Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

O objetivo geral deste procedimento é criar uma câmara de difusão de gradiente mais plana para investigar os impostos de quimioterapia em uma matriz de colágeno 3D. Isso é feito primeiro fabricando um molde de silicone 3D com o uso de uma câmara de imagem de células vivas. O segundo passo é fazer lamínulas hidrofílicas e hidrofóbicas e usá-las para montar o molde de silicone 3D.

Em seguida, a mistura de células de colágeno é adicionada ao compartimento central e pode polimerizar. A etapa final é remover as lamínulas hidrofóbicas do molde após a incubação e adicionar meio simples a um reservatório e meio com atrativo de quimioterapia ao outro reservatório. Em última análise, a microscopia confocal é usada para rastrear a quimiotaxia celular ao longo do tempo e visualizar o deslocamento do movimento celular dentro da matriz de colágeno.

A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como a câmara de boin e o microatletismo, é que ela permite uma configuração simples para investigar a migração no espaço 3D com um gradiente de difusão simples, sem usar uma pipeta descartável. Meça 150 microlitros da amino-selina A-P-T-M-S e despeje-a em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, adicione 30 mililitros de etanol 100% ao tubo com uma segunda pipeta descartável e feche a tampa.

Vortex a solução por dois minutos para garantir a mistura completa. Em seguida, despeje a solução em uma placa de Petri de vidro e reserve. Em seguida, despeje 15 mililitros de álcool 100% etílico em uma segunda placa de Petri e coloque-a com a primeira placa usando uma nova pipeta descartável.

Meça 30 mililitros de água deionizada e despeje a solução em um tubo de 50 mililitros. Em seguida, use uma nova pipeta descartável para adicionar 1.875 mililitros de aldeído glu ao tubo e feche a tampa. Vortex a solução por dois minutos e, em seguida, despeje a mistura em uma terceira placa de Petri.

Usando uma pinça, retire 1 lamínula de vidro redonda de 22 milímetros e enxágue os dois lados com a mistura de 100% de etanol. Usando uma pipeta descartável, coloque a lamínula de vidro de enxágue no primeiro prato que contém amino selina e deixe-o descansar na solução por cinco minutos usando uma pinça. Retire a lamínula de vidro e enxágue novamente com etanol 100%.

Em seguida, coloque a lama de vidro enxaguada no prato com glutaraldeído e reserve por 30 minutos. Após 30 minutos, remova a lamínula de vidro com uma pinça e enxágue com água deionizada. Coloque a lamínula enxaguada em um lenço de papel para secar durante a noite em temperatura ambiente.

Para preparar lamínulas hidrofóbicas, primeiro adicione 500 microlitros de TTS, 100 microlitros de ácido acético e 19,4 mililitros de heano em um tubo de 50 mililitros e vortex por dois minutos. Em seguida, despeje a solução em uma placa de Petri de vidro e use uma pinça limpa para colocar uma lamínula de vidro na solução preparada e deixe-a lá por dois minutos. Após dois minutos, retire a lamínula de vidro com uma pinça e enxágue com água deionizada usando uma pipeta descartável, coloque a lamínula sobre um lenço de papel e deixe secar em temperatura ambiente durante a noite.

Armazene as lamínulas secas em uma placa de Petri de plástico até que sejam necessárias para começar, monte a câmara de imagem de células vivas conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, misture as soluções de elastômero de silicone de acordo com as instruções do fabricante para fazer cinco mililitros de elastômero. Em seguida, use uma espátula de laboratório descartável para despejar lentamente a solução de elastômero de silicone na configuração da câmara de imagem de células vivas para não perturbar os componentes do molde.

Deixe o molde de lado em um local seguro para controlar a temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, retire o molde usando uma pinça e extraia cuidadosamente o cubo de metal de alumínio usinado do molde. Em seguida, vá até a pia e enxágue o molde com água deionizada e, em seguida, coloque o molde em uma toalha de papel para secar.

Depois de seco, use um estilete para cortar fendas a 2,34 milímetros de distância de cada extremidade longitudinal dentro do molde de silicone. Certifique-se de que o molde permaneça em um local seguro e seco até que seja necessário para o experimento antes do uso. Enxágue o molde com etanol a 90% e coloque o molde em uma placa de Petri cheia de água deionizada para descansar durante a noite.

Na manhã seguinte, transfira o molde para uma toalha de papel e deixe secar ao ar enquanto o molde seca. Use uma ferramenta de riscagem de diamante de alta precisão para cortar o quadrado. A cobertura hidrofílica desliza em dois retângulos, ligeiramente maiores que 3,95 milímetros por 5,99 milímetros.

Em seguida, deslize cada uma das lamínulas retângulos cortadas nas ranhuras, corte no molde de silicone, vire o molde de cabeça para baixo e aplique graxa a vácuo ao longo da parte inferior do molde de silicone usando uma pipeta descartável. Em seguida, vire o molde de volta para cima e pressione a parte inferior do molde na lamínula de vidro hidrofílico circular. Para criar uma vedação, prepare uma mistura de meio e atrativo de quimioterapia em um tubo de 15 mililitros na concentração desejada, pipete cinco mililitros da mistura em um novo tubo de mililitro e cinco mililitros de meio simples em um segundo tubo.

Mova os dois tubos para um banho-maria aquecido a 37 graus Celsius. Em seguida, pipete 30 microlitros de 10 XPBS em um tubo de microcentrífuga. Adicione seis microlitros de uma solução normal de hidróxido de sódio no mesmo tubo de microcentrífuga e vórtice por 15 segundos.

Em seguida, adicione 18 microlitros de carboxilato fluorescente verde amarelo, microesferas modificadas a um tubo de microcentrífuga e 168,3 microlitros de gelado. Digite um colágeno de cauda de rato. Vortex a mistura por 30 segundos.

Em seguida, adicione 77,7 microlitros da célula desejada. Digite duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro em meio ao tubo de microcentrífuga e misture. Usando uma ponta de pipeta por 20 segundos, pipete 300 microlitros da mistura de células de colágeno no poço central do conjunto do molde preparado.

Em seguida, coloque o molde em uma placa de Petri descartável e mova-o para uma incubadora padrão por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono Após o período de incubação, use uma pinça para remover ambas as lamínulas hidrofóbicas prendendo na parte superior de cada lamínula e, em seguida, puxando para cima e para longe do molde. Mova todo o sistema para o microscópio e examine a câmara para garantir que os lados do molde de colágeno ainda estejam retos, permitindo um gradiente de difusão mais plano com um sistema ainda sob o microscópio. Adicione 100 microlitros de meio celular no primeiro poço.

Em seguida, adicione 100 microlitros de meio celular com a concentração de atrativo quimioterápico desejada no poço do outro lado da matriz. Rastreie a migração celular em referência às microesferas marcadas com fluorescência, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. A série de imagens apresentadas aqui mostra a difusão da rumina movendo-se através de um gel de colágeno de um miligrama por mililitro.

Este exemplo exibe o verdadeiro gradiente de difusão planar do sistema, que também pode ser esperado de qualquer atrativo quimioterápico introduzido. No exemplo mostrado aqui, a intensidade do sinal de rumina foi medida ao longo do tempo nos locais identificados pelos quadrados vermelhos. A concentração em cada um desses locais é mostrada neste gráfico como uma linha separada, que quando medida no estado estacionário, produz um gradiente de concentração linear com base na posição no gel.

Essa relação permanece linear em uma faixa de concentrações de matriz de colágeno, tornando esse sistema muito útil para experimentos com células. Nesta imagem, um neutrófilo colorido de vermelho é mostrado dentro de uma matriz de colágeno espalhada com microesferas verdes fluorescentes que são usadas como referências de posição. As próximas três imagens mostram a migração direcionada do neutrófilo à medida que ele sobe em um gradiente de atrativo de quimioterapia, que é representado pela seta branca.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar uma câmara de difusão simples para investigar a migração celular em uma matriz de colágeno 3D.