Name: Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Aprenda o método qPCRTag de alta vazão para genotipagem de cromossomos sintéticos de levedura sem eletroforese em gel. Este protocolo reduz o tempo de análise para cerca de uma hora.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Grant MCB-0718846 e Defesa Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de contrato N66001-12-C-4020 (para JDB). LAM foi financiado por uma bolsa de pós-doutorado de Ciências Naturais e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia. A publicação deste artigo é patrocinado pela Roche.

1. Prepare O ADN genómico de levedura (ADNg) <ol><li> Preparar um estoque de tampão de lise de levedura 9 que contém 50 mM de Tris, pH 8,0, NaCl 100 mM, SDS a 1% (w / v), 2% de Triton X-100 (v / v), EDTA 1 mM, pH 8,0. </li><li> Como iniciar a utilização da matéria ~ 2 x 10 6 células, que geralmente corresponde a ~ 100 mL de cultura saturada para as estirpes de laboratório do BY4741 10 fundo. As células em cultura devem ser colhidas por centrifugação a 1000 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Aspirar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de lise de levedura e ressuspender o sedimento de células por pipetagem. </li><li> Adicionar ~ 300 ul de ácido lavou-se contas de vidro de tal modo que o nível de grânulos é de cerca de 1 mm abaixo do nível da suspensão de células. </li><li> Numa hotte adicionar 200 ul de fenol / clorofórmio / álcool isoamílico (25: 24: 1). Tapar o tubo de microcentrífuga e garantir que não há pérolas está preso entre a tampa eo tubo de como isso irá resultar em vazamentos durante a agitação(Passo 1.6). Inverta 3 vezes para misturar e verificar a tampa é fechada. </li><li> Agitar o tubo durante 10 minutos à temperatura ambiente utilizando um misturador de bancada, tal como um Eppendorf 5432. </li><li> Centrifugar a 20.800 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferência de 75 ul da fase aquosa para um novo tubo de microcentrifuga contendo 1 ml de etanol a 100%. Inverta 10 vezes para misturar. </li><li> Sedimentar o ADN por centrifugação a 20.800 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem desalojar o sedimento de DNA. Lavar o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. </li><li> Centrifugar a 20.800 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante sem desalojar o sedimento de DNA e ar-secar o sedimento com o tampão de microcentrífuga aberta até que o excesso de etanol foi evaporado, o que geralmente é de cerca de 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de ADN em 75 ul de Tris 10 mM pH 7,4 e vortex para misturar. Armazenar a amostra a -20 ° C indefinidamente. Medir a concentração de ADN na amostra usando umfluorímetro de bancada, tal como o Qubit, que o distingue do ADN a partir do ARN. Certifique-se de que a concentração final de ADNg é ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Prepara-se uma diluição de 1:10 utilizando ADN genómico de água e agitar com vortex para misturar. </li><li> Aliquota de 30 ul de ADNg diluído ao poço adequado de uma placa de fonte que é compatível com um distribuidor de líquido acústico nanoescala (passo 3). Se estiver usando um Labcyte Eco 550, usar uma placa de polipropileno de 384 cavidades (placa 384PP). NOTA: Quando selado adequadamente esta placa pode ser armazenada durante pelo menos um mês à temperatura de -20 ° C. </li></ol> 2. Preparar e Dispense qPCR Master Mix em um 1536 placa com múltiplas cavidades <ol><li> Prepare 850 mL de qPCR mistura principal, como LightCycler 1536 DNA verde Mestre, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e vortex para misturar. Centrifugar a mistura principal qPCR durante 2 minutos a 20,800 xg à temperatura ambiente para remover quaisquer bolhas. Os componentes da mistura principal qPCR necessária para uma única placa de poços múltiplos 1536 são como seguems: <ol><li> Combine 170 ul de mistura principal enzima (verde Mestre Tubo 1, concentrado 5x), 42,5 ul de SYBR (verde Mestre tubo 4, 20x concentrado), e 637,5 mL de água. </li></ol></li><li> Dispensar 500 nl / poço em uma placa com múltiplas cavidades 1536 utilizando um dispensador de granéis líquidos, como o Art Robbins Cobra. (Note que os passos 2.2.1-2.2.4 se referem especificamente à Cobra.) <ol><li> Criar um programa de distribuição com as seguintes configurações: classe líquido, água; o volume aspirado, 800 ul; dispensar volumes, 500 nl; tempo de lavagem, 20 seg. Nas configurações do dispensador, verificar a velocidade de distribuição é definido para 49,6 mm / s, o deslocamento de distribuição é de 0,25 mm e o excesso de líquido aspirado será dispensado de volta para a fonte bem. </li><li> Coloque o tubo de microcentrífuga contendo a mistura principal qPCR no poço A1 do suporte do tubo de microcentrífuga, que está localizado em posição deck 1. Corte a tampa do tubo de microcentrífuga ou simplesmente deixá-la aberta. Defina o &#39;Aspirar bem&#39; para A1, editando o Aspiratdefinições e. </li><li> Executar uma etapa de lavagem antes da dispensa qPCR mistura principal por primeiro a aspirar e dispensar-seleção de etapas do programa criado no passo 2.2.2 e, em seguida, bater &#39;run&#39;. Uma vez completo, re-selecionar o aspirado e dispensar etapas antes de executar o programa completo para dispensar qPCR mistura principal. Se a Cobra foi ocioso por menos de 10 min a etapa inicial de lavagem, que serve para preparar o sistema, é desnecessário. </li><li> Hit &#39;run&#39; para dispensar qPCR master mix para cada poço. </li></ol></li><li> Recolher o master mix qPCR, na parte inferior de cada poço por breve centrifugação do 1536 placa com múltiplas cavidades (30 seg usando uma baixa velocidade PCR prato giratório). </li></ol> 3. Pipetar molde de ADN e os iniciadores para a placa 1536 Multiwell <ol><li> Dispensar 5 nl de ADNg diluída (passo 1.3) nas cavidades desejadas da placa com múltiplas cavidades 1536 usando um sistema de transferência de líquido acústico, tais como o eco 550. <ol><li> Para o echo 550, use o software Placa Reformat ou, alternativamente, fornecer um costume planilha do Excel para programar a transferência. Certifique-se a fonte selecionada para o bem gDNA no programa coincide com a fonte bem na qual você fisicamente dispensado o gDNA (passo 1.3). Escolha do Tipo de placa de origem &#39;384PP_AQ_BP2&#39;, o que indica que o líquido na placa 384PP é um tampão sem surfactantes. </li></ol></li><li> Dispensar 10 nl de iniciadores, pré-misturados para a frente e reversa para uma concentração final de 50 uM cada, nas cavidades desejadas da placa com múltiplas cavidades 1536 usando um sistema de transferência de líquido acústico, tais como o eco 550. <ol><li> Para o sistema de transferência de líquidos, use o software Placa Reformat ou, alternativamente, fornecer um costume planilha do Excel para programar a transferência. NOTA: Aqui é possível dispensar iniciadores tais que o layout da placa com múltiplas cavidades 1536 cromossómico corresponde à ordem dos iniciadores por isso é fácil de inspeccionar visualmente os resultados de PCR em tempo realdepois (passo 6). </li><li> Cereais os iniciadores numa placa que é compatível com o distribuidor de líquido acústico. Para o eco 550, usar uma placa Labcyte 384LDV (de baixo volume morto) e escolha o tipo de placa de fonte &#39;384LDV_AQ_B&#39; ao programar o eco para indicar o líquido é um buffer simples, sem proteínas. </li></ol></li></ol> 4. Seal e centrifugar a 1536 Multiwell Placa <ol><li> Utilizando um sistema de aferidor de microplacas, tal como o Plateloc Microplacas térmica Sealer, selar imediatamente a placa com múltiplas cavidades utilizando 1,536 selo opticamente claro que é compatível com o instrumento de selagem a quente. Não toque na superfície do selo para evitar marcas de sujeiras. <ol><li> Se estiver usando o Plateloc térmica Microplate Sealer, use as seguintes configurações: 2.0 sec selar tempo, temperatura do selo 162 ° C, pressão do ar de 82 psi. Este instrumento leva ~ 5 minutos para aquecer e assim deve ser ativada com antecedência. </li><li> Se estiver usando o Plateloc Microplate térmica Sealer, uma adapteR deve ser usado para elevar a altura da placa de poços múltiplos na fase 1536 do instrumento para garantir uma boa selagem. NOTA: Embora seja preferível comprar uma placa da fase para a microplaca Plateloc térmica Sealer, uma solução alternativa é inserir quatro ~ 2 mm de espessura arruelas padrão disponíveis em qualquer loja de ferragens nos cantos para levantar a altura da placa com múltiplas cavidades 1536. </li></ol></li><li> Centrifugar imediatamente a placa com múltiplas cavidades 1,536 selado a 2000 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente para recolher todos os reagentes na parte inferior de cada cavidade. </li></ol> 5. PCR em Tempo Real <ol><li> Programa de um instrumento qPCR 1536, tal como o LightCycler 1536, com um protocolo de amplificação em dois passos seguido por uma análise de curvas de fusão. Usando o software LightCycler 1536 estabeleceu um programa da seguinte forma: <ol><li> Pré-incubação: 95 ° C, 1 min a preensão, a taxa de rampa de 4,8 ° C / seg, não aquisição. </li><li> Dois passo de amplificação: 30 ciclos de [95 ° C, sem retenção,rampa taxa de 4,8 ° C / s, nenhuma aquisição; 64 ° C, 30 seg a preensão, a taxa de rampa de 2,5 ° C / seg, única aquisição]. </li><li> Derreter curva: 95 ° C, 10 seg, velocidade de rampa 4,8 ° C / seg, não aquisição; 60 ° C, 1 min, velocidade de rampa de 2,5 ° C / seg, não aquisição; 97 ° C, velocidade de rampa a 0,1 ° C / seg, 5 aquisições / ° C (contínua). </li><li> Arrefecer: 40 ° C, 30 seg, velocidade de rampa de 2,5 ° C / seg, não aquisição. </li></ol></li><li> Defina o formato de Detecção de &#39;Green intercalando Dye&#39; na guia Run Definição. </li><li> Defina o controle de pipetagem para &#39;Controle Mestre&#39; no separador Run Definição. Esta função serve como um controlo interno e detecta a presença de qPCR mistura principal em cada uma das cavidades da placa com múltiplas cavidades 1536, que é útil para identificar falsos negativos putativos. </li><li> Insira a placa com múltiplas cavidades 1536 preparado nas etapas 2-4 para o qPCR instrumento 1536 e executar o programa. </li></ol> Análise 6. Dados <ol><li> Perform inspeção visual dos dados dentro do software qPCR. NOTA: O software 1536 permite a visualização de ambos amplificação e derreter curvas, bem como um mapa de calor que mostra a chamada (positivo, negativo, inválido, N / A; Figura 2), o valor ponto de passagem (deslizante escala de cores para positivo ou cinza para negativo; Figura 3), ou um ponto de extremidade de fluorescência (EPF) valor (deslizante escala de cores). </li><li> Exportar dados do Software 1536 na forma de um arquivo .txt (resultados de mesa) ou .xml, quer com os dados brutos ou dados calculados para o processamento off-line a partir do instrumento. NOTA: O proprietário ponto de passagem automatizada (Cp) algoritmo chamando construído no software 1536 leva em conta a forma ea inclinação da curva de amplificação ao determinar chamadas de valor positivas / negativas e Cp com alta confiança, em volumes de reacção microlitro baixo sub com comparativamente baixo os valores de fluorescência. </li><li> Se o DNA LightCycler Verde Mestre estava usod para qPCR, verifique que todos os poços passou o &#39;controle mestre&#39;. Uma falha indica que o bem não recebeu qPCR mistura principal eo ponto de dados em falta deve ser considerada uma potencial falso negativo. Verifique se todos os poços passou o &#39;controle mestre&#39;. Uma falha indica que o bem não recebeu mastermix DNA e considerar o ponto de dados em falta um potencial falso negativo. </li></ol>

<ol><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
<li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-A-Gene+with+GeneDesign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

LAM, NAP, JAM e JDB têm nada a revelar. RC e AL são empregados pela Roche Life Science, EUA e trabalhou no desenvolvimento da aplicação com a LAM como parte de uma prova de princípio experimento.

Incorporação de detecção em tempo real PCR para o ensaio de genotipagem PCRTag é um desenvolvimento importante para o projeto Sc2.0 pois permite significativamente maior taxa de transferência. O fluxo de trabalho anterior especificada 2,5 ul reações em 384 placas de PCR, 1,5 horas de tempo de execução ciclismo térmica, eletroforese em gel de agarose, e de anotação manual da gel. O fluxo de trabalho apresentado aqui, chamada de análise qPCRTag, supera vários dos principais pontos de estrangulamento. Primeiro, uma corrida qPCRTag condensa 4 x 384 placas de poços em um único experimento que pode ser processado, do início ao fim (placa configurar mais tempo de execução), em cerca de uma hora. É importante notar que o custo de reagente por poço para análise qPCRTag está a par com a abordagem baseada em gel de agarose rendimento mais baixo. No entanto, por electroforese em gel de contornar e anotação manual, o fluxo de trabalho qPCRTag proporciona economias substanciais em tempo e mão de obra, que são as principais vantagens. É importante ressaltar o fluxo de trabalho é qPCRTag entirely compatível com a automatização. Uma preocupação importante com a utilização de detecção em tempo real, como a saída do ensaio PCRTag é a taxa de falsos positivos e falsos negativos. Uma vez que os iniciadores PCRTag não foram originalmente concebidas para utilização em PCR em tempo real, espera-se que nem todos os pares de iniciadores será adequado para utilização com esta saída. Para este fim, é importante para a função e validar a especificidade de todos os pares de iniciadores PCRTag para excluir o subconjunto que não funcionam no ensaio com base em tempo real na frente. Por exemplo, cromossoma 3 PCRTag falsos positivos e negativos são a-e-grande reprodutível na dados de PCR em tempo real (Figuras 2 e 3) e estes podem ser excluídos de análises posteriores. Além disso, os pares de iniciadores conhecidos para falhar (avaliada por electroforese em gel e mostrado nas Figuras S6 e S7 de Annaluru et ai. 1) também podem ser excluídas. Isto é facilmente conseguido simplesmente excluding os pares de primers com defeito ao configurar o protocolo de transferência acústica. Como a maioria dos ensaios de alto rendimento, temos a intenção de usar a detecção de PCRTag tempo real como uma tela principal para identificar transformantes que merecem uma validação adicional a jusante. Posteriormente, o padrão-ouro para o rastreio secundário permanecerá análise PCRTag com eletroforese em gel como a leitura. Além da aplicação da análise PCRTag para Sc2.0, combinando sistemas de manuseio de líquido nanoescala state-of-the-art com alta taxa de transferência de tecnologia PCR em tempo real permite a análise rápida e automatizada e tem potencial para impactar muitos campos. Por exemplo, este fluxo de trabalho pode ser aplicado a alta biblioteca throughput screening, diagnóstico de doenças infecciosas, análise microbiome, e genoma de edição de ponta se aproxima de tentar modificar loci múltiplos simultaneamente.

Sc2.0, ou o Projeto Genoma fermento sintético ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), fixou o objetivo de projetar e construir um genoma eucariota inteiramente sintético. Usando a seqüência do genoma altamente curadoria de Saccharomyces cerevisiae 3 como ponto de partida, cada um dos cromossomos lineares dezesseis foi re-projetado para atender um conjunto de princípios de design que especificam a manutenção da aptidão de células, melhorando a estabilidade do genoma, e aumentando a flexibilidade genética. Por exemplo, elementos desestabilizadores, tais como repetições são excluídos de cromossomos Sc2.0. Todos os casos de codões de paragem TAG são re-codificada para TAA para &quot;libertar-se &#39;um codão na estirpe final para a introdução de um aminoácido não geneticamente codificados. Além disso, um sistema de evolução induzível, precipitação, habilitado pelo sistema Cre-lox, permite a capacidade sem precedentes para gerar genomas derivativos com novas estruturas 4. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Outro grande elemento de design no genoma Sc2.0 é a introdução de PCRTags, que servem como marcas d&#39;água de ADN para permitir o rastreamento de DNA tipo sintético e selvagem. PCRTags são segmentos curtos, re-codificado em ORF nos cromossomos sintéticos; enquanto as sequências PCRTag diferem ao nível do ADN entre os cromossomas de tipo selvagem e sintéticos, as proteínas codificadas são idênticas em sequência de aminoácidos e assim, presumivelmente, a função. PCRTag sequências são especificamente concebidas como locais de ligação de iniciadores para facilitar a amplificação selectiva (Figura 1A). PCRTag desenho é efectuada utilizando o algoritmo &#39;mais diferente&#39; em GeneDesign 5,6, dando origem a sequências sintéticas recodificados que são tipicamente ~ 60% diferente do que as sequências nativas (mínimo 33%) com temperaturas de fusão entre 58 ° C e 60 ° C e amplicão comprimentos entre 200-500 pares de bases 2. A recodificação não é permitida dentro do primeiro 100 pb de cada ORF, uma vez que estas regiões são conhecidas portêm preferências especiais em termos de uso de códon 7. Juntas, essas regras de design favorecer alto desempenho de quase todos os PCRTags sob um único conjunto de condições de PCR em que pares de primers tipo PCRTag sintéticos e selvagens exclusivamente ligam e amplificar DNA sintético e nativo, respectivamente (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figura 1:. PCRTag esquema (A) PCRTags são sequências dentro de quadros de leitura aberta (ORF) de genes nos cromossomas Sc2.0 recodificados. (B) sintético (SYN) e do tipo selvagem (WT) iniciadores PCRTag vincular exclusivamente e amplificar DNA genómico tipo sintético e selvagem (gDNA), respectivamente. Mostrado aqui é uma análise de um segmento de ~ 30 kb do braço esquerdo do cromossomo seis, testando treze pares de primers PCRTag usando tanto WT ou semi-synVIL2 gDNA como modelo. Em muitos casos, uma única ORF codifica mais do que um PCRTag. Presença / ausência de amplicões PCRTag é avaliada através de electroforese em gel de agarose. Amplicons PCRTag variam em tamanho de 200 pb e 500 pb. As espécies que migram mais rapidamente na parte inferior dos painéis são dimeros de iniciadores. Análise PCRTag tem provado ser uma ferramenta importante para o conjunto de cromossomos Sc2.0. Numa experiência típica de 30-50 kb de ADN sintético, codificando 20-30 PCRTags, é transformado em células de levedura para substituir o tipo selvagem correspondente ADN 1,2,8. Análise PCRTag é então utilizado para identificar transformantes que codificam PCRTags tipo sintético, mas não selvagem abrangendo esse segmento de DNA, ou os chamados &quot;vencedores&quot;. Geralmente é necessário testar vários transformantes para identificar &quot;vencedores&quot;, de modo a produtividade e custo da análise PCRTag são considerações importantes. Actualmente dois cromossomas Sc2.0 foram concluídos (synIII 1 e synIXR 2), representando menos de 10% do genoma Sc2.0, altHough mais de metade dos cromossomas restantes estão actualmente em fase de síntese e montagem. A escala de análise PCRTag necessário para este projeto está rapidamente superando a capacidade de executar géis e marcar manualmente a presença de DNA sintético e ausência de DNA tipo selvagem. Para melhorar o rendimento do ensaio PCRTag temos desenvolvido um trabalho utilizando PCR em tempo real para contornar a utilização de electroforese em gel de agarose. O fluxo de trabalho faz uso de um distribuidor de líquido para distribuir grandes quantidades de qPCR mastermix em cada poço de uma placa com múltiplas cavidades 1536, um distribuidor de líquido em nanoescala acústico para transferir ADN molde e iniciadores, e um termociclador 1536 qPCR, permitindo-nos para miniaturizar reacções a 500 nl maximizar o rendimento. Além disso análise pode ser automatizado. Este tipo de protocolo de genotipagem de alto rendimento deve ser generalizado a qualquer projecto requer uma análise de vários clones em loci múltiplos.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Levedura gDNA prep</td></tr><tr><td>levedura gDNA</td> modelo <td>personalizado</td><td></td><td>personalizado para PCR em tempo real</td></tr><tr><td>Grânulos de vidro lavados com ácido (0,5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>lise de células de levedura</td></tr><tr><td>Fenol ultrapuro:Clorofórmio:Álcool isoamílico (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>lise de células de levedura</td></tr><tr><td>5432 Mixer</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>lise de células de levedura</td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>lise de células de levedura</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorômetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>quantificação de gDNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de ensaio</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>quantificação de gDNA</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP placa Labcyte</td><td></td><td>P-05525</td><td>placa de fonte de gDNA</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix preparação e dispensando</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>em tempo real PCR mastermix</td></tr><tr><td>1.5 ml Suporte de tubo de microfuga</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>suporte de tubo de microfuga para deck de Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Placa Multiwell</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra sistema de manuseio de líquidos</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>dispensa mistura mestre de qPCR em 1536 placa</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>cenrifugation de 1536 plate</td></tr><tr><td colspan="4">Template e primer dispensando</td></tr><tr><td>primers PCRTag</td><td></td><td>IDT</td><td>pré-misturados personalizados para frente e para trás, 50 &mu; M cada</td></tr><tr><td>folha de vedação perfurável TempPlate, estéril</td><td>Selo temporário USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>para placas de primer PCRTag</td></tr><tr><td>Placa de poço Labcyte LDV 384 Placa</td><td>de fonte de primer pré-misturada</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Transferência de labcyte</td><td></td><td>2.5 nl gotas de primer e DNA modelo para placa 1536</td></tr><tr><td>Seladora de Microplacas Térmica Plateloc</td><td>Agilent</td><td>G5402-90001</td><td>selo térmico para placa 1536 antes da execução LC1536</td></tr><tr><td>Selo permanente transparente</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>selo térmico opticamente transparente para placa multipoços LC1536</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche / LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>pode substituir arruelas de ~ 2 mm de espessura</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>centrífuga selada a quente placa</td></tr> <tr><td>1536Compressor de ar industrial</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>para operar o Echo and Heat Sealer</td></tr><tr><td colspan="4">PCR em tempo real</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>requer tomada de 220 V</td></tr></tbody></table>

análise qpcrtag - a high throughput, pcr em tempo real ensaio para sc2.0 genotipagem

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

O Projeto Genoma fermento sintético (Sc2.0) pretende construir 16 grife cromossomas de levedura e combiná-los em uma única célula de levedura. Até à data, um cromossoma sintético, synIII 1, e um braço cromossoma sintético, synIXR 2, foram construídos e a sua função in vivo validado na ausência dos cromossomas de tipo selvagem correspondentes. Uma importante característica do modelo de cromossomas Sc2.0 é a introdução de PCRTags, que são sequências curtas, re-codificada dentro de quadros de leitura abertos (ORFs) que permitem a diferenciação dos cromossomas sintéticos dos seus homólogos de tipo selvagem. PCRTag iniciadores emparelham selectivamente, quer cromossomas de tipo selvagem ou sintéticos e a presença / ausência de cada tipo de ADN pode ser testada usando um ensaio de PCR simples. A leitura do ensaio padrão PCRTag é avaliar a presença / ausência de produtos de amplificação por electroforese em gel de agarose. No entanto, com uma densidade PCRTag amplicão média de um por 1,5 kb e agenome tamanho de ~ 12 Mb, o genoma Sc2.0 concluído irá codificar cerca de 8.000 PCRTags. Para melhorar o rendimento, temos desenvolvido um ensaio de detecção baseado em PCR em tempo real para PCRTag genotipagem que chamamos análise qPCRTag. O fluxo de trabalho especifica 500 nl reações em uma placa com múltiplas cavidades 1536, o que nos permite testar até 768 PCRTags com dois pares de primers tipo sintéticos e selvagens em um único experimento.

Testamos sintético e selvagem tipo cromossomo 3 pares de primers PCRTag 1 com ADN genómico de levedura (gDNA) extraído de quatro estirpes diferentes. Cromossoma 3 tem 186 pares de iniciadores PCRTag que abrangem o comprimento do cromossoma (synIII é ~ 270 kb do cromossoma e tipo selvagem é 3 ~ 315 kb). Para testar cada uma das quatro cepas com ambos os conjuntos de iniciadores, que divide a placa com múltiplas cavidades em quatro quadrantes, um para cada tipo de ADNg, atribuindo PCRTag iniciadores sintéticos para a metade superior de cada quadrante e de tipo selvagem para a metade inferior. O ADN genómico foi extraído a partir das estirpes de levedura, dois dos quais codificam tipo selvagem cromossoma 3 (tipo selvagem, synIXR 2), enquanto no cromossoma dois restantes codificam sintético 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR mistura principal foi distribuído por cada poço de uma placa com múltiplas cavidades 1536 utilizando um distribuidor de líquido em massa, seguido de ADNg e PCRTag iniciadores utilizando o eco 550. Os iniciadores foram dispostas de forma idênticacada quadrante da placa com múltiplas cavidades para comparação visual fácil. A placa com múltiplas cavidades foi então selada a quente com um selo opticamente clara e sujeito a análise por PCR em tempo real. Nesta experiência observou-se qPCRTag, na sua maior parte, a amplificação como se espera, em que os iniciadores de síntese exclusivamente amplificado de ADN sintético e vice-versa (Figuras 2 e 3). No entanto, também observamos vários desvios do padrão esperado, sugerindo falsos negativos e falsos positivos no conjunto de dados. Nesta experiência, o controlo principal foi detectada em 100% dos poços, indicando a distribuição de líquido de massa dispensada com sucesso mastermix em cada poço na placa (dados não mostrados). Isto exclui uma fonte potencial de falsos negativos. Além disso, alguns cromossoma 3 PCRTags falha de forma conhecida (mostrado nas Figuras S6 e S7 de Annaluru et ai. 1), incluindo, pelo menos, 2 sin e um WTpares de iniciadores; Assim, estes poços podem ser ignorados em cada quadrante. Falsos negativos verdadeiros podem surgir a partir de uma falta de transferência de ADNg molde ou iniciadores, na nossa experiência no entanto, dada a calibração correcta do eco 550, bem como a preparação de ADNg e iniciadores tal como descrito, isto não tem sido uma das principais fontes de erro. No geral neste experimento a taxa de falsos negativos foi extremamente baixa para primers WT com modelo WT (~ 2%), embora um pouco maior para os iniciadores com SYN SYN DNA (~ 8%). Os falsos positivos, a detecção de sinal nos poços onde iniciadores SYN são misturados com WT ADNg (e vice-versa), pode surgir a partir de amplificação cruz ou dimeros de iniciadores. Com efeito, os dímeros de iniciadores são frequentemente visíveis por electroforese em gel (Figura 1B) e representam uma fonte de erro razoável. Para a aplicação de qPCR, a análise das curvas de fusão pode ser útil para determinar se diferentes espécies, tais como dimeros de iniciadores, podem estar a contribuir para um sinal. Além disso, performing uma experiência de controlo em que os iniciadores são dispensadas na ausência de molde de ADN pode ajudar a identificar os iniciadores com uma propensão para dimerizar. Cruz amplificação pode ser observado por electroforese em gel, em particular se também muitos ciclos de PCR são executadas ou se a temperatura de hibridação é muito baixa. Tentamos minimizar o número de falsos positivos devido a amplificação cruzada por meio da otimização ambos os parâmetros para o protocolo qPCRTag. Finalmente, examinando os valores de ponto de cruzamento (Cp) para cada poço pode ajudar a identificar iniciadores que não são adequados para a detecção com base em tempo real (Figura 3, por exemplo, BB22, Fb22, Bb46, Fb46). No geral neste experimento a taxa de falsos positivos foi baixa para primers SYN com modelo WT (~ 5%) e maior para primers WT com modelo SYN (~ 10%). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figura 2: Placa mapa de calor exibindo presença / abNesse aspecto chamada para um experimento qPCRTag. Quatro tipos diferentes de DNA genômico (quadrantes separados por linhas brancas sólidos) foram submetidos à análise PCRTag usando sintético (SYN) e do tipo selvagem (WT) cromossomo 3 primers PCRTag (linhas brancas tracejadas para separar SYN (topo ) e WT (parte inferior) em cada quadrante). WT e synIXR ADNg codificar tipo selvagem cromossoma 3, obtendo-se amplificação com iniciadores WT PCRTag. SynIII e synIII synIXR ADNg codificar cromossoma sintético 3, obtendo-se amplificação com iniciadores PCRTag SYN. Primers estão dispostas de acordo com sua esquerda para a direita posicionamento cromossômica e posicionado de forma idêntica nos quatro quadrantes para comparação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figura 3: Placa de calormapa visualizadas ponto de passagem de valor (Cp) para um experimento qPCRTag. Este é o mesmo conjunto de dados, como na Figura 2 e a disposição da placa é, portanto, idêntico. N / A se refere a «amplificação não &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Os cromossomos projetados do projeto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, podem ser distinguidos de suas contrapartes nativas usando um ensaio de genotipagem baseado em PCR chamado PCRTagging, que tem um endpoint de presença/ausência. Aqui, descrevemos um método de detecção de PCR em tempo real de alto rendimento para genotipagem de PCRTag.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

O objetivo geral da análise QPCR TAG é aumentar a produtividade do ensaio de genotipagem por PCR TAG do projeto de genoma sintético de levedura, implementando um sistema de detecção baseado em PCR em tempo real e reações miniaturizadas. Isso é realizado primeiramente utilizando um dispensador de líquidos em massa para distribuir a mistura mestra de QPCR em cada poço de uma placa de 1536 poços. Em seguida, um robô de ejeção acústica de gotas em escala nanométrica transfere o DNA molde e os iniciadores para os poços da placa de múltiplos poços.Em seguida, a placa é selada e as reações são realizadas em um termociclador A-Q-P-C-R. Por fim, os dados de PCR em tempo real são analisados para determinar a presença ou ausência de marcadores PCR sintéticos ou do tipo selvagem em cada locus. Em última instância, o fluxo de trabalho com marcadores de qPCR melhora o rendimento.A principal vantagem desta técnica em relação ao ensaio PCR TAG atual é que ela nos permite contornar o uso de eletroforese em gel e a anotação manual desses géis. Tivemos a ideia inicial deste método ao percebermos o quão demorado e trabalhoso seria o PCR com marcação em cromossomos mais longos. Após o cultivo e a colheita de aproximadamente 2 milhões de células de levedura, adicione 200 microlitros de tampão de lise de levedura e pipete para ressuspender.À pelota, adicione 300 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido até aproximadamente um milímetro abaixo do nível da célula, turva. Em seguida, em uma cabine de segurança, adicione 200 microlitros de fenol clorofórmio, álcool isoamílico, inverta o tubo três vezes para homogeneizar e verifique se a tampa está bem vedada. Em seguida, utilizando um agitador de bancada, agite o tubo por 10 minutos à temperatura ambiente; após centrifugação, transfira 75 microlitros da fase aquosa para um novo tubo microcêntrifuga contendo um mililitro de etanol a 100%.Inverta o tubo 10 vezes para homogeneizar após centrifugar novamente, aspire o sobrenadante sem deslocar o pellet e utilize 500 microlitros de etanol 70% para lavar o pellet. Após remover o sobrenadante, use 75 microlitros de triss 10 milimolar pH 7,4 para ressuspender o pellet e vortexie para homogeneizar. Após diluir o DNA em uma proporção de 1:10, alíquota 30 microlitros de gDNA diluído no poço apropriado de uma placa fonte para dispensação acústica de líquidos em escala nanométrica.Pré-preparar 850 microlitros de mistura mestra de QPCR em um tubo microfuga de 1,5 mililitro e vortexiar para homogeneizar. Em seguida, centrifugar uma solução a 20.800 ×g e temperatura ambiente por dois minutos para remover quaisquer bolhas. Depois, utilizando um dispensador em massa, dispensar 500 nanolitros por poço em uma placa multipoço de 1536.Recolha a mistura mestra de QPCR na parte inferior de cada poço mediante uma breve centrifugação da placa. Em seguida, utilizando o sistema acústico de transferência de líquidos e os detalhes descritos no protocolo textual, distribua cinco nanolitros de GDNA diluído e 10 nanolitros de primers direto e reverso pré-misturados a 50 micromolar nos poços desejados da placa de múltiplos poços. A tecnologia acústica de gotas utiliza som para transferir verticalmente pequenos volumes de líquido de uma placa fonte para uma placa destino invertida.Aqui, o molde, o DNA e os iniciadores são transferidos em gotículas múltiplas de 2,5 nanolitros para os poços de uma placa de 1536 poços. A fim de montar as reações de marcação por QPCR. Em seguida, utilize um selante opticamente transparente e um sistema selador de microplacas para selar imediatamente a placa de 1536 poços.Centrifugue imediatamente a placa selada a 2000 G, em temperatura ambiente, durante três minutos para recolher todos os reagentes no fundo do poço, execute então o programa de PCR em tempo real no equipamento de QPCR, conforme as orientações do protocolo descrito no texto, e inicie a corrida após a conclusão. Verifique se todos os poços passaram pelo controle mestre, o que indica que a mistura mestra de QPCR foi detectada no poço. Qualquer poço que não atender representa um ponto de dado potencialmente falso negativo.Para analisar os dados, inspecione-os visualmente no software de QPCR e/ou exporte-os para processamento off-line a partir do instrumento. Neste experimento, pares de iniciadores para marcadores de PCR do cromossomo três selvagem e sintético foram testados com DNA genômico de levedura extraído de quatro cepas diferentes. Duas com o cromossomo três selvagem e duas que codificam um cromossomo sintético.Três primers sintéticos, como esperado, amplificaram geralmente DNA sintético e não DNA do tipo selvagem. De maneira semelhante, primers do tipo selvagem produziram amplicons exclusivamente a partir de DNA do tipo selvagem. A ocorrência de um pequeno número de resultados falsos positivos e negativos é esperada, e as possíveis fontes desses erros são descritas no protocolo textual acompanhante.Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em cerca de uma hora do início ao fim. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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