Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar a implantação de microesferas para introduzir alterações no ambiente tecidual local em pontos espaciais e temporais específicos durante a embriogênese do peixe-zebra. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de uma bandeja para implantação de esferas, facilitando o manuseio e a implantação precisos das microesferas. Como segundo passo, os ovos de peixe-zebra são incubados até o estágio desejado de desenvolvimento.

As microesferas são então preparadas nas soluções experimentais apropriadas e cuidadosamente transferidas para o local desejado dentro do embrião. Em última análise, a implantação de microesferas pode ser realizada sem a interrupção do desenvolvimento normal do peixe-zebra, permitindo a avaliação dos efeitos das moléculas de interesse sobre a embriogênese do peixe-zebra. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais da área de biologia do desenvolvimento, como, por exemplo, como diferentes moléculas afetam o processo de organogênese?

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois é necessário praticar para adquirir habilidade no manuseio das microesferas. Para preparar a bandeja de implantação de microesferas, aqueça primeiro a solução de aro a 2% recém-preparada por 90 segundos. Em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros, gire o frasco a cada 30 segundos para evitar que o gel transborde.

Em seguida, coloque a tampa de uma placa de Petri de 60 por 15 milímetros dentro de uma placa de 150 por 15 milímetros, com a parte interna da tampa voltada para cima. Em seguida, fixe a tampa da placa de Petri menor com o dedo indicador. Despeje o gel de agarose quente na placa maior.

Permita a formação de uma fina camada de agroso abaixo da tampa menor para evitar a formação de condensação e facilitar a visualização das esferas ao microscópio enquanto o agroso esfria. Porém, antes de ele solidificar, incline lentamente um molde de poços na parte superior do gel para permitir uma colocação mais fácil dos embriões. Quando o gel estiver solidificado, use uma espátula microscópica para remover cuidadosamente o molde de poços.

Em seguida, adicione a solução E três à placa e armazene-a a quatro graus Celsius. Para coletar os embriões de peixe-zebra, preencha uma câmara de acasalamento com água do sistema. Em seguida, coloque um divisor no centro da câmara e adicione peixes-zebra adultos machos e fêmeas nos lados apropriados da câmara.

Na manhã seguinte, utilize um coador de malha fina de arame para coletar os ovos fertilizados. Vire o coador de cabeça para baixo dentro de uma placa de Petri limpa de 10 centímetros e enxágue a malha com um fluxo fino de E três até que não haja mais ovos no coador e haja aproximadamente 25 mililitros de solução de E três na placa. Em seguida, distribua os ovos entre várias placas, com 50 a 60 ovos por placa, para evitar superlotação, e incube os ovos em solução de E três a 28,5 graus Celsius. Antes de implantar as microesferas, incube-os no volume apropriado da molécula de teste de interesse ou do veículo controle pelo período de tempo adequado.

Em seguida, quando os embriões atingirem o ponto temporal de desenvolvimento desejado, utilize pinças finas para remover seus kons e incubar os peixes-zebra em solução de Ringer filtrada, suplementada com antibióticos, durante 10 minutos enquanto os embriões se aclimatam. Transfira as microesferas para a placa de microesferas previamente preparada, acomodada dentro da bandeja de implantação, e lave as esferas e a solução de Ringer por 10 minutos.

Em até 50 minutos após a lavagem do arranjo de microesferas, posicione um embrião por vez dentro do poço da bandeja de implantação, de modo que a área para implantação da microesfera fique acessível. Utilizando uma agulha de tungstênio, faça uma pequena incisão no embrião, em seguida pressione a lâmpula de uma pipeta capilar de transferência para puxar suavemente uma microesfera para dentro da coluna capilar e solte a pressão para liberar a microesfera na bandeja de implantação, facilitando seu manuseio. Empurre suavemente a microesfera para submergi-la na solução de Ringer dentro do molde.

Em seguida, utilizando a microssonda, mova a microesfera para cima do embrião e para dentro da incisão. Por fim, use a ferramenta de cerda para afastar a microesfera do local da incisão, de modo que ela não seja expelida durante a cicatrização. O sucesso da implantação da microesfera pode então ser avaliado imediatamente por meio do microscópio estereoscópico, pois a esfera permanecerá estavelmente posicionada no tecido.

Neste experimento, microesferas individuais de dois tamanhos diferentes, lavadas apenas com solução de Ringer, foram implantadas em embriões de peixe-zebra na fase de botão caudal ou em pontos temporais posteriores durante alguma mionogênese, para garantir que a posição da esfera não tenha se deslocado ao longo da duração do experimento devido à morfogênese tecidual endógena. As amostras de embriões podem ser visualizadas por fotografia de curso temporal ou verificadas em intervalos periódicos, conforme demonstrado nas imagens de implante de microesferas. Na ausência de qualquer conjugado, moléculas pequenas podem ser utilizadas sem causar efeitos morfológicos acentuados durante o desenvolvimento normal do embrião de peixe-zebra SPR.

Após este procedimento, outros métodos como o Whole Mount Institute hyper podem ser realizados para estudar como o microesfera afeta a expressão gênica. No geral, compreender a posição da esfera ao longo do tempo é fundamental na interpretação dos resultados, como na avaliação dos efeitos de uma molécula pequena sobre um tecido-alvo ou processo de desenvolvimento.