Name: Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a quantificar proteínas absolutamente usando cromatografia líquida e monitoramento de reação selecionada (SRM) em amostras biológicas complexas. Este método oferece uma alternativa rápida e econômica aos imunoensaios tradicionais.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas.

Os autores não têm nada a divulgar.

Quantificação absoluta de proteína é essencial para uma gama muito diversificada de aplicações biomédicas tais como validação de biomarcadores e modelagem via de transdução de sinal. Recentemente, proteômica direcionados utilizando LC-SRM beneficiou de melhorias para várias tecnologias, incluindo a preparação de péptidos padrão, HPLC, qq-MS, e análise de dados LC-SRM. Por conseguinte, tornou-se uma alternativa poderosa para imunoensaios. Imunoensaios podem ser extremamente sensíveis e de alto rendimento, mas o desenvolv...

Experimentos de proteômica que usam a espectrometria de massa (MS) pode ser projetado para usar um não-alvo (espingarda) ou métodos direcionados. Proteómica descoberta baseia-se na espingarda geralmente de baixo para cima MS, usando um modo de aquisição dependente dos dados tradicional, ou utilizando uma das técnicas independentes de dados desenvolvidas recentemente (por exemplo, MS E, SWATH) 1,2. Proteómica espingarda é uma ferramenta poderosa para a identificação de alto rendimento péptido e quantificação relativa, mas é geralmente inadequada para a quantificação absoluta ou para o direccionamento pequenos conjuntos, definidos ~ (RTE) de proteínas. O método MS mais frequentemente usado para proteômica alvejados é selecionado monitoramento de reação (SRM) por causa de sua alta sensibilidade, velocidade e alcance dinâmico 3-5. Alternativas a SRM incluem monitoramento de reação paralela, que tira proveito de alta resolução, completa varredura MS 6. SRM é geralmente realizada utilizando um fluxo de rever nano-sed cromatografia em fase líquida de alta eficiência (nano-RP-LC) acoplado a um instrumento de ionização por electropulverização de nano-(nano-ESI) ligado a fonte de iões de um espectrómetro de massa triplo quadrupolo (QQQ-MS). Numa experiência típica, as proteínas da amostra são proteoliticamente digeridos, e os peptídeos resultantes foram separados cromatograficamente, dessorvido, e ionizado. Os iões resultantes são precursoras m / z filtrada por o primeiro quadrupolo (Q1) e fragmentada no segundo quadrupolo (Q2) por colidir com um gás de colisão. Os iões resultantes são fragmento m / no terceiro quadrupolo (Q3) e quantificada por um dínodo filtrou-z. Cada par de iões fragmento precursor e é referido como uma transição, e cada transição é monitorizado por um período determinado de tempo (tempo de espera, tipicamente 2-50 ms). Durante LC-SRM, os ciclos QQQ-MS por meio de uma lista pré-definida de transição (o ciclo de serviço é tipicamente ≤3 seg), e um cromatograma de cada transição é produzido. Strateg alternativas para a quantificação de proteínas normalmente utilizam imunoensaios tais como borrões ponto, manchas de Western, ELISAs, microarrays de anticorpos, microarrays de proteínas de fase reversa, imunoensaios microfluídicos, ELISAs digitais e imunoensaios à base de microesferas 7. Os melhores imunoensaios podem ser significativamente mais sensíveis do que os LC-SRM, e o manuseamento das amostras de imunoensaios podem ser significativamente mais elevada do que a da LC-5 SRM. No entanto, imunoensaios em desenvolvimento pode ser caro e / ou demorado, e os ensaios resultantes podem estar vulneráveis ​​a reactividade cruzada e / ou interferências, incompatível com células / tecido de lise / métodos de homogeneização, e / ou não passíveis de multiplexagem 5,8. Algumas dessas questões podem ser abordadas por acoplamento técnicas anticorpo-e baseado no MS. Por exemplo, as proteínas alvo podem ser enriquecidas utilizando imunoprecipitação prévia à proteólise e LC-SRM 9-12. Alternativamente, a técnica emprega SISCAPA imunoprecipitação subsequente à proteólise no leve peptídeol 13,14. Além immunoenrichment estratégias, imunodepleção de proteínas de alta abundância pode ser empregue para aumentar a sensibilidade de LC-SRM, reduzindo a interferência por coeluting analitos 15,16. Quantificação de proteína baseada em MS pode ser dividido em quantificação relativa e absoluta, e também para rotulagem isótopo estável e livre de marcador (por exemplo, a etiquetagem metabólica, marcação química, e pesada da proteína marcada com padrões internos e peptídicos). Técnicas livre de marcador pode ser útil para a quantificação relativa de proteína, mas não são adequados para a quantificação exacta absoluta. Por comparação, técnicas de marcação já reduzida de erro associado com a preparação da amostra e da variância MS, e são muitas vezes utilizados para a quantificação relativa de proteína 17. Por exemplo, os padrões de isótopos estáveis ​​proteoma marcado (SILAP) preparado utilizando uma linha de células humanas de cultura permitiu a quantificação relativa de biomarcadores potenciais através de LC-SRM de soro humano 18. Accurate quantificação absoluta de proteína por MS requer que as normas internas purificada, quantificado, proteínas isotopicamente marcada ou peptídeo ser cravado-em amostras biológicas antes de MS. A incorporação de padrões internos marcados com isótopos pesados ​​em um fluxo de trabalho LC-SRM permite a quantificação absoluta de que foi mostrado ser altamente reprodutível e transferível entre laboratórios 16,19. Rotulados padrões internos de isótopos estáveis ​​para a quantificação absoluta de proteína por MS incluem padrões de peptídeos preparados usando a síntese em fase sólida 20, proteínas compostas de padrões de peptídeos protease clivável concatenadas 21, e padrões de proteína de comprimento total 22. Alvo modificação covalente de proteínas e preparação de amostras incompletas (por exemplo, a lise da amostra incompleta e homogeneização, e solubilização de proteínas incompletas, a desnaturação, a alquilação, e a proteólise) pode prejudicar a quantificação precisa. P Internonormas rotein são os menos susceptíveis de serem afectadas pela maioria desses problemas potenciais, mas eles geralmente são os mais difíceis de preparar. Uma alternativa é a de analisar cada proteína alvo utilizando vários padrões peptídicos internos que são concebidos para incluir os resíduos de flanqueamento nativos amino e carboxi-terminais. Independentemente de qual o tipo de padrão interno é utilizado, ele deve ser cravado-os em amostras biológicas, o mais a altura durante a preparação da amostra quanto possível. Além disso, técnicas de preparação de amostras múltiplas (por exemplo, as diferentes condições de desnaturação) deve ser testado. O uso de várias técnicas experimentais ortogonais (de validação cruzada experimental) é uma estratégia viável para a superação de mais quantificação potencial desafia 23-25. LC-SRM quantificação de proteínas é uma técnica altamente flexível, que foi utilizado numa ampla variedade de aplicações. Notavelmente, tem sido utilizada para estudar peptídicos e proteicos biomarcadores dentroamostras clínicas, tais como soro, biópsias, e punção aspirativa por agulha fina 5. LC-SRM também tem sido utilizado para medir a estequiometria de complexos de proteínas 5,26, para detectar neurotoxinas botulínicas 27, para quantificar dinâmica de fosforilação de proteína dentro de vias de sinalização 5, e para quantificar as alterações na conformação da proteína 28. Nosso laboratório está usando LC-SRM para quantificar as proteínas sinalizadoras que medeiam a quimiotaxia de macrófagos para apoiar o desenvolvimento de simulações via quimiotaxia. O esquema geral do protocolo (Figura 1) começa com o ranking dos peptídeos alvo provisórias. Subsequentemente, padrões externos de péptidos em bruto são sintetizados e utilizados para desenvolver testes de LC-SRM para análises qualitativas de amostras biológicas. Se o péptido alvo biológico derivado de amostra é detectada, padrões peptídicos internos pesados ​​marcado purificados são preparados por LC-quantitativa SRM. Este protocolo pode ser utilizado para accurately quantificar proteínas a partir de uma grande variedade de amostras biológicas, e para apoiar as investigações de uma grande variedade de alvos de proteína.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrila (ACN), grau LC-MS</td> Kit de ensaio de proteína <td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>BCA (ácido bicinconínico)</td><td>Fisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos para bater contas, zircônia-sílica, 0,1 mm</td><td>Produtos BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de bestatina</td><td>Sigma</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM de cultura de células (com glicose, sem L-glutamina)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células EDTA, 500 mM, pH8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células de soro bovino fetal (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células tamponada com fosfato salino (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Cultura de células Trypan Blue coloração de viabilidade, 0,4% w / v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Celômetro Auto T4 contador de células</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Celômetro Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Celômetro Auto T4 câmaras de contagem descartáveis</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td> <td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico, grau LC-MS, ampolas</td><td>Fisher</td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro, Neubauer-melhorado, 0,1 mm de profundidade</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M, pH 7,2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, 37% p/p</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2,5LG</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta baseado em laser</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>LC capilar de sílica revestido, 50 &micro; m id</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>frasco LC, amostrador automático, polipropileno de 12 mm x 32 mm</td><td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>LC tampa de rosca, amostrador automático, pré-fenda PTFE/silicone</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase, de Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pestatina A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de pH colorpHast (pH 0,0-6,0)</td><td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop cocktail inibidor de fosfatase</td><td>Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg cartucho</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, coletor de extração, 20 posições</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, bulbo de borracha de superfície plana</td><td>Fisher</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Concentrador a vácuo Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Fisher SPD111V</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA), grau LC-MS</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grau de sequenciamento,</td><td></td> tubo Promega <td>V5113</td><td></td>modificado</tr><tr><td> decapper para tubos Micronic</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos, microcentrífuga de 2 ml, tampa de rosca com anel de vedação, estéril</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Sigma</td><td>U0631-500g</td><td></td></tr><tr><td>Água, grau LC-MS Fisher</td><td></td><td>W6-1</td><td></td></tr></tbody></table>

reação selecionada monitoramento espectrometria de massa para absolute quantificação de proteína

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

A quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas é fundamental para uma ampla gama de pesquisas e aplicações clínicas. Este protocolo fornece instruções passo a passo para o desenvolvimento e aplicação de ensaios quantitativos usando espectrometria de massa (MS) de monitoramento de reação selecionada (SRM). Primeiro, os peptídeos-alvo quantotípicos prováveis são identificados com base em vários critérios. Isso inclui identificar peptídeos proteotípicos, evitar locais de modificação pós-tradução e analisar a singularidade do peptídeo alvo para a proteína-alvo. Em seguida, padrões brutos de peptídeos externos são sintetizados e usados para desenvolver ensaios SRM, e os ensaios resultantes são usados para realizar análises qualitativas das amostras biológicas. Finalmente, padrões de peptídeos internos purificados, quantificados e marcados com isótopos pesados são preparados e usados para realizar ensaios SRM da série de diluição de isótopos. A análise de todos os dados de MS resultantes é apresentada. Este protocolo foi usado para testar com precisão a abundância absoluta de proteínas da via de sinalização da quimiotaxia dentro das células RAW 264.7 (uma linha celular de monócitos / macrófagos de camundongo). A quantificação de Gi2 (uma subunidade α-proteína G heterotrimérica) é descrita em detalhes.

O desenvolvimento de modelos computacionais preditivos de vias de transdução de sinal é um dos objectivos fundamentais da Biologia de Sistemas 53. Infelizmente, mesmo para as vias de sinalização que têm sido estudados extensivamente e têm um elevado significado clínico, que ainda não é geralmente possível prever o comportamento quantitativamente via em resposta a perturbações (por exemplo, isto é verdadeiro para a MAPK / ERK 54). Recentemente, uma investigação empregada proteômica direcion...

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar cromatografia líquida com monitoramento de reação selecionada, ou L-C-S-R-M, para quantificar a abundância absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas. Após a seleção dos peptídeos-alvo, são sintetizados padrões peptídicos externos brutos e utilizados para desenvolver ensaios SRM por meio de cromatografia líquida e espectrometria de massa, ou LC-MS. Os ensaios resultantes são então empregados para realizar análises qualitativas de LC e SRM em amostras biológicas preparadas.Se o peptídeo-alvo derivado da amostra biológica for detectado, as amostras biológicas são analisadas utilizando ensaios quantitativos de SRM em CL mediante a adição de uma série de diluição com isótopo estável de padrões peptídicos internos. Em última análise, o SRM em CL pode ser usado para quantificar com precisão proteínas provenientes de uma grande variedade de amostras biológicas e apoiar investigações sobre uma ampla gama de alvos proteicos. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como ensaios imunológicos, é que o desenvolvimento do ensaio é relativamente rápido e econômico, e os ensaios resultantes são passíveis de

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Biologia

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Apresentamos um protocolo para identificação e quantificação dos componentes em misturas de espécies que possuem proteínas semelhantes. A espectrometria de massa detecta peptídeos para identificação e fornece quantificação relativa por proporções de áreas de pico. Como alimento de ferramenta para detecção de fraudes, o método pode detectar 1% de cavalo na carne bovina.

Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat

Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

É apresentado um protocolo para extração abrangente de lipídios, metabólitos e proteínas de tecidos biológicos usando uma amostra.

Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.

Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido

O protocolo visa introduzir o uso de um espectrômetro de massa quadrupole triplo para monitoramento de reação múltipla (MRM) de proteínas de amostras clínicas. Fornecemos um fluxo de trabalho sistemático desde a preparação da amostra até a análise de dados para amostras clínicas com todas as precauções necessárias a serem tomadas.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

Um protocolo é apresentado para a determinação de biomarcadores de baixa abundância a partir de amostras secas de soro exemplificadas com o biomarcador progastrina-releasing peptide (ProGRP). Esferas magnéticas revestidas com anticorpos são usadas para a limpeza seletiva e enriquecimento de um peptídeo proteotípico ProGRP. O peptídeo capturado é posteriormente analisado por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem.

Microamostragem em Análise de Proteínas de Baixa Abundância Baseada em Espectrometria de Massa

Aprenda a quantificar proteínas absolutamente usando cromatografia líquida e monitoramento de reação selecionada (SRM) em amostras biológicas complexas. Este método oferece uma alternativa rápida e econômica aos imunoensaios tradicionais.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

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