Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

O objetivo geral deste procedimento é usar cromatografia líquida, monitoramento de reação selecionada ou LCSR para quantificar a abundância absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas. Após a seleção de alvos peptídicos, padrões brutos de peptídeos externos são sintetizados e usados para desenvolver ensaios SRM usando cromatografia líquida, espectrometria de massa ou LCM ms. Os ensaios resultantes são usados para realizar análises qualitativas lc, SRM de amostras biológicas preparadas.

Se o peptídeo alvo derivado da amostra biológica for detectado, as amostras biológicas são analisadas usando ensaios quantitativos de lc SRM, adicionando uma série de diluição de isótopos estáveis de padrões de peptídeos internos. Em última análise, o lc SRM pode ser usado para quantificar com precisão proteínas de uma ampla variedade de amostras biológicas e para apoiar investigações de uma ampla variedade de alvos proteicos. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como imunoensaios, é que o desenvolvimento do ensaio é relativamente rápido e barato, e os ensaios resultantes são passíveis de multiplexação e não são vulneráveis à reatividade cruzada de anticorpos.

Para começar, prepare padrões de peptídeos liofilizados conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de acetonitrila de ácido fórmico a cada M de padrão de peptídeo liofilizado para produzir uma concentração de peptídeo de 10 micromolar. Vortex as amostras por dois minutos e banho.

Sonice-os por cinco minutos para garantir que a dissolução do peptídeo esteja completa. Puxe os peptídeos dissolvidos e concentre a mistura resultante em um concentrador a vácuo até um volume final de 80 microlitros. Adicione 20 microlitros de acetil nitrilo para dissolver qualquer peptídeo precipitado.

A amostra agora contém 10 micromolares de cada peptídeo, bem como 20% de volume a volume de acetil nitrilo e pode ser usada Para preparar os padrões de peptídeos internos e externos, analise as misturas dos padrões de peptídeos externos em aproximadamente um a 10 picomoles de cada peptídeo por injeção por espectrometria de massa shotgun usando um sistema de HPLC de nano fluxo acoplado a um espectrômetro de massa quádruplo triplo. Conforme detalhado no protocolo de texto, certifique-se de que cada execução do LCMS inclua um gradiente linear de 60 minutos, uma etapa de regeneração de coluna e uma etapa de equilíbrio de ree de coluna. Analise os dados shotgun resultantes usando banco de dados, pesquisando contra as sequências dos padrões de peptídeos externos.

Revise manualmente todas as identificações de peptídeos para garantir que todas sejam inequívocas, descartando quaisquer identificações de peptídeos ambíguas. Use as identificações de peptídeos Ms shotgun para construir uma biblioteca de espectro usando um programa de software como o Skyline Line. Prepare uma lista de transições lc SRM usando as três a 10 transições mais intensas por íon precursor.

Use as listas de transição resultantes para realizar a análise lc SRM das misturas dos padrões de peptídeos externos. Revise manualmente os dados L-C-S-R-M resultantes e exclua quaisquer ensaios com baixo desempenho. Para preparar as amostras biológicas.

Primeiro, colha as células conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 400 microlitros de tampão de lise de ureia recém-preparado e misture cada amostra usando uma pipetagem suave. Transfira cada amostra para um tubo de dois mililitros que tenha uma tampa de rosca com um O-ring contendo aproximadamente 100 microlitros de esferas de sílica de zircônia de 0,1 milímetros, células de lice por vórtice das amostras por cinco minutos em banho de velocidade máxima.

Sonicar as amostras por 10 minutos em temperatura ambiente para auxiliar na homogeneização e dematuração da proteína. Em seguida, realize um ensaio de concentração de proteína dos lisados, como um ensaio de ácido bissy para análise qualitativa. Preparar alíquotas de 200 microgramas de lisado celular para uma série de diluições de isótopos estáveis.

Adicionar às amostras a série de diluição de isótopos estáveis da mistura ecomolar dos padrões de peptídeos internos. Reduza os resíduos de proteína cisteína adicionando 0,7 microlitros de um molar DTT a cada amostra e incubando as amostras a 60 graus Celsius por 30 minutos. Alquilar cistinas proteicas adicionando sete microlitros de acetamida ITO tamponada a cada amostra e incubando as amostras em temperatura ambiente por 20 minutos no escuro.

Para cada uma das amostras, adicione 482 microlitros de hees de 100 milimolares ajustados com hidróxido de sódio de modo que a concentração final de uréia seja de um molar. Em seguida, digerir triplamente as proteínas em peptídeos. Adicione oito microlitros de 0,5 microgramas por microlitro de tripsina de grau de sequenciamento a cada amostra que contenha lisado celular.

Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 18 horas. Após a incubação, adicione 440 microlitros de 2% de volume a volume de ácido fórmico e centrifugue todas as amostras a 21.000 G por 20 minutos em temperatura ambiente para granular quaisquer precipitados que obstruam um cartucho C 18 SPE em fase sólida. Extrair cada um dos PUU com um estojo descartável de cartucho C 18 SPE.

Molhe a coluna aplicando um mililitro de tampão B e equilibre-a aplicando um mililitro de tampão a duas vezes. Force as fases móveis através do cartucho C 18 SPE usando uma superfície plana para o bulbo de borracha e um coletor de extração. Aplique a amostra e, em seguida, lave o cartucho com um mililitro de tampão A duas vezes eluir os peptídeos aplicando um mililitro de tampão B. Concentre lentamente cada ilu em um concentrador a vácuo até um volume final de 100 microlitros para evaporar o acetil nitrilo.

Em seguida, adicione dois microlitros, o ácido fórmico de 5% a volume em acetil nitrilo a cada amostra. Analise as amostras usando LCSR qualitativo como antes. Para análise quantitativa de L-C-S-R-M, execute a série de diluição de isótopos de cada amostra biológica que a espectrometria de massa shotgun foi usada para analisar os padrões de peptídeos externos.

As 10 transições mais intensas por precursor foram selecionadas para L-C-S-R-M. L-C-S-R-M foi então usado para analisar os padrões de peptídeos externos. As identificações de peptídeos resultantes devem ser inequívocas.

A análise qualitativa de L-C-S-R-M das amostras biológicas normalmente resultou em mais sinal de fundo, mas a maioria dos alvos peptídicos foi identificada com confiança. O LCSRM quantitativo foi realizado usando padrões de peptídeos internos enriquecidos nas amostras biológicas. Os valores de abundância de proteínas resultantes foram consistentes entre as réplicas biológicas e os dois peptídeos alvo por proteína-alvo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver e realizar ensaios L-C-S-R-M para quantificar a abundância absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas.