Name: Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprenda a isolar neutrófilos com propriedades anti-tumorais usando gradiente de densidade e co-cultura com células tumorais marcadas com luciferase. Este método minimiza a ativação inespecífica e avalia a citotoxicidade sem rádio.

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ZG é apoiada por doações do Programa I-CORE da Fundação Ciência Israel (Grant No. 41/11), a Fundação Abisch-Frenkel, o Roseiras Trust, do Cancer Research Foundation Israel (ICRF - Investigação Carreira de Desenvolvimento Award) eo PREOCUPAÇÃO fundação. ZGF é apoiada por doações da Fundação Israel Cancer Research (ICRF - Investigação Carreira de Desenvolvimento Award), Cientista Chefe do Ministério da Saúde de Israel e da Associação Lung Israel.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Os neutrófilos são a mais abundante de todas as células brancas do sangue e são os primeiros socorros em casos de infecção e inflamação. Como tal, eles são muito sensíveis a estímulos externos e são facilmente activado. Além disso, os neutrófilos tem uma meia-vida muito curta e um volume de negócios rápida. Juntas, essas características levantam várias dificuldades em trabalhar com neutrófilos, de tal forma que estratégias experimentais originais são necessários. Por exemplo, existem várias estratégias de purificação de...

Os neutrófilos foram inicialmente caracterizadas como sendo as células imunes inatos que servem como primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Hoje sabe-se que os neutrófilos funções têm maior alcance, estar envolvido na montagem de resposta imune adaptativa contra antígenos estranhos 1,2, que regula a hematopoiese 3, 4 angiogênese e cicatrização de feridas 5. Além disso, os neutrófilos podem afectar o crescimento do tumor metastático e a progressão em virtude das suas pro- e anti-tumorais actividades 6,7. Os neutrófilos são caracterizados por um núcleo segmentado polimórfica (daqui denominado polimorfonucleares (PMN)) e contêm pelo menos três subclasses distintas de grânulos, bem como vesículas secretoras 8 (Figura 1A-C). Os neutrófilos possuem elevada capacidade fagocítica e actividade da NADPH-oxidase alta crítica para a eliminação microbiana, e secretam uma vasta gama de quimiocinas importantes para atração de neutrófilos adicionais e outras células do sistema imunológico para o local da inflamação 8,9. Os neutrófilos são caracterizados pela expressão de uma grande quantidade de receptores da superfície, incluindo os receptores semelhantes a Toll (TLRs), lectina do tipo C Receptores (CLRs), complementar do receptor 3 (CD11b / CD18) e outras moléculas de adesão (por exemplo, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e carcinoembrionário molécula relacionada com antigénio-adesão celular 3 (CEACAM3 / CD66b)), receptores de quimioquinas (por exemplo, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), quimioatractivas receptores (por exemplo, PAFR, LTB4 R e C5aR) , receptores de citocinas (por exemplo, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptídicos dos receptores (por exemplo, FPR1-3), e receptores de Fc (por exemplo, CD16 (FcyRIII ), CD32 (FcyRII), e CD64 (FcyRI) 10. Em ratinhos, os neutrófilos são geralmente identificados como CD11b + Ly6G +, enquanto que os neutrófilos humanos são identificadas utilizando os marcadores de leucócitos CD11b, CD15, CD16 e CD66b. É também geralmente aceite para corar para a mieloperoxidase proteínas dos grânulos (MPO) e elastase de neutrófilos (NE) para a detecção de neutrófilos em tecidos. Ainda não é claro se as diversas funções dos neutrófilos são mediadas pela mesma célula ou por sub-populações de células distintas. Acumulando dados sugerem a presença de uma população heterogénea de neutrófilos que exibe um elevado grau de plasticidade afectado por estímulos pró-inflamatórios e o microambiente 11,12. Fridlender et al. 13 ter grosseiramente divididos os neutrófilos no cancro em duas sub-populações principais denominado N1 com propriedades anti-tumorais e N2 com propriedades pró-tumorais. No cancro, bem como na inflamação crónica, há uma sub-população adicional constituído por células granulocíticas derivado supressoras mielóides (L-MDSCs) que suprimem as respostas de células T 14. L-MDSCs são consideradas ser células mielóides imaturas caracterizadas por uma CD11b + Ly6Cbaixo Ly6G fenótipo oi em camundongos 15, ao ter um CD15 + / CD16 baixo fenótipo em humanos 16. L-MDSCs expressar níveis mais elevados de arginase e mieloperoxidase, enquanto os níveis mais baixos de citocinas e quimiocinas que os neutrófilos circulantes normais. Eles são menos fagocíticas e migratório, mas produzem maiores níveis de ROS 15,17,18. No presente artigo vamos descrever algumas metodologias básicas para isolamento e caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais. Enquanto neutrófilos constituem a maior população de todas as células brancas do sangue na circulação humana (45 - 70%; 1800 - 6000 / mL), em ratos, sob condições normais, que são bastante escassos (10 - 15%; 300-500 / ul ). A contagem de neutrófilos aumenta de forma constante sobre a inflamação e, ocasionalmente, no cancro, o que representa um estado de inflamação crônica 7. Os neutrófilos desenvolver a partir de precursor comum mielóide multipotentes (CMP) cells na medula óssea, por meio de um processo de diferenciação que passam as fases de mieloblastos (MB), promielócitos (PM), (MC) mielócitos, metamielócitos (mm) e as células de banda (BC) 8. Os neutrófilos maduros, pós-mitóticas podem permanecer dentro da medula óssea para 4-7 dias antes de serem liberados para a circulação 8. Volume de neutrófilos no sangue é geralmente rápida, com uma semi-vida média de 6-12 horas, que pode ser prolongado, sob condições inflamatórias. Neutrófilos não estimulados têm limitado actividade anti-tumorigénica, uma característica que pode ser adquirido por exposição dos neutrófilos sem tratamento prévio para as quimiocinas IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 6,19 ou artificialmente, expondo-as ao forbol de éster de forbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) 6. A meia-vida curta de neutrófilos do sangue em conjunto com o baixo número de neutrófilos (~ 3-5 x 10 5) obtido a partir de 1 ml de sangue de um naïve 6-8 week rato velho, tornaramdifícil explorar a função de neutrófilos circulantes rato in vitro. Para superar esta dificuldade, outras fontes têm sido usadas. Por exemplo, um grande número de neutrófilos podem ser obtidas da medula óssea ou do peritoneu 20 após a indução da inflamação estéril (por exemplo, após injecção intraperitoneal de tioglicolato ou Zimosan A). Deve notar-se que os neutrófilos obtidos a partir da cavidade peritoneal não exercem qualquer actividade anti-tumorigénico (observação não publicada). . Granot et al 6 observaram que os ratos BALB / c inoculados ortotopicamente com o rato linha celular de carcinoma da mama 4T1 desenvolver neutrofilia que agrava com a progressão do tumor 6 (Figura 2A), de tal modo que 20-40.000.000 neutrófilos do sangue pode ser facilmente isolado a partir de 1 ml de sangue 3 - 4 semanas pós-inoculação do tumor. Estes neutrófilos ter adquirido as actividades anti-tumorais, e tem sido nesse sentido coineutrófilos NED arrastado-tumorais (RTE), a fim de distingui-los dos neutrófilos ingênuos 6 (Figura 2B). Enquanto os neutrófilos de alta densidade (HDN, Figura 1A) são altamente anti-tumorigénica, neutrófilos baixa densidade (LDN, Figura 1B) geradas no contexto de cancro não são 21. Além disso, os neutrófilos de alta densidade a partir da medula óssea e baço de ratinhos portadores de tumor têm uma actividade anti-tumoral (dados não publicados). Deve notar-se que, com a progressão do tumor torna-se gradualmente alargada baço (esplenomegalia), com quantidades crescentes de neutrófilos. Deve-se notar que RT também são gerados em outros modelos de cancro, incluindo ambos os tumores mamários (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 e K-ras tumores pulmonares motrizes) espontâneos e injectado (AT-3 de ratinho (MMTV-PyMT) e carcinoma da mama E0771 células, LLC Lewis células de carcinoma de pulmão e células de melanoma B16-F10). No entanto, a extensão da mobilização de neutrófilos nestes tumou modelos é muito menos do que de ratos 4T1-inoculadas, atingindo 5-10 x 10 6 neutrófilos em 1 ml de sangue após 3 semanas.

<table><tbody><tr><td>LINHAS CELULARES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células de carcinoma de mama de camundongo 4T1</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539 Meio de</td><td>crescimento: DMEM + 10% inativado por calor FBS</td></tr><tr><td>PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS Placa</td> de Cultura de Tecidos de 24 poços<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Placa de Cultura de Tecidos <td>Estéril</td> <td>Falcon</td><td>353047</td></tr><tr><td>100 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>25 cm2 Frasco de Cultura de Tecidos</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>90 mm Prato de Cultura de Grau Bacteriano&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>20090-01-017</td><td>Tubo de</td></tr><tr><td>Centrífuga Cônico Estéril de 15 ml&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835015-40-111</td><td>Tubo de</td></tr><tr><td>Centrífuga Cônico Estéril de 50 ml&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835050-21-111</td><td>Tubo de</td></tr><tr><td>Poliestireno de Fundo Redondo Falcon 12 x 75 mm Estéril&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>Placa de Migração Millicell Estéril</td></tr><tr><td>24 com um tamanho de poro de 5&mu; m&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Poço de Fundo Plano Branco Estéril 96-Flat-Bottom&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>Filtro de Células Estéreis</td></tr><tr><td>(40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>20G x 1.5" Agulha</td><td>BD Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>Agulha Estéril</td></tr><tr><td>23G x 1"&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>25G x 5/8" Agulha&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>Seringa Estéril</td></tr><tr><td>de 0,3 ml com Agulha de 30G x 8mm</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>Clipes Estéreis</td></tr><tr><td>de 9 mm&nbsp;</td><td>BD, AutoClip&nbsp;</td><td>427631</td><td>Ímã EasySep Estéril</td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Coluna de Separação MACS LS <td>18000</td><td></td> <td>da STEMCELL Technologies</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>Ímã Separador MidiMACS Estéril</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de Vidro para Microscópio&nbsp;</td><td>Menzel-Gl&auml; ser Superfrost&nbsp; Agitador Orbital Plus Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sky line, Leitor de Placas ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA), fração V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxiuridina (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>CFSE (5-(e 6-)-Carboxifluoresceína diacetato, éster succinimidílico)</td><td>Sondas Moleculares</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Sal de Heparina sódica da mucosa intestinal suína&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Altamente tóxico, manuseie com cuidado</td></tr><tr><td>Tioglicolato em pó&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>MÍDIA E SUPLEMENTOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td> <td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; Reduzi o meio sérico</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 médio</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Soro bovino fetal estéril</td></tr><tr><td>(FBS), inativado por calor</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>L-glutamina estéril</td></tr><tr><td></td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td> estéril <td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-042-1B</td><td>Penicilina Estreptomicina</td></tr><tr><td>x 1000 solução</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-031-5</td> Solução <td></td></tr><tr><td>salina tamponada com fosfato estéril (PBS) sem Mg2+ e Ca2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-1</td><td>PBS estéril</td></tr><tr><td>x 10 sem Ca2+ e Mg2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-5A</td><td>Água de grau HPLC estéril</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>SOLUÇÕES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK &ndash; Tecnologias de Vida de Cloreto de Amônio-Potássio</td><td></td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bromodeoxiuridina (BrdU) (10 mg/ml) em PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolver 10 mg de BrdU em 1 ml de PBS e filtro estéril.</td></tr><tr><td>CFSE, 5 mM em DMSO</td><td></td><td></td><td>Dissolva 2,8 mg de CFSE em 1 ml de DMSO. Divida em alíquotas de 10 ml em tubos estéreis de 200 ml e guarde no escuro a -20oC.</td></tr><tr><td>Solução de eosina Y</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hanks</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td>Heparina estéril</td></tr><tr><td>, 20 mg/ml em PBS</td><td></td><td></td><td>Dissolva 100 mg de heparina em 5 ml de PBS estéril e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td>Filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Tampão de lise de cultura de células de luciferase x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Diluir 1:5 em água estéril antes de usar.</td></tr><tr><td>Solução de ensaio de luciferase</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>Contém pó de substrato de ensaio de luciferase (E151A) e tampão de ensaio de luciferase (E152A)</td></tr> <tr><td>Solução de hematoxilina de Mayer&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0,5% BSA</td><td></td><td></td><td>Dissolva 2,5 g de BSA em 500 ml de PBS e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Dissolva 1g de BSA em 100 ml de PBS e filtre estéril através de um filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>5x PBS com 2,5% de BSA</td><td></td><td></td><td>Dissolva 12,5g de BSA em uma mistura de 250 ml de água estéril de grau HPLC e 250 ml de PBSx10 e filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>PBS contendo 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA</td><td></td><td></td><td>Dissolva 250 mg de BSA em 50 ml de PBS estéril e adicione 200 ml de EDTA 0,5M pH 8,0, filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Tampão FACS (PBS contendo 0,5% de BSA, 2 mM de EDTA e 0,02% de NaN3)</td><td></td><td></td><td>Dissolver 250 mg de BSA em 50 ml de PBS estéril e adicionar 200 ml de EDTA 0,5M pH 8,0 e 500 ml de 2% de NaN3, filtro estéril através de um filtro de 0,2 mm.</td></tr><tr><td>Solução salina (0,9% de NaCl)</td><td></td><td></td><td>Dissolver 9 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave</td></tr><tr><td>0,2% de solução</td><td></td><td></td> de NaCl <td>Dissolver 2 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave</td></tr><tr><td>1,6% de solução</td><td></td><td></td> de NaCl <td>Dissolver 16 g de NaCl em 1.000 ml de ddw, autoclave</td></tr><tr><td>2% de azida de</td><td></td><td></td> sódio <td>Dissolver 1g de azida de sódio em 50 ml de ddw estéril, manter a 4oC. Altamente tóxico.</td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td>de tioglicolato a 3%</td><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Dissolva 3 g de pó de tioglicolato em 100 ml de ddw. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Ferva até que a solução fique amarela e autoclave.</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Diluir 1:10 em PBS para obter uma solução de 0,04%.</td></tr><tr><td>Solução de tripsina B&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-046-1</td><td>Estéril</td></tr><tr><td>1 mg / ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Ressuspenda 1 mg Zymosan A em 1 ml de PBS estéril em um tubo Eppendorf. Vortex vigorosamente e incubar o tubo a 37 oC por 30 min. Não autoclave. Prepare a solução recentemente antes de usar.</td></tr><tr><td>KITS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de seleção EasySep PE</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de seleção EasySep PE&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>as nanopartículas magnéticas EasySep&nbsp;</td>Kit MicroBead de mouse Anti-Ly6G <td>da STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Enriquecimento de Neutrófilos de Camundongo EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Enriquecimento de Neutrófilos Humanos EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>Kit de fluxo FITC BrdU</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>559619</tr><tr><td>Kit de isolamento de neutrófilos MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de fagocitose&nbsp;</td><td>Cayman Chemical Company&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>ANTICORPOS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo bloqueador FcR&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Purificado anticorpo anti-Ly6G de rato&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551459</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>anticorpo Ly6G de rato conjugado com PE e anticorpo&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>Anti-camundongo de rato conjugado com FITC Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 rato anti-rato Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>violetFluor 450-conjugado rato anti-camundongo Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>Rat conjugado com FITC rato anti-camundongo CD11b</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Camundongo anti-camundongo conjugado com FITC Ly-6G e Ly-6C (GR-1)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>Clone RB6-8C5</td></tr><tr><td>Rato conjugado com PE anti-camundongo CD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-camundongo de rato conjugado com FITC F4/80&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>camundongo conjugado com FITC anti-humano CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>Anticorpo de controle de isotipo de rato purificado (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553927</td><td>Clone R35-95</td></tr><tr><td>LEAF purificado anticorpo anti-rato CD3e para hamster armênio</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11</td></tr></tbody></table>

isolamento e caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Os neutrófilos, o mais abundante de todas as células brancas do sangue na circulação humana, desempenham um papel importante na defesa do hospedeiro contra microorganismos invasores. Além disso, os neutrófilos desempenham um papel central na vigilância imunológica de células de tumor. Eles têm a capacidade de reconhecer as células tumorais e induzir a morte da célula do tumor quer através de um mecanismo dependente do contacto da célula que envolve peróxido de hidrogénio ou através de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). Os neutrófilos com actividade anti-tumor pode ser isolado a partir de sangue periférico de doentes de cancro e de ratinhos portadores de tumor. Estes neutrófilos são denominados neutrófilos arrastado-tumorais (RTE) para distingui-los dos neutrófilos de indivíduos saudáveis ​​ou camundongos ingênuos que mostram nenhuma atividade citotóxica significativa tumor. Comparado com outras células brancas do sangue, os neutrófilos mostram flutuabilidade diferente tornando viável para obter a&gt; 98% da população de neutrófilos puro quando submetido a um gradiente de densidade. No entanto, para alémpara a população de neutrófilos de alta densidade normal (HDN), em doentes com cancro, em ratinhos portadores de tumor, bem como em condições inflamatórias crónicas, as populações de neutrófilos baixa densidade distintas (LDN) aparecem na circulação. LDN co-purificar com a fracção de células mononucleares e pode ser separado a partir de células mononucleares usando tanto estratégias de selecção positiva ou negativa. Uma vez que a pureza dos neutrófilos isolados é determinada por citometria de fluxo, que pode ser utilizado in vitro e in vivo em ensaios funcionais. Nós descrevem técnicas para a monitorização da actividade anti-tumoral de neutrófilos, a sua capacidade para migrar e para a produção de espécies reactivas de oxigénio, bem como a monitorização da sua capacidade fagocítica ex vivo. Nós descrevemos mais técnicas para rotular os neutrófilos para rastreamento in vivo, e para determinar a sua capacidade anti-metastático in vivo. Todas estas técnicas são essenciais para a compreensão de como obter e caracterizar os neutrófilos com anti-tumoralfunção.

Em um estudo recente, identificamos uma função anti-metastático para os neutrófilos 6. Os neutrófilos de ratinhos portadores de tumores adquirem um fenótipo citotóxico e têm a capacidade de matar células tumorais 6. Isto está em contraste com os neutrófilos a partir de ratinhos ingénuos que não têm efeito anti-tumoral significativa 6. Várias das técnicas descritas na secção Protocolo têm sido utilizados para estudar a função dos neutrófilos anti-tumoral in vitro e in vivo 6...

Os neutrófilos desempenham um papel importante não apenas na defesa do hospedeiro contra microrganismos invasores, mas também estão envolvidos na vigilância imunológica das células tumorais. Aqui, descrevemos técnicas relacionadas ao isolamento de neutrófilos com propriedades antitumorais e métodos para monitorar a função de neutrófilos antitumorais in vitro e in vivo.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a função dos neutrófilos no câncer. Isso é realizado primeiramente obtendo-se o sangue periférico. Na segunda etapa, os neutrófilos são purificados em um gradiente de densidade, seguido por co-cultivo durante a noite.Com células tumorais marcadas com luciferase, a atividade da luciferase nas células é então quantificada. Em última análise, a quantidade de luciferase em cada co-cultura pode ser inversamente correlacionada à citotoxicidade dos neutrófilos dentro de cada co-cultura. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a separação de neutrófilos baseada em anticorpos e outros métodos para avaliar a viabilidade celular, é que este procedimento minimiza a ativação inespecífica dos neutrófilos e permite a medição da viabilidade celular sem o uso de marcadores radioativos.Demonstrar este procedimento será, ele tem um estudante de pós-graduação no meu laboratório, e o Dr. Simoni, um pesquisador pós-doutorando no meu laboratório. Para isolar neutrófilos de um camundongo com tumor, comece diluindo um mililitro de sangue obtido por punção cardíaca em PBS contendo 0,5% de BSA até um volume final de seis mililitros. Em seguida, adicione três mililitros de sacarose estéril filtrada a 1,119 gramas por mililitro na parte inferior de um tubo cônico de centrífuga de polipropileno de 15 mililitros. Depois, incline o tubo lentamente e com cuidado.Coloque três mililitros de sacarose estéril filtrada a 1,077 gramas por mililitro sobre a sacarose a 1,119 gramas por mililitro, seguido pelos seis mililitros de sangue diluído. Separe as células no gradiente de sacarose por centrifugação durante 30 minutos a 700 Gs em temperatura ambiente. Ao final da separação, a maioria dos eritrócitos estará no fundo do tubo.Os neutrófilos de alta densidade estarão ao redor da marca de três mililitros, no anel branco para vermelho na interface entre as camadas de sacarose. Enquanto isso, os leucócitos de baixa densidade estarão no anel branco na interface entre a camada de 1,077 gramas por mililitro e o PBS contendo BSA, ao redor da marca de seis mililitros; aspire a camada de P-B-S-B-S-A até cinco milímetros acima da camada de células de baixa densidade. Em seguida, utilizando uma ponteira de pipeta de um mililitro, remova as células de baixa densidade por sucção lenta, agitando suavemente as células ao mesmo tempo.Dispense as células em 30 mililitros de PBS com 0,5% de BSA. Em seguida, transfira os neutrófilos de alta densidade para um tubo separado com 30 mililitros de PBS acrescido de BSA. Da mesma forma, centrifugue ambos os conjuntos de células e, então, reconstitua os pellets em 36 mililitros de água estéril grau HPLC.Após 30 segundos, restabeleça a isotonicidade das células com nove mililitros de PBS 5X suplementado com 2,5% de BSA e centrifugue as células. Em seguida, re-suspenda as células em 10 mililitros de PBS-BSA e determine o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano. Após nova centrifugação, re-suspenda os neutrófilos no meio de incubação na densidade celular final apropriada.Para isolar os neutrófilos circulantes de um paciente com câncer. Comece misturando 10 mililitros de sangue humano heparinizado com um volume igual de 3% DExT strand T 500 em solução salina, e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para sedimentar os eritrócitos. Quando as células vermelhas tiverem sedimentado, sobreponha cuidadosamente o sobrenadante rico em leucócitos sobre 10 mililitros de sacarose a 1,077 gramas por mililitro e separe as células por centrifugação. Conforme acabou de ser demonstrado, os neutrófilos humanos de alta densidade estarão presentes no pellet, enquanto os neutrófilos de baixa densidade co-purificarão com os monócitos e linfócitos na interface entre a camada de sacarose a 1,077 gramas por mililitro e o plasma.Após coletar os neutrófilos conforme demonstrado anteriormente, dilua as células em 10 mililitros de cloreto de sódio 0,2% durante 30 segundos para lisar os eritrócitos contaminantes. Em seguida, adicione 10 mililitros de cloreto de sódio 1,6% para restabelecer a isotonicidade das células e inverta o tubo uma vez para misturar. Centrifugue as células e lave o sedimento três vezes em 20 mililitros de HBSS.Em seguida, conte as células e re-suspenda-as em RPMI 1640, suplementado com 2% de FBS, na densidade celular apropriada. Para isolar neutrófilos recrutados por tioglicolato ou Xan. Use uma seringa tuberculina com agulha de 23 graus e uma polegada para administração intraperitoneal.Injete um mililitro da solução apropriada no abdômen do camundongo. De quatro a 24 horas depois, injete cinco mililitros de PBS estéril no peritônio do animal eutanasiado com uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de 25 graus e cinco oitavos de polegada. Massageie suavemente o peritônio e, em seguida, aspire novamente o fluido para a seringa para coletar as células do exsudato peritoneal.Lave as células em RPMI 1640, meio suplementado com 10% de FBS. Em seguida, para remover os macrófagos, incube um vez 10 à sexta potência de células por mililitro em uma placa de cultura de tecidos contendo meio suplementado com FBS por duas horas a 37 graus Celsius. Para corar os neutrófilos isolados, reconstitua uma vez 10 à quinta potência das células em alíquotas de 50 microlitros de PBS e centrifugue as suspensões celulares em um adaptador para preparação de camada fina de células a 150 Gs. Após cinco minutos, separe as lâminas de vidro pré-rotuladas do adaptador, fixe e cora as células.Em seguida, lave as lâminas 15 vezes em água da torneira. Deixe as lâminas secarem ao ar novamente e, então, examine as células em um microscópio óptico para avaliar a atividade anti-tumoral dos neutrófilos. Dilua cinco vezes 10 à quarta potência de células tumorais marcadas com luciferase por mililitro em meio com soro reduzido otimizado, suplementado com 0,5% de FBS.Em seguida, semeie cinco vezes 10 à terceira de células tumorais em 100 microlitros de meio otimizado com soro reduzido contendo 0,5% de FBS em cada poço de uma placa de cultura tecidual branca de 96 poços com fundo plano. Quatro horas depois, adicione um vezes 10 à quinta de neutrófilos em 50 microlitros de meio otimizado com soro reduzido contendo 0,5% de FBS a cada poço para uma incubação noturna. Na manhã seguinte, aspire suavemente o sobrenadante e lave cada poço com 200 microlitros de PBS.Em seguida, aspire o PBS e adicione 50 microlitros de tampão de lise passiva a cada poço. Incube então a placa coberta com papel alumínio em agitador orbital a 150 RPM em temperatura ambiente. Após 20 minutos, carregue a placa no leitor de luminiscência.Injete 50 microlitros de solução do ensaio de luciferase em cada poço e leia a quimioluminescência durante 10 segundos por poço. Finalmente, utilize a fórmula para calcular a porcentagem de lise tumoral a fim de testar o grau de citotoxicidade de neutrófilos neste experimento representativo de uma vez 10 à quinta. Os neutrófilos foram cultivados em co-cultura com células-alvo 4T1 que expressam luciferase, conforme acabou de ser demonstrado em co-culturas com neutrófilos purificados de camundongos livres de tumor.Observou-se muito pouca morte das células tumorais. Neutrófilos purificados de camundongos portadores de tumor, no entanto, exibiram um nível significativo de citotoxicidade para testar as propriedades imunossupressoras dos neutrófilos de baixa e alta densidade. O número de linfócitos T esplênicos positivos para CD oito após estimulação com anti-CD três ou anti-CD três mais neutrófilos de baixa ou alta densidade foi avaliado após ativação com anti-CD três.Um aumento acentuado nas células CD8 positivas foi observado. No entanto, o co-cultivo com neutrófilos de baixa densidade induziu uma redução acentuada nas células CD8 positivas, um efeito que não foi observado na presença de neutrófilos de alta densidade. A extensão da retenção de CFSE também foi avaliada como indicador de proliferação.Observe o deslocamento para a esquerda na população de células tratadas com anti-CD3 e nas células tratadas com anti-CD3 cultivadas na presença de neutrófilos de alta densidade, demonstrando em ambos os casos um aumento na proliferação de células CD8 positivas. Após este procedimento, outros métodos, como a medição de explosão oxidativa, fagocitose ou migração, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como: como a função dos neutrófilos é afetada em diferentes cenários patológicos?

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo para o isolamento de populações altamente purificados de leucócitos que infiltram tumores. Este protocolo é adaptado a partir do Biotech Miltenyi protocolo para aumentar o rendimento e grau de pureza para o isolamento de células a partir de tecido de tumor complexo.

Isolamento de células imunes de tumores primários

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de neutrófilos citotóxicos de alta densidade e neutrófilos de baixa densidade do sangue de um camundongo portador de tumor por centrifugação descontínua com gradiente de sacarose.

Isolamento de neutrófilos citotóxicos de sangue de camundongo portador de tumor

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar neutrófilos associados a tumores (TANs) antiangiogênicos. Ao tomar um tumor de melanoma murino contendo TANs pró-angiogênicos, as células individuais são isoladas usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e tratadas com um inibidor da nicotinamida fosforibosil transferase (NAMPT) para reduzir a capacidade de estimular a angiogênese.

Geração de neutrófilos antiangiogênicos associados a tumores

Os neutrófilos são o tipo mais abundante de glóbulos brancos. O isolamento de neutrófilos do sangue humano pelo método de separação por gradiente de densidade e a diferenciação de células promielocíticas humanas (HL60) ao longo da via granulocítica são descritos aqui; testar seu papel na sensibilidade das células do linfoma aos agentes antilinfoma.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Novos protocolos são descritos aqui para isolar e caracterizar micropartículas derivadas de humanos e neutrófilos de rato. Estes protocolos utilizam ultracentrifugação, citometria de fluxo e immunoblotting técnicas para analisar o conteúdo de micropartículas, e eles podem ser usados para estudar o papel das micropartículas derivados de vários tipos de células na função celular.

Isolamento e caracterização de micropartículas de neutrófilos-derivado para estudos funcionais

Aqui, apresentamos um método no qual neutrófilos baixa densidade humanos (LDN), recuperados do líquido de lavagem peritoneal pós-operatórias, produzem maciço dos neutrófilos extracelulares armadilhas (redes) em armadilha eficientemente as células do tumor gratuito que crescem posteriormente.

Neutrófilos armadilhas extracelulares geradas pela baixa densidade neutrófilos obtidos de fluido de lavagem Peritoneal mediato fixação e crescimento de células de Tumor

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de40 MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.

O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

Aqui, nós mostramos o potencial terapêutico de neutrófilos tumor-associados antiangiogénicos após sua transferência em ratos tumor-tendo. Este protocolo pode ser utilizado para manipular a atividade de neutrófilos ex vivo e posteriormente avaliar sua funcionalidade in vivo no desenvolvimento de tumores. É um modelo adequado para o estudo de potenciais imunoterapias à base de neutrófilos.

Transferência de neutrophils tumor-associados manipulados em ratos do tumor-rolamento para estudar seu potencial angiogênico em vivo

Este protocolo detalha um método para o isolamento de neutrófilos de sangue inteiro, casacos de buffy ou membranas de leucemia, alcançando bom rendimento, alta pureza e ativação celular mínima. Utilizamos purificação de gradiente, sedimentação de glóbulos vermelhos (RBC) e lise RBC para obter uma preparação de neutrófilo de alta qualidade/pureza.

Isolamento de neutrófilos humanos de whole blood e buffy coats

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Aqui, fornecemos uma abordagem confiável para isolar neutrófilos de baixa e normal densidade de sangue total usando isolamento magnético (seleção negativa) e meio de gradiente de densidade descontínuo. Ele garante o isolamento intocado de células de alta pureza (≥93%), facilitando a análise precisa a jusante das subpopulações de neutrófilos, cruciais para entender seus papéis na saúde e na doença.

O Isolamento e Caracterização de Neutrófilos de Baixa e Densidade Normal do Sangue Total

Aprenda a isolar neutrófilos com propriedades anti-tumorais usando gradiente de densidade e co-cultura com células tumorais marcadas com luciferase. Este método minimiza a ativação inespecífica e avalia a citotoxicidade sem rádio.

Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

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