Isolamento e Caracterização de neutrófilos com propriedades anti-tumorais

O objetivo geral deste procedimento é estudar a função dos neutrófilos no câncer. Isso é feito obtendo primeiro o sangue periférico. Na segunda etapa, os neutrófilos são purificados em um gradiente de densidade seguido de co-cultura durante a noite.

Com as células tumorais marcadas com luciferase, a atividade da luciferase das células é então quantificada. Em última análise, a quantidade de luciferase em cada co-cultura pode ser inversamente correlacionada com a citotoxicidade dos neutrófilos dentro de cada co-cultura. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como separação de neutrófilos baseada em anticorpos e outros métodos para avaliar a viabilidade celular, é que esse procedimento minimiza a ativação não específica de neutrófilos e permite a medição da viabilidade celular sem o uso de marcadores radioativos.

Demonstrando este procedimento será, ele tem um dar um estudante de pós-graduação em meu laboratório, e Dr.Simoni, um pós-doutorado em meu laboratório Para isolar neutrófilos de um camundongo portador de tumor, comece diluindo um mililitro de sangue obtido por punção cardíaca em PBS contendo 0,5% BSA para um volume final de seis mililitros. Em seguida, adicione três mililitros de sacarose filtrada estéril a 1,119 gramas por mililitro no fundo de um tubo de centrífuga cônico de polipropileno de 15 mililitros. Em seguida, incline o tubo lenta e cuidadosamente.

Coloque três mililitros de 1.077 gramas por mililitro de sacarose filtrada estéril em cima dos 1.119 gramas por mililitro de sacarose, seguidos pelos seis mililitros de sangue diluído. Separar as células do gradiente de sacarose por centrifugação durante 30 minutos a 700 Gs à temperatura ambiente. Com a quebra no final da separação, a maioria dos eritrócitos estará no fundo do tubo.

Os neutrófilos de alta densidade estarão em torno da marca de três mililitros no anel branco a vermelho na interface entre as camadas de sacarose. Enquanto os leucócitos de baixa densidade estarão no anel branco na interface entre a camada de 1,077 gramas por mililitro e a BSA contendo PBS em torno da marca de seis mililitros, aspirar a camada P-B-S-B-S-A até cinco milímetros acima da camada celular de baixa densidade. Em seguida, usando uma ponta de pipeta de um mililitro, remova as células de baixa densidade por sucção lenta enquanto gira lentamente as células.

Dispense as células em 30 mililitros de PBS com 0,5% BSA. Em seguida, transfira os neutrófilos de alta densidade para um tubo separado com 30 mililitros de PBS mais BSA. Da mesma forma, gire os dois conjuntos de células e, em seguida, ressuspenda os pellets em 36 mililitros de água estéril de grau HPLC.

Após 30 segundos, restaure a isotonicidade das células com nove mililitros de cinco XPBS suplementados com 2,5% de BSA e gire as células. Novamente, suspenda novamente as células em 10 mililitros de P-B-S-B-S-A e determine o número de células viáveis por exclusão de trian blue. Em seguida, após outra centrifugação, suspender os neutrófilos em meio de incubação na densidade celular final apropriada.

Para isolar os neutrófilos circulantes de um paciente com câncer. Comece misturando 10 mililitros de sangue humano heparinizado com um volume igual de fita 3%DExT T 500 em solução salina por uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente para sedimentar os eritrócitos quando os glóbulos vermelhos se assentarem, coloque lentamente o sobrenadante rico em leucócitos sobre 10 mililitros de 1.077 gramas por mililitro de sacarose e separe as células por centrifugação. Como acabamos de demonstrar, os neutrófilos humanos de alta densidade estarão presentes no palato, enquanto os neutrófilos de baixa densidade se purificarão com os monócitos e linfócitos na interface entre a camada de sacarose de 1,077 gramas por mililitro e o plasma.

Depois de coletar os neutrófilos como acabamos de demonstrar, dilua as células em 10 mililitros de cloreto de sódio a 0,2% por 30 segundos para remover os eritrócitos contaminantes. Em seguida, adicione 10 mililitros de cloreto de sódio a 1,6% para restaurar a isotonicidade das células e inverta o tubo uma vez para misturar. Gire as células e lave o pellet três vezes em 20 mililitros de HBSS.

Em seguida, conte as células e ressuspenda-as em RPMI 1640, suplementado com 2% de FBS na densidade celular apropriada. Para isolar thi glico ou Xan elicitou neutrófilos. Use uma seringa de tuberculina com uma agulha de calibre 23 de uma polegada para intraperitoneal.

Injete um mililitro da solução apropriada no abdômen do camundongo. Quatro a 24 horas depois, injete cinco mililitros de PBS estéril no peritônio do animal sacrificado com uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 25 e cinco oitavos. Massageie suavemente o peritônio e, em seguida, redesenhe o fluido de volta para a seringa para coletar as células do exsudato peritoneal.

Lave as células em RPMI 1640, meio suplementado com 10% de FBS. Em seguida, para remover os macrófagos, incube de 10 a seis células por mililitro em uma placa de cultura de tecido contendo meio suplementado com FBS por duas horas a 37 graus Celsius. Para corar os neutrófilos isolados, resus suspenda uma vez 10 elevado a um quinto das células em alíquotas de 50 microlitros de PBS e gire as suspensões celulares em um adaptador de preparação de células de camada fina a 150 Gs. Após cinco minutos, separe as lâminas de vidro pré-marcadas do adaptador, fixe e core as células.

Em seguida, lave as lâminas 15 vezes em água da torneira. Deixe as lâminas secarem ao ar novamente e, em seguida, inspecione as células sob um microscópio óptico para avaliar a atividade antitumoral dos neutrófilos. Diluir cinco vezes 10 elevado à quarta luciferase de células tumorais marcadas por mililitro em meio sérico reduzido otimizado, suplementado com 0,5% de FBS.

Em seguida, semeie cinco vezes 10 elevado ao terço das células tumorais em 100 microlitros de meio de soro reduzido otimizado contendo 0,5% FBS em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano branco de 96 poços. Quatro horas depois, de uma só vez, 10 a quinto neutrófilos em 50 microlitros de meio sérico reduzido otimizado contendo 0,5% FBS para cada poço para uma incubação noturna. Na manhã seguinte, aspire suavemente o sobrenadante e lave cada poço com 200 microlitros de PBS.

Em seguida, aspire o PBS e adicione 50 microlitros de tampão de lise passiva a cada poço. Em seguida, incubar a placa coberta com papel alumínio em um agitador orbital a 150 RPM à temperatura ambiente. Após 20 minutos, coloque a placa no leitor de placas de luminescência.

Injete 50 microlitros de solução de ensaio de luciferase em cada poço e leia a luminescência química por 10 segundos por poço. Finalmente, use a fórmula para calcular a porcentagem de lise tumoral para testar a extensão da citotoxicidade dos neutrófilos neste experimento representativo uma vez 10 elevado a quinto. Os neutrófilos foram co-cultivados com luciferase expressando quatro células-alvo T, como acabamos de demonstrar em coculturas com neutrófilos purificados de camundongos livres de tumor.

Muito pouca morte das células tumorais foi observada. Os neutrófilos purificados de camundongos portadores de tumor, no entanto, exibiram um nível significativo de citotoxicidade para testar as propriedades imunossupressoras dos neutrófilos de baixa e alta densidade. O número de células T esplênicas positivas para CD oito após estimulação com neutrófilos de baixa ou alta densidade anti CD três ou anti CD três mais baixa ou alta densidade.

Um aumento dramático nas oito células positivas para CD foi observado. A co-cultura com neutrófilos de baixa densidade, no entanto, induziu uma redução notável nas oito células positivas para CD, um efeito que não foi observado na presença dos neutrófilos de alta densidade. A extensão da retenção de CFSE também foi avaliada como um indicador de proliferação.

Observe o deslocamento da palavra esquerda nas células tratadas anti CD três e as células tratadas anti CD três cultivadas na presença de neutrófilos de alta densidade, demonstrando em ambos os casos um aumento na proliferação de células CD oito positivas. Seguindo este procedimento. Outros métodos, como medir explosões oxidativas, fagocitose ou migração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: como a função dos neutrófilos é afetada em diferentes cenários patológicos?