Name: Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Aprenda a criar uma câmara de difusão planar para investigar quimiotaxia em matriz de colagénio 3D. Este método utiliza microscopia confocal para rastrear migração celular e visualizar deslocamento em tempo real.

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Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Jonathan Reichner e Angle Byrd pela visão do experimento celular. O Programa de Bolsas de Pesquisa de Pós-Graduação da National Science Foundation (GRFP) apoiou este trabalho.

Mold Design 1. 3D e Peças <ol><li> Mofo <ol><li> Antes de trabalhar, obter um kit de elastômero de silicone, uma câmara de imagens de células vivas, uma lamela de vidro 22 mm, e um cubo de metal de alumínio usinado com dimensões 10,07 milímetros x 3,95 milímetros x 5,99 milímetros. Preparar a câmara de imagem de células vivas para moldagem, colocando a lamela inferior no suporte de montagem e o resto da câmara, conforme indicado pelo fornecedor. </li><li> Em seguida, usando uma pinça, coloque o cubo de alumínio usinado de metal no meio da caixa de uma câmara ao vivo imagens de células e em cima da lamela, e, em seguida, reserve. </li><li> Misturar as soluções de elastómero de silicone de acordo com o protocolo do fabricante para fazer 5 ml de elastómero. </li><li> Usando uma espátula de laboratório descartável, despeje solução de elastômero de silicone em configuração ao vivo câmara de imagens de células e garantir para não mover colocado usinado cubo de metal de alumínio. Coloque o sistema na bancada do laboratório, em um local seguro O / N para a cura. </li><li> Na manhã seguinte, desconstruira câmara de imagens de células vivas, como recomendado pelo fabricante e retirar o molde usando uma pinça. Utilizando uma pinça, extraia cuidadosamente o cubo de metal de alumínio usinado a partir do molde. Vá até a pia e lavar o molde com água deionizada. Coloque o molde em uma toalha de papel para secar. </li><li> Depois de seco, usando uma faca passatempo, cortar fendas através do molde, espaçadas 2,34 milímetros para além de cada extremidade longitudinal, no interior do molde de silicone. Verifique se as estadias do molde em um lugar seguro e seco até que você esteja pronto para construir o sistema para uma experiência. </li></ol></li><li> Hidrofílicos e hidrofóbicos As lamelas de vidro Preparação <ol><li> Para permitir que a matriz de colagénio para aderir a uma superfície, criar lamelas hidrófilos: <ol><li> Usando uma pipeta descartável, medir 150 mL de 3-aminopropil-trimetoxissilano e despeje solução num tubo de 50 ml. Adicionar 30 ml de etanol a 100% para o tubo de 50 ml com uma pipeta descartável segundo e fechar a tampa. Vortex a solução durante 2 min, assegurando uma mistura completa. Pnossa solução em uma placa de Petri de vidro e reserve. </li><li> Despeje 15 ml de álcool etílico 100% em uma segunda placa de Petri e reserve (certifique-se de rotular pratos). </li><li> Usando uma nova pipeta descartável, medir 30 ml de água desionizada e uma solução para um tubo de 50 ml, deitar. Em seguida, usando uma pipeta descartável nova medida a 1875 ul de glutaraldeído e despeje solução para o mesmo tubo de 50 ml e fechar a tampa. Vortex a solução durante 2 min, assegurando uma mistura completa. Despeje a mistura na terceira placa de Petri, e reserve. </li><li> Utilizando uma pinça, retire uma lamela de vidro 22 milímetros rodada e lave ambos os lados com 100% de mistura de etanol com uma pipeta descartável. </li><li> Coloque lamela de vidro lavadas em 3-aminopropil-trimetoxi-silano com 30 ml de etanol a 100% e solução prato permitir a sentar-se na solução durante 5 minutos. </li><li> Com uma pinça, retire lamela de vidro e lavar novamente com uma solução de etanol a 100% com pipeta descartável. </li><li> Largar lamela de vidro lavado em 1875ul de glutaraldeído e 30 ml de uma mistura de água desionizada e retiradas durante 30 min. </li><li> Após 30 min, remover lamela de vidro com uma pinça e enxaguar com água desionizada e coloque-O tecido seco / N para secar à temperatura ambiente. </li><li> Dipping lamela Repita e movendo-se para o maior número de lamelas, conforme necessário com as mesmas soluções geradas. </li></ol></li><li> Faça lamelas hidrofóbicas pelo protocolo determinado. <ol><li> Adicionar 500 ul de tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, 100 ul de ácido acético e 19,4 ml de hexano em um tubo de 50 mL e agitar com vortex durante 2 min. Despeje solução em vidro Petri prato e reserve. </li><li> Utilizando uma pinça limpo, tire uma lamela de vidro e cair na solução mista preparado por 2 min. Após 2 min passaram, tirar lamela de vidro com uma pinça e enxágüe com água deionizada usando uma pipeta e lugar lamela descartáveis ​​para O tecido seco / N para secar em temperatura ambiente. Lamela loja em pratos de Petri de plástico até ser utilizado. </li><li> Repita dipp lamelaing e movendo-se para o maior número de lamelas, conforme necessário com as mesmas soluções geradas. </li></ol></li></ol></li></ol> Assembléia 2. Mold <ol><li> Antes de usar moldes, usando uma pipeta descartável lave o molde com álcool etílico a 90% ao longo de um recipiente para resíduos químicos. Em seguida, colocar o molde numa placa de Petri cheia de água desionizada e permitir a sentar O / N. </li><li> Tome molde da solução usando uma pinça e coloque em uma toalha para o ar seco antes de iniciar a montagem de molde. </li><li> Enquanto o molde é o ar de secagem, corte as lamelas hidrofílicos quadrados em dois retângulos um pouco maiores do que 3,95 milímetros x 5,99 milímetros usando uma ferramenta de traçagem de diamante de alta precisão. Deslize cada lamela corte retângulo nas ranhuras cortadas no molde de silicone. </li><li> Vire o molde de cabeça para baixo e aplique graxa de vácuo ao longo da parte inferior do molde de silicone com uma pipeta descartável. Em seguida, vire o molde de volta com o lado direito para cima e pressione a parte inferior do molde para as circulares tampas de vidro hidrofílicoslábio para criar uma vedação. </li><li> Com luvas descartáveis, pegar o molde montado e coloque em um prato descartável Petri e, em seguida, em um bio-hood. Ligue lâmpada UV Bio-capa para 1 hora para esterilizar o molde antes de ocorrer a experimentação. </li></ol> 3. O colagénio mistura e Matrix 3D <ol><li> Antes de preparar a mistura de colagénio, mancha e preparar as células para a imagiologia de acordo com protocolos padrão 28. </li><li> Utilizando técnicas laboratoriais padrão e protocolos 29,30, num bio-capa, e meios da mistura de células em quimioatractor um tubo de 15 ml com a concentração desejada quimioatractor. Pipeta 5 ml de solução a concentração dos media-chemoattractant célula específica em um tubo de 15 ml e mover a solução em um banho de água aquecida. </li><li> Usando uma pipeta, 5 ml de extracto de células de apenas meios de comunicação para um segundo tubo de 15 ml e colocar num banho de água aquecida para aquecer a solução para as experiências de microscopia. </li><li> Em um bio-hood, pipeta 30 ul de 10x tampão fosfatoed solução (PBS) para dentro do tubo de micro centrífuga. Adicionar 6 ul de 1 N hidróxido de sódio (NaOH) em mesma micro tubo de centrifugação e de vórtice durante 15 seg. </li><li> Obter solução de cauda de rato colágeno I da geladeira e passar para a bio-capa utilizando técnicas laboratoriais padrão e protocolos 29. Verifique se o colágeno ainda está frio. Pipetar 168,3 ul de colagénio no mesmo tubo de micro centrífuga. </li><li> Em seguida, adicionar 18 ul de amarelo-verde microesferas modificadas com carboxilato fluorescentes, utilizando uma pipeta para o mesmo tubo de micro centrífuga. Vortex do tubo de microcentrífuga com todas as soluções durante 30 seg. </li><li> Adicionar 77,7 uL de mistura de células meio celular pretendida (cerca de 2 X 10 6 células / ml de concentração) para dentro do tubo de micro centrífuga e misture utilizando a ponta da pipeta durante 20 seg. Conforme necessário, alterar a densidade da matriz seguindo-se a mistura de colagénio costume adaptado para a adição de contas fluorescentes e mesa de viabilidade celular (Tabela 1). </li><li> Pipetar 300 &amp; #181; l de mistura de células-colagénio para o centro do poço (bem como 2) do conjunto de molde preparado. Coloque o molde sobre um prato de Petri descartáveis ​​e movê-lo para uma incubadora padrão durante 20 minutos a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Retirar sistema da incubadora e coloque de volta para bio-hood. Utilizando uma pinça, retire ambas as lamelas hidrofóbicos por aperto na parte superior de cada lamela e puxando para cima e longe do molde. </li><li> Mover todo o sistema para a microscopia e imagem desejada para garantir os lados do molde de colagénio são ainda recta para permitir um gradiente de difusão planar. </li><li> Com o sistema ainda sob o microscópio, utilizando uma pipeta de canal único 100 ul, adicionar 100 uL de meio celular para o poço # 1. Em seguida, usando uma pipeta de canal único 100 ul adicionar 100 ul de meios de células com a concentração desejada em quimioatractivo bem # 3. </li><li> Imediatamente após a adição de soluções em ambos os poços, início de imagem. </li></ol> 4. Criação de Imagens e DifusãoModelagem <ol><li> Se se quer encontrar o coeficiente de difusão para a densidade específica de colagénio para calcular a concentração específica, seguir o protocolo abaixo: <ol><li> Siga o protocolo dado acima intitulado &quot;Mistura de colágeno e Matrix 3D&quot;, em vez de gerar meios de células com a concentração chemoattractant desejar, faça rhodamine 5 M em um tubo de 15 ml usando cálculos e protocolos 30 padrão. </li><li> Imagem as matrizes de colágeno 3D com um sistema confocal montado em um microscópio invertido usando um laser de argônio (488 nm) para capturar a fluorescência. Imagem a cada 2 ou 3 segundos para até 7 hr. </li></ol></li><li> Para Modelagem Difusão: Usando o modelo matemático apresentado abaixo, escrever um código de software computacional para processamento e análise com estas etapas gerais. <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li> Importar imagens para software computacional para redimensionamento e normalizando pelo inten máximosidade. Converta imagens para um mapa de cor cinza da imagem para selecionar a borda. Escolha de um eixo ao longo do centro da imagem, para a direita do centro e para a esquerda do centro. </li><li> Usando o código de software computacional, traçar a intensidade normalizada, juntamente com o verdadeiro intensidade e a diferença entre os dois. </li><li> A seguir, introduza os parâmetros necessários para a montagem (concentração, tempo e duração). </li><li> Traça-se a concentração normalizada em função do tempo e o perfil de concentração ao longo do eixo-x com um ajuste polinomial para os dados. </li><li> Calcular o coeficiente de difusão utilizando o código de software computacional. </li></ol></li></ol> 5. As medições experimentais <ol><li> Referindo de novo a equação de difusão, reescrever a equação para encontrar a concentração específica em qualquer local dentro do sistema como mostrado abaixo. <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> Onde: L = Comprimento do thmatriz de colágeno e x = localização sob investigação D = coeficiente de difusão T = tempo decorrido </li><li> Durante as experiências de quimiotaxia, garantir para registrar o tempo específico que a quimiocina momento foi adicionado ao sistema. Uma vez que o movimento de migração celular é encontrado, garantir a gravar confocal gravação de lapso de tempo, e observe o tempo específico e localização da borda onde imaging ocorreu. </li><li> Durante a análise de dados, conecte o observado o tempo decorrido, a localização e o coeficiente de difusão para a célula específica na equação para encontrar a concentração normalizada específica em qualquer ponto dentro do colagénio, tanto para difusão e experiências com células. </li></ol> 6. Acompanhamento de migração celular Utilizando TFM <ol><li> Para controlar a migração de células usando técnicas de TFM / DVC seguir o protocolo abaixo: <ol><li> Após a adição da concentração desejada em quimioatractor bem # 3, iniciar o Imaging as matrizes de colagénio em 3D com um sistema confocal montado num micr invertidooscope para encontrar uma célula para investigar. </li><li> Uma vez que uma célula se encontra em movimento, colocar a célula no meio do campo de vista e utilizar um motor piezoeléctrico (para a imagem no eixo z), cada imagem 1 ou 2 minutos. </li><li> Para calcular a geração de força e deformação celular, gerar um código computacional para encontrar os deslocamentos dos grânulos de fluorescência seguindo os protocolos TFM / DVC 31. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais críticos para as experiências bem-sucedidas de difusão com ou sem células são: configurar corretamente o conjunto de molde; desenvolver a destreza manual necessário para evitar danos durante a extracção de lamelas hidrofóbicos; garantindo a encontrar uma linha muito boa de partida linear para calcular correctamente o coeficiente de difusão; corrigir cálculos experimentais de colagénio e quimioatractiva; usar corretamente do sistema de imagens de células vivas para garantir matriz não secar; e a manutenção...

A deslocação preferida de células para um gradiente de concentração, conhecido como quimiotaxia, desempenha um papel importante em processos fisiológicos e patológicos no organismo. Tais exemplos são a pele e mucosa 1 a cicatrização de feridas, a morfogénese 2, 3 inflamação, e 4,5 o crescimento do tumor. Também tem sido mostrado que as células cancerosas podem migrar através de duas estratégias individuais e colectivos-migração celular 6. Além disso, os mecanismos de difusão de instabilidade pode induzir a separação de células individuais ou agrupados a partir de um corpo / objeto tumoral e, em seguida, podem emigrar para uma fonte de nutrientes e, portanto, invadir áreas mais largas e 7 tecidos. Além disso, foi demonstrado que diversos mecanismos de migração podem ser activa em 2D e em 3D, devido a diferentes funções de moléculas de adesão 8. Portanto, um movimento para fisiologicamente relevante em ensaios in vitro para investigar a motilidade celular em um measureable de modo simples e é de importância na compreensão de fenômenos movimento de 9 células. Infelizmente, a dificuldade em analisar a migração de células, um ensaio de quimiotaxia quantificável abrangente geralmente requer um método trabalhoso longo, fundada na medição da motilidade celular e fenômenos de transporte modelos imparciais. Abordagens experimentais passadas para investigar quimiotaxia de células incluem a câmara de Boyden 10 eo ensaio sob agarose 11. No entanto, dentro destes primeiros ensaios, as experiências de migração de células não acompanhar o movimento em relação ao tempo. Mais, o mais importante, os gradientes de concentração utilizados para as experiências não foram bem definidas ou completamente compreendido, enquanto apenas para sustentar a sinalização para não mais do que algumas horas. Além disso, as tentativas de câmara de quimiotaxia precoce restrito a migração de células para duas dimensões e não permitem controlar a cinética da migração 12. Olhando para a câmara de Boyden, um ensaio endpointnão permitiria ao pesquisador observar visualmente a migração e não poderia diferenciar diretamente quimiotaxia (movimento direcional) de quimiocinese (movimento aleatório). Além disso, várias variáveis ​​diferenças no tamanho de poro e espessura de membranas feitas a câmara muito difícil de reproduzir de forma fácil e oculta a reacção migrante de células para quimiocinas 13,14. Com o novo entendimento de microfluídica, novas câmaras e micro-dispositivos têm sido investigados como um instrumento para investigar a locomoção de células sob condições de fluxo intersticiais ou quimiotaxia 15,16. De acordo com estes novos dispositivos, novas métricas de células foram introduzidos e investigados, como o efeito da tensão de cisalhamento em uma célula 17,18. Infelizmente, câmaras de quimiotaxia microfluídicos passadas e atuais limitam estudos de migração celular para substratos um 2D revés importante, pois muitos processos biológicos, incluindo a invasão de células de tumores e metástases, e immigração celular Mune, envolvem a migração 3D. Câmaras-onde a observação direta de uma solução chemoattractant está em contacto com um gel 3D contendo células também têm sido também relatados 19,20. Estas câmaras têm dois compartimentos, um contendo um quimioatractor e uma contendo células, são unidas ao lado uma da outra na horizontal 21 ou como anéis concêntricos 22. Estes sistemas são apontados na direção certa, mas não manter um sistema de quimiotaxia por um período prolongado de tempo. Além disso, os investigadores examinaram também difusividade através de membranas de colagénio em células de diálise, bem como a difusão de moléculas marcadoras através de amostras de colagénio submetido a pressão hidrostática 23-25. Algumas experiências de difusão em géis de colagénio dependem de alterações físicas e químicas do gel usando campos magnéticos e incorporação química 26. Um método popular para a modelagem diffusivity em collatecidos endógenos baseia-se na imagem de fluorescência de ponto fotodegradação contínua. Este método revelou anisotropia nos coeficientes de difusão de macromoléculas em tecidos de colagénio orientadas. No entanto, a fotodegradação foi usado na cartilagem articular e não matrizes de colagénio. Embora semelhantes, os experimentos de modelagem necessárias devem ser realizadas através da compreensão especificamente o coeficiente de difusão de géis de colágeno. Mais importante ainda, os sistemas não utilizam um método para medir a força de geração de células. Infelizmente, a maioria dos sistemas parecem estar faltando um ou dois elementos-chave para um sistema ideal: o que permite rastreamento de celular, uma compreensão gradiente de difusão com um fator quimiotático através da matriz, um conjunto relativamente simples com uma facilidade de reprodutibilidade, a minimização de célula-célula interações, e a capacidade de medir unidades dimensionais para quantificação (isto é, velocidade, força, concentração específica). Moghe et ai. </em&gt; 27 proposto um sistema que cumpriu a maioria destas exigências em que as células foram inicialmente dispersos por todo o gel em vez de concentradas na superfície do filtro, mas foi difícil de medir as forças que a célula gera. Para este fim, apresentamos um sistema de gradiente de difusão planar para investigar quimiotaxia em uma matriz de colágeno 3D, que permite superar as limitações modernas câmara de difusão de ensaios existentes, que é baseado na microscopia de lapso de tempo, juntamente com técnicas de análise de imagem para medir celular forças em um ambiente 3D. Este protocolo proporciona uma maneira simples, contudo inovadora de criar uma câmara de difusão 3D simples que pode ser utilizado para investigar a quimiotaxia 3D em células diferentes.

<table><tbody><tr><td>Kit de elastômero de silicone</td><td>Dow Corning Corp</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>uma mistura de duas partes com uma mistura de 10:1</td></tr><tr><td>Câmara de imagem de células vivas</td><td>Instrumento de célula viva</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB para 18&nbsp; lamínulas redondas</td></tr><tr><td>mm 22&nbsp; mm Lamínula de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0180281</td><td>Neuvitro Corp. lamínula 22&nbsp; mm 1.5</td></tr><tr>Cubo <td></td><td></td><td></td><td>de metal de alumínio usinado</td></tr><tr><td>Hobby faca utilitária</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3- (aminopropil) trimetoxissilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>Glutaraldeído, Grau EM, tubo de 8%</td></tr> <tr><td>50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Piso padrão modelo e centrífugas de mesa</td></tr><tr><td>Placa de Petri de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747A</td><td>Placas de Petri Reutilizáveis: Completas (60 x 15&nbsp; mm)</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td>Ponta Fina</td></tr><tr><td>Óculos de cobertura</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-105A</td><td>Retângulo; 30 x 22&nbsp; milímetro; Espessura No. 1</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Reagente ACS de ácido acético, &ge; 99,7%</td></tr> <tr><td>Hexano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>anidro, 95%</td></tr> <tr><td>Álcool etílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 provas, para biologia molecular</td></tr><tr><td>Ferramenta de riscagem de diamante de alta precisão</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>Ponta reta estendida, .020" (.50&nbsp; mm) de diâmetro por .200" (5.0&nbsp; mm) comprimento da ponta</td></tr><tr><td>Graxa a vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5C</td><td>Graxa de alto vácuo</td></tr><tr><td>tubo de 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49D</td><td>Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml com superfície hidrofóbica, biologicamente inerte</td></tr><tr><td>Solução tamponada com fosfato 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-500</td><td>1.37 M Cloreto de Sódio, 0.027 M Cloreto de Potássio, e 0.119 M Tampão de Fosfato</td></tr><tr><td>1&nbsp; N hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td><td>Concentrado de hidróxido de sódio</td></tr><tr><td>Colágeno I, cauda de rato</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>Cauda de rato&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de micro centrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-332</td><td>Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13&nbsp; x&nbsp; 40&nbsp; milímetro; estéril; single-wrapped</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Microesferas modificadas com carboxilato</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; F-8813</td><td>Microesferas modificadas com carboxilato, 0,5 &micro; m, fluorescente verde-amarelo (505/515), 2% sólidos</td></tr><tr><td>Rodamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>Rodamina B para fluorescência</td></tr></tbody></table>

gradiente planar do sistema de difusão para investigar quimiotaxia numa matriz de colagénio 3d

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

A importância da migração celular pode ser vista através do desenvolvimento da vida humana. Quando as células migram, elas geram forças e transferem essas forças para a área circundante, levando ao movimento e migração celular. Para entender os mecanismos que podem alterar e/ou afetar a migração celular, pode-se estudar essas forças. Em teoria, a compreensão dos mecanismos e forças fundamentais subjacentes à migração celular promete abordagens eficazes para o tratamento de doenças e a promoção do transplante celular. Infelizmente, as câmaras de quimiotaxia modernas que foram desenvolvidas são geralmente restritas a duas dimensões (2D) e têm gradientes de difusão complexos que tornam o experimento difícil de interpretar. Para este fim, desenvolvemos e descrevemos neste artigo uma câmara de visão direta para estudos de quimiotaxia, que permite superar os obstáculos modernos da câmara de quimiotaxia capazes de medir as forças celulares e a concentração específica dentro da câmara em um ambiente 3D para estudar a migração 3D celular. Mais convincente, essa abordagem permite modelar com sucesso a difusão por meio de matrizes de colágeno 3D e calcular o coeficiente de difusão de um quimioatraente por meio de várias concentrações diferentes de colágeno, mantendo o sistema simples e fácil de usar para análise de microscopia de força de tração (TFM) e correlação de volume digital (DVC).

A capacidade do presente ensaio para avaliar com precisão a migração da célula depende de uma boa configuração do sistema. Portanto, é crucial para certificar-se de projetar o molde sistema de difusão de forma precisa e tomar muito cuidado na colocação de lamelas de ambos hidrofóbicos e hidrofílicos, como ilustrado na figura 1. Se o sistema for projetado corretamente e durante a etapa de modelagem difusão garantindo para encontrar um muito boa linha de partida linear, uma é capaz de alcançar agradável f...

A migração celular é uma parte importante do desenvolvimento e da vida humana. A fim de entender os mecanismos que podem alterar a migração celular, apresentamos um sistema de difusão de gradiente planar para investigar a quimiotaxia em uma matriz de colágeno 3D, o que permite superar as limitações modernas da câmara de difusão dos ensaios existentes.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

O objetivo geral deste procedimento é criar uma câmara de difusão com gradiente planar para investigar quimiotaxia em uma matriz tridimensional de colágeno. Isso é realizado primeiramente fabricando um molde de silicone 3D com o auxílio de uma câmara para imagem de células vivas. O segundo passo consiste em produzir lamínulas hidrofílicas e hidrofóbicas e utilizá-las para montar o molde de silicone 3D.Em seguida, a mistura de células com colágeno é adicionada ao compartimento central e deixada polimerizar. O passo final consiste em remover as lamínulas hidrofóbicas do molde após a incubação e adicionar meio simples a um reservatório e meio contendo quimioatraente ao outro reservatório. Por fim, a microscopia confocal é utilizada para acompanhar a quimiotaxia celular ao longo do tempo e visualizar o deslocamento do movimento celular dentro da matriz de colágeno.A principal vantagem desta técnica em relação a técnicas existentes, como a câmara de boin e a microatletismo, é que ela permite uma configuração simples para investigar a migração no espaço tridimensional com um gradiente de difusão simples, sem usar uma pipeta descartável. Meça 150 microlitros do amino selina A-P-T-M-S e despeje em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, adicione 30 mililitros de etanol a 100% ao tubo com uma segunda pipeta descartável e feche a tampa.Vortex a solução durante dois minutos para garantir a mistura completa. Em seguida, despeje a solução em uma placa de Petri de vidro e reserve. A seguir, despeje 15 mililitros de álcool etílico a 100% em uma segunda placa de Petri e coloque-a junto com a primeira placa usando uma pipeta descartável nova.Meça 30 mililitros de água deionizada e despeje a solução em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, use uma pipeta descartável nova para adicionar 1,875 mililitros de glu aldeído ao tubo e feche a tampa. Agite a solução em vórtex por dois minutos e, depois, despeje a mistura em uma terceira placa de Petri.Usando pin&ccedil;as, retire um lam&iacute;nula de vidro redonda de 22 mil&iacute;metros e enxague ambos os lados com uma mistura de etanol a 100%. Usando uma pipeta descart&aacute;vel, coloque a lam&iacute;nula enxaguada no primeiro recipiente que cont&eacute;m amino silano e deixe-a em repouso na solu&ccedil;&atilde;o por cinco minutos, utilizando pin&ccedil;as. Retire a lam&iacute;nula de vidro e enxague-a novamente com etanol a 100%.Em seguida, coloque o lamínula de vidro lavado na placa com glutaraldeído e deixe repousar por 30 minutos. Após 30 minutos, remova o lamínula de vidro com pinça e lave-o com água desionizada. Coloque o lamínula lavado sobre um papel absorvente para secar durante a noite à temperatura ambiente.Para preparar lamínulas hidrofóbicas, adicione primeiro 500 microlitros de TTS, 100 microlitros de ácido acético e 19,4 mililitros de heptano em um tubo de 50 mililitros e vortexie por dois minutos. Em seguida, despeje a solução em uma placa de Petri de vidro e use pinças limpas para colocar uma lamínula de vidro na solução preparada e deixe-a por dois minutos. Após dois minutos, retire a lamínula de vidro com as pinças e enxágue-a com água desionizada usando uma pipeta descartável, coloque a lamínula sobre um papel absorvente e deixe secar à temperatura ambiente durante a noite.Armazene as lamínulas secas em uma placa de Petri de plástico até que sejam necessárias para iniciar o procedimento; em seguida, monte a câmara de imagem de células vivas conforme descrito no protocolo textual complementar. Em seguida, misture as soluções de elastômero de silicone de acordo com as instruções do fabricante para obter cinco mililitros de elastômero. Depois, use uma espátula descartável para despejar lentamente a solução de elastômero de silicone na montagem da câmara de imagem de células vivas, tomando cuidado para não perturbar os componentes do molde.Deixe a forma em um local seguro para curar à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, retire a forma com pinça e extraia cuidadosamente o cubo de metal de alumínio usinado da forma. Em seguida, vá até a pia e enxágue a forma com água desionizada, depois coloque a forma sobre uma toalha de papel para secar.Uma vez seco, use uma estilete de utilidade para cortar fendas espaçadas a 2,34 milímetros de cada extremidade longitudinal dentro do molde de silicone. Certifique-se de manter o molde em um local seguro e seco até o momento de utilizá-lo no experimento. Enxágue o molde com etanol a 90% e coloque-o em uma placa de Petri contendo água desionizada para repousar durante a noite.Na manhã seguinte, transfira o molde para uma toalha de papel e deixe secar ao ar enquanto o molde estiver secando. Use uma ferramenta de riscagem de diamante de alta precisão para cortar o quadrado. Lâminas de cobertura hidrofílicas em dois retângulos, ligeiramente maiores que 3,95 milímetros por 5,99 milímetros.Em seguida, deslize cada lamínula retangular cortada nas ranhuras feitas no molde de silicone, vire o molde de cabeça para baixo e aplique graxa de vácuo ao longo da parte inferior do molde de silicone usando uma pipeta descartável. Depois, vire o molde novamente com o lado correto para cima e pressione a parte inferior do molde contra a lamínula de vidro hidrofílica circular. Para criar um selo, prepare uma mistura de meio e quimiotáticos em um tubo de 15 mililitros na concentração desejada, pipete cinco mililitros da mistura em um novo tubo de mililitro e cinco mililitros de meio simples em um segundo tubo.Coloque ambos os tubos em um banho-maria aquecido a 37 graus Celsius. Em seguida, pipete 30 microlitros de 10 XPBS em um tubo microcentrífugo. Adicione seis microlitros de uma solução de hidróxido de sódio 1 N ao mesmo tubo microcentrífugo e vortexie por 15 segundos.Em seguida, adicione 18 microlitros de microesferas fluorescentes carboxiladas verde-amareladas a um tubo de microcentrífuga e 168,3 microlitros de colágeno do tipo I de cauda de rato gelado. Agite a mistura em vórtex por 30 segundos.Em seguida, adicione 77,7 µL do tipo celular desejado a uma concentração de dois vezes 10 à sexta células por mililitro em meio ao tubo de microcentrífuga e misture. Usando uma ponteira de pipeta, pipete 300 µL da mistura de colágeno e células no poço central do conjunto de molde preparado durante 20 segundos.Em seguida, coloque o molde sobre uma placa de Petri descartável e transfira-o para uma incubadora padrão por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após o período de incubação, use pinças para remover ambas as lamínulas hidrofóbicas, prendendo a parte superior de cada lamínula e puxando para cima e para longe do molde. Transfira todo o sistema para o microscópio e examine a câmara para garantir que as laterais do molde de colágeno ainda estejam retas, permitindo um gradiente de difusão plano com o sistema ainda sob o microscópio. Adicione 100 microlitros de meio celular no primeiro poço.Em seguida, adicione 100 microlitros de meio celular com a concentração desejada do quimioatraente no poço do outro lado da matriz. Acompanhe a migração celular em referência às microesferas marcadas com fluorescência conforme descrito no protocolo de texto acompanhante. A série de imagens apresentada aqui mostra a difusão da rumina atravessando um gel de colágeno a um miligrama por mililitro.Este exemplo exibe o gradiente verdadeiro de difusão planar do sistema, que também pode ser esperado para qualquer quimioatraente introduzido. No exemplo mostrado aqui, a intensidade do sinal de rumina foi medida ao longo do tempo nos locais identificados pelos quadrados vermelhos. A concentração em cada um desses locais é mostrada neste gráfico como uma linha separada, que, quando medida em estado estacionário, produz um gradiente de concentração linear com base na posição no gel. Essa relação permanece linear ao longo de uma faixa de concentrações de matriz de colágeno, tornando este sistema muito útil para experimentos com células. Nesta imagem, um neutrófilo colorido de vermelho é mostrado dentro de uma matriz de colágeno espalhada por microesferas fluorescentes verdes que são usadas como referências de posição. As próximas três imagens mostram a migração direcionada do neutrófilo enquanto ele se move ao longo de um gradiente de quimioatraente, representado pela seta branca.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar uma câmara de difusão simples para investigar a migração celular em uma matriz tridimensional de colágeno.

planar-gradient-diffusion-system-to-investigate-chemotaxis-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

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