uma ferramenta adequada para o estudo de efeito de proteínas ou compostos farmacológicos no cérebro lesionado, que representa um método que é bem adequado para estudos sobre a plasticidade do cérebro.

A entrega de proteínas e compostos farmacológicos no cérebro são estratégias importantes para estudar os mecanismos subjacentes às doenças cerebrais e avaliar moléculas candidatas a novos tratamentos 1,2. Nas neurociências experimentais, a entrega de vetores como plasmídeos ou adenovírus tornou-se uma ferramenta importante para estudar as ações de longo prazo de proteínas no cérebro 3,4. Injeções únicas de vetores apresentam a vantagem de um sistema que, por si só, manterá níveis altamente estáveis do agente terapêutico no cérebro 4. No entanto, para experimentos de longo prazo com drogas purificadas, a administração sistêmica por injeção intraperitoneal induz estresse em camundongos ou ratos e não é a melhor escolha quando uma resposta cerebral direcionada é necessária, exigindo também grandes doses de droga5. As bombas miniosmóticas representam um sistema ideal para a administração direta prolongada de medicamentos no cérebro, contornando tanto a baixa acessibilidade ao cérebro quanto os picos de concentração do medicamento, pois a entrega do medicamento ocorre diretamente em um local específico no cérebro e a uma taxa de fluxo fixa determinada pelo modelo de bomba escolhido2,6,7. De fato, esse sistema nos permitiu estudar com sucesso a recuperação cerebral após o AVC pela administração de vários medicamentos, como eritropoietina humana recombinante (rhEpo) e fator de crescimento endotelial vascular 6,7. 
A plasticidade cerebral é essencial para a religação de conexões em resposta a lesões cerebrais. A plasticidade é um conceito amplo que vai desde a formação ou eliminação de contatos sinápticos, crescimento de espinhas dendríticas e também alongamento ou retração de conexões de longa distância8,9. Acreditava-se anteriormente que o cérebro não era capaz de reconstruir conexões após uma lesão. No entanto, muitas abordagens têm mostrado que, se devidamente estimulado, pode restabelecer a conectividade 6,7,10. Uma técnica que é particularmente útil para estudar isso é o uso de traçadores de trato. Os traçadores do trato anterógrado são compostos que podem entrar nos neurônios no soma e depois se distribuir ao longo dos axônios até que estes atinjam suas estruturas-alvo. Dois exemplos são o azul em cascata (CB) e a dextrana amina biotinilada (BDA). Por outro lado, traçadores retrógrados, como a toxina B da cólera (CTB) ou fluoroouro (FG), entram no neurônio através do terminal do axônio e depois se distribuem de volta ao soma, revelando assim o local de origem dos neurônios direcionados ao local da injeção.
Aqui, apresentamos os métodos que usamos para implantação de bombas miniosmóticas para entrega direta de proteínas ou drogas que têm efeitos potenciais na plasticidade neural, bem como a injeção de BDA e FG para revelar conexões de entrada e saída para o córtex motor. O BDA também será usado como um exemplo de um traçador de trato usado para demonstrar o aumento da plasticidade dos axônios que emergem do co após o AVC sob tratamento com rhEpo.

<table><tbody><tr><td>Bomba miniosmótica Alzet. Modelo 2004.</td><td>Alzet</td><td>000298</td><td>Recipiente para medicamentos</td></tr><tr><td>Kit de infusão cerebral 3 1-3 mm</td><td>Alzet</td><td>0008851</td><td>Sistema de entrega de drogas cerebrais</td></tr><tr><td>Loctite&nbsp; 454 Prism gel&nbsp;</td><td>Loctite</td><td>45404</td><td>Adesivo de cianoacrilato para adesão de cânula ao crânio</td></tr><tr><td>seringa de vidro 75N&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87900/00</td><td>Injeção de traçadores de trato</td></tr><tr><td>Biotina Dextrana Amina (10.000 MW)</td><td>Sondas moleculares</td><td>N-7167</td><td>Traçador de trato anterógrado</td></tr><tr><td>Fluorogold</td><td>Fluorochrome, LLC.</td><td></td><td>Rastreador retrógrado</td></tr><tr><td>Injetor Estereotáxico por Excelência (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Dispositivo estereotáxico para determinação de coordenadas, implantação de bomba e injeção de traçador de trato.</td></tr></tbody></table>

implantação de miniosmóticas bombas e entrega de tracers trato de estudar reorganização do cérebro em condições fisiopatológicas

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

O tratamento farmacológico em modelos animais de doença cerebral impõe o problema de protocolos de injeção repetidos que podem induzir estresse em animais e resultar em níveis teciduais impermanentes da droga. Além disso, a administração de medicamentos ao cérebro é delicada devido à barreira hematoencefálica (BHE), reduzindo significativamente as concentrações intracerebrais de medicamentos seletivos após administração sistêmica. Portanto, um sistema que permite tanto a entrega constante de medicamentos sem níveis máximos quanto a evasão da BHE é para atingir concentrações intracerebrais suficientemente altas de drogas que são impermeáveis à BHE. Nesse contexto, as bombas miniosmóticas representam um sistema ideal para a administração constante de medicamentos a uma taxa fixa conhecida que ilude o problema do estresse diário de injeção em animais e que também pode ser usado para a administração direta de medicamentos no cérebro. Aqui, descrevemos um método para implante de bomba miniosmótica e cuidados pós-operatórios que devem ser dados aos animais para aplicar com sucesso esta técnica. Incorporamos o paradigma experimental mencionado acima em procedimentos padrão que são usados para estudar a neuroplasticidade no cérebro de camundongos C57BL6. Assim, expusemos os animais a um infarto cerebral de 30 minutos e implantamos bombas miniosmóticas conectadas ao crânio por meio de uma cânula para fornecer um medicamento pró-plasticidade. O teste comportamental foi feito durante 30 dias de tratamento. Após a remoção, os animais receberam injeções de traçadores do trato anterógrado para analisar a plasticidade neuronal na fase crônica de recuperação. Os resultados indicaram que a neuroproteção pela droga administrada foi acompanhada com aumento das fibras motoras que cruzam a linha média do cérebro nas estruturas-alvo. Os resultados afirmam o valor dessas técnicas para a administração de medicamentos e estudos de plasticidade cerebral na neurociência moderna.

Nós apresentado animais a 30 minutos de oclusão da artéria cerebral média através do método de sutura intraluminal, induzindo uma lesão no corpo estriado esquerdo e em seguida entregue rhEpo directamente para o cérebro por meio de bombas mini-osmóticas (figura 1, figura 3) durante 30 dias, com início 3 dias após acidente vascular cerebral 6. A Figura 4 mostra um diagrama esquemático do tracto espinal córtico que foi rastreada e depois CB BDA injecção e a área onde traçadores foram injectados. Nós mostramos uma melhora da força de preensão e de desempenho motor (Figura 5) após 14 e 42 dias da entrega rhEpo respectivamente. Entrega de BDA no córtex motor direito dos animais que receberam um acidente vascular cerebral no estriado esquerdo, mostrou um aumento em fibras motoras cruzar a linha média ao nível do núcleo vermelho e facial (Figura 5), demonstrando a coloração de sucesso de brotamento de fibras tão uma consequência do tratamento farmacológico com miniosmotBombas ic. tratamento rhEpo também aumentou a sobrevivência neuronal, atrasou astrocitose difusa, reduziu a formação de cicatriz glial e aumento da angiogênese no período estudado 6. Ao usar esta mesma técnica para injecção traçador tracto podemos detectar com êxito núcleos talâmicos que estão ligados ao córtex por injecção do traçador FG retrógrada do tracto (Figura 6). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> Figura 1. Componentes da bomba miniosmóticas utilizado neste protocolo. O disco espaçador, cânula e guia removível, cateter, o fluxo moderador e bomba miniosmóticas podem ser observados. O aspecto da bomba totalmente montada pode ser visto na Figura 2A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> ithin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> Figura 2. Resumo da implantação da bomba de pontos-chave. (A) O mouse é mostrado colocado no dispositivo estereotáxico com a bomba miniosmóticas totalmente construído ao lado dele. A seta indica as coordenadas seleccionadas, para implantação. (B) A bomba foi introduzido no dorso do animal, e só a cânula permanece no exterior. O crânio foi perfurado já. (C) Aspecto da cabeça após a implantação. (C.1) A cânula é em posição, mas a guia removível não tenha sido cortado. (C.2) A aba removível ter sido cortada e costura de a ferida pode começar agora. (D) O asterisco mostra um animal recentemente implantadas, em comparação com um animal 30 dias após a implantação (#). Quando instalado correctamente, a ferida deve permanecer fechada até o final do processo, como mostrado na imagem.&quot;target =&quot; _ blank ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> Figura 3. coloração de Nissl indicando o local da implantação no córtex. Uma pequena incisão pode ser observado na parte do córtex esquerda (seta). A largura da área de penetração é cerca de 50 uM. O há alterações graves no tecido evidentes com base na coloração de Nissl em comparação com a área correspondente contralateral (*). R: hemisfério direito. L: hemisfério esquerdo. Scale bar = 300 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> Figura 4. Tractestratégia de injeção do radiofármaco como publicado antes por Reitmeier et al. 6,7. (A) esquemáticos que indiquem os locais de injeção para o traçador trato BDA no córtex motor contralateral Considerando CB foi injetado no córtex motor do hemisfério enfartado. As fibras foram seguidos para o núcleo vermelho (não representado) e núcleo facial (ver Figura 5). (B) O local de injecção do traçador tracto anterógrada BDA ao lado do córtex motor é mostrado. Observe a seta vermelha que indica a faixa agulha enquanto que a seta preta mostra algumas células corticais marcadas com o BDA. Cx: Cortex. CC: corpo caloso. V: Ventrículo. FN: núcleo Facial. Barra de escala em B = 200 mm. Figura 4A é reproduzido com a devida permissão 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt = &quot;Figura 5&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Recuperação de um cérebro enfartado após a entrega de rhEpo. (A) BDA injectado no córtex motor contralesional é então detectado em fibras corticobulbares ao nível do núcleo facial (bregma -5,8 mm para -6,3 mm). Linhas de interseção em cada hemisfério foram elaboradas paralelamente à linha mediana e fibras que cruzam cada linha em direção ao hemisfério ipsilesional e contralesional foram contadas e expressas como percentagem do total de fibras marcadas no trato corticoespinhal. Eritropoietina aumentou travessias de fibra em direção aos contralesional dados núcleo facial são meios + - SD. Os dados foram analisados ​​por ANOVA one-way seguido por testes de menos significativos diferenças, §P &lt;0,05 em comparação com ratos não isquémicos tratados com o veículo. (B) Comportamento Motor mostrou uma melhora de força de preensão manual e coordenação no teste de rota rod. Os dados são médias ValuES + - SD. Os dados foram analisados ​​por duas vias para medidas repetidas ANOVA, seguido de variância one-way / menos significativos testes diferenças para cada ponto de tempo. §P &lt;0,05 em comparação com os valores basais pré-isquêmica; * P &lt;0,05 comparada com os ratos tratados com veículo isquêmicos. As Figuras 5A e B são reproduzidas com a devida permissão 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> Figura 6. estruturas alvo atingido após a injecção de Fluorogold (FG). (A) no local de injecção de FG ao lado do córtex motor, conforme indicado na Figura 1. Note-se a seta vermelha indica o percurso da agulha e a seta branca indica algumas células marcadas em o córtex. (B) FG injectado próximo do motorcórtex é detectado no VPL. Fi: Fimbria. IC: cápsula interna. RT: núcleo reticular Thalamic. VPL: Thalamic núcleo póstero ventral. Barra de escala = 200 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Para estudar a reorganização cerebral em condições patológicas, usamos bombas miniosmóticas para entrega direta de proteínas no cérebro, contornando a barreira hematoencefálica. Os traçadores do trato são então injetados para estudar alterações na conectividade cerebral sob a influência da proteína.

Implantação de miniosmóticas Bombas e Entrega de Tracers Trato de Estudar Reorganização do cérebro em condições fisiopatológicas

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

O objetivo geral deste procedimento é implantar bombas osmóticas miniaturas para administrar agentes terapêuticos ao cérebro e, em seguida, entregar traçadores de vias para estudar modificações na condutividade da via corticoespinal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa neurorestauradora, como por exemplo como as conexões de longa distância dentro dos sistemas nervosos centrais são alteradas na presença de agentes terapêuticos potenciais. A principal vantagem dessas técnicas é que a administração contínua do agente terapêutico garante a reprodutibilidade dos resultados, enquanto os traçadores de vias são agentes muito confiáveis para acompanhar alterações morfológicas nas conexões de longa distância.Em geral, indivíduos novos nestes métodos terão dificuldades, pois a precisão e as habilidades cirúrgicas são essenciais para prevenir danos cerebrais como consequência das diversas intervenções. Demonstrarei o procedimento juntamente com Jeismar Carballo, um estudante de pós-graduação do laboratório da professora Hammond. Comece preparando a bomba osmótica miniatura em um ambiente estéril.Primeiro, use uma pinça para segurar a cânula de infusão cerebral de cabeça para baixo. Em seguida, adicione duas gotas de adesivo de cianoacrilato e insira um disco espaçador para a liberação do fármaco no ventrículo. Depois, corte o cateter em 2,5 centímetros e conecte-o cuidadosamente ao moderador de fluxo.Em seguida, para evitar a formação de bolhas de ar, utilize uma seringa de 2 mililitros conectada a uma agulha para encher a bomba até que uma pequena quantidade de solução escape pela bomba. Agora, encha cuidadosamente o moderador de fluxo e o cateter, garantindo que não haja bolhas no interior do cateter. Em seguida, encaixe o moderador de fluxo dentro da bomba.Uma vez preenchida, conecte cuidadosamente a cânula à extremidade do cateter, coloque a bomba em um recipiente com solução salina estéril e deixe-a a 37 graus Celsius durante a noite. Após anestesiar o animal de acordo com protocolos aprovados e confirmar a anestesia pela ausência de resposta a um aperto na pata traseira, posicione o animal em um estereotáxico. Cubra os olhos com pomada protetora para prevenir ressecamento.Além disso, corte a pelagem sobre a cabeça o mais próximo possível da pele e limpe a pele com etanol a 70 por cento e um desinfetante com propriedades antibacterianas e fungicidas. Após usar um bisturi para abrir uma incisão de 1 centímetro ligeiramente à direita da linha média, exponha o crânio e limpe-o com um cotonete embebido em etanol a 70 por cento. Após posicionar o braço estereotáxico sobre o bregma, mova o braço estereotáxico até as coordenadas para atingir o ventrículo.Marque este ponto no crânio. Perfure suavemente o crânio nesse ponto com a broca inclinada em 45 graus para evitar danos acidentais ao cérebro. Perfure repetidamente por alguns segundos e depois verifique a profundidade do orifício.Interrompa a perfuração assim que o crânio estiver afinado, mas ainda não totalmente penetrado, e então rompa as meninges com a ponta de uma agulha estéril até que o acesso ao cérebro esteja claro. Em seguida, introduza uma pinça reta sob a pele do animal em direção anterocaudal e use a pinça para abrir o espaço sob a pele na região dorsal do animal, onde a bomba será implantada. Introduza a bomba na parte dorsal do animal, deixando o cateter e a cânula do lado de fora.Coloque cuidadosamente quatro pequenas gotas de cola na cânula ao lado da agulha. Agora, introduza cuidadosamente a agulha através do crânio, sem movê-la lateralmente. Mantenha-a na posição por 15 a 30 segundos até que a cânula esteja completamente fixada.É importante ser cuidadoso e preciso ao introduzir a agulha da bomba e garantir que a cânula esteja adequadamente fixada ao crânio para assegurar que o período de administração seja concluído sem que o animal a remova. Em seguida, coloque um dedo sobre a aba removível e use uma tesoura para cortá-la na parte estreita. Por fim, feche a incisão com sutura zero e desinfete a incisão fechada com solução de poviodine-iodo.Transfira o animal para uma gaiola limpa e monitore-o até que tenha recuperado a decúbito esternal. O animal deve ser mantido isoladamente durante a administração do fármaco. Após preparar, anestesiar e posicionar o animal no estereotáxico como antes, abra a pele cortando através da incisão usada para a implantação da bomba, segure então o cânula com uma pinça cirúrgica e retire-a conforme mostrado.Deve ser removido facilmente do crânio. Interrompa qualquer sangramento mantendo um cotonete no local por um a dois minutos. Segure o cateter e remova a bomba puxando o cateter e empurrando a bomba ao mesmo tempo.Após a remoção da bomba, feche a ferida como anteriormente e aplique algumas gotas de poviodine-iodo. Transfira o animal para uma gaiola limpa e monitore-o até que esteja móvel. Dez dias após a remoção da bomba osmótica miniatura, anestesie o animal, retorne-o ao estereotáxico e abra a ferida craniana.Limpe o crânio com etanol a 70 por cento. Ajuste corretamente uma seringa de vidro de cinco microlitros no suporte vertical do aparelho estereotáxico. Oriente a seringa diretamente sobre o bregma e mova até as coordenadas desejadas para injetar a córtex motora.Faça uma marca neste ponto com uma caneta de ponta fina. Em seguida, mova a seringa para o segundo ponto e faça uma pequena marca nesse local. Perfure cuidadosamente o crânio em ambos os pontos, mantendo a broca em um ângulo de 45 graus.Novamente, não perfure completamente o crânio e use a ponta de uma agulha para remover o restante do osso. Carregue a seringa com 600 nanolitros do traçador. Em seguida, ajuste a posição da agulha para um ângulo de 45 graus no lado direito do crânio.Enquanto observa por meio de um microscópio cirúrgico, posicione a ponta da agulha exatamente em frente ao orifício e, em seguida, insira a agulha no cérebro até uma profundidade de 1,5 milímetro. A velocidade mostrada é apenas para fins de demonstração. Normalmente, espere 30 segundos entre cada etapa de 0,5 milímetro.Deixe a agulha permanecer no local por 30 segundos a um minuto. Como você viu, a penetração da agulha durante a injeção do marcador retrógrado é feita a partir da camada da túnica para evitar áreas incorretas, o que poderia levar a resultados confusos entre indivíduos. A remoção lenta da agulha evitará o refluxo do marcador.Em seguida, injete 300 nanolitros de traçador em três etapas de 100 nanolitros, com cada etapa separada por um intervalo de 30 segundos. Após a última injeção, mantenha a seringa no lugar por 30 segundos a um minuto antes de retirá-la lentamente. Posicione a ponta da seringa sobre o segundo orifício.Insira a agulha como anteriormente e repita a injeção com os 300 nanolitros restantes na seringa. Após a segunda injeção, retire a seringa e feche a ferida com sutura zero número cinco. Novamente, coloque o animal em uma gaiola limpa e monitore-o enquanto se recupera da anestesia antes de devolvê-lo à sala de alojamento.Os animais foram submetidos a 30 minutos de oclusão da artéria cerebral média para induzir uma lesão no estriado esquerdo. Três dias depois, eritropoietina humana recombinante foi administrada por meio de bombas osmóticas miniaturizadas por um período de 30 dias. Cascade blue foi injetado no hemisfério infartado e amina de dextrana biotinilada foi injetada no hemisfério contralateral.As fibras foram seguidas até o núcleo facial. A amina de dextrana biotinilada injetada no córtex motor contralateral à lesão é detectada nas fibras corticobulbares. As fibras para os hemisférios ipsilateral e contralateral à lesão foram contadas e expressas como uma porcentagem do total de fibras marcadas no trato corticoespinal.A eritropoietina aumentou as travessias de fibras em direção ao núcleo facial contralateral. O comportamento motor mostrou uma melhora na força de preensão manual em comparação com a linha de base pré-isquêmica após a infusão de eritropoietina humana recombinante. A coordenação motora, avaliada pelo teste do rotarod, também foi melhorada após a infusão de eritropoietina humana recombinante.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de 30 minutos por procedimento cirúrgico, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter uma esterilidade adequada durante a preparação da bomba e durante a cirurgia, para prevenir infecções cerebrais. O uso de traçadores de trajetos anterógrados e retrógrados é uma abordagem segura e não dispendiosa que permite compreender a conectividade cerebral tanto na saúde quanto na doença.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implantar e remover bombas osmóticas miniaturizadas e/ou realizar injeções de traçadores de trajeto.

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Neurociência

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Implantação de miniosmóticas Bombas e Entrega de Tracers Trato de Estudar Reorganização do cérebro em condições fisiopatológicas (Vídeo) | JoVE Journal

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