Name: Quantificação de citosólico vs vacuolar Salmonella Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprenda a quantificar Salmonella citosólica versus vacuolar em macrófagos primários usando permeabilização diferencial com digitonina. Este método permite distinguir a localização intracelular do patógeno.

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Nós gostaríamos de agradecer Mathias S. Dick, Roland F. Dreier e Sebastian Rühl para discussão. Este trabalho foi apoiado por uma SNSF Professorship PP00P3_139120 / 1 e uma Universidade de Basel concessão projeto ID2153162 para PB

1. Digitonin Ensaio com mCherry expressando Salmonella (Análise baseada em FACS) <ol><li> Preparando bactérias Nota: Salmonella de tipo selvagem SL1344 (resistente à estreptomicina) expressando mCherry partir de um plasmídeo (pFPV mCherry que codifica sob o promotor rpsM) é usado neste ensaio. Fagocitose bacteriana e proliferação onde não alterada pela expressão constitutiva de mCherry (dados não mostrados) 16. <ol><li> Inocular a estirpe 1 dia antes da infecção em 3 ml de meio LB suplementado com estreptomicina (90 ug / ml) e ampicilina (100 ug / ml, mCherry vector de expressão) num agitador a 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Chapeamento de células para a infecção. <ol><li> Semente de tipo selvagem BMDMs em uma placa de 24 poços a uma densidade de 1,25 x 10 5 células / poço em 1 ml de meio de macrófagos primários (DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS, inactivado pelo calor, a 56 ° C, 30 min ), 1% de HEPES, 1% de aminoácidos não-essenciais (NEAA), 1% de L-glutamina e 10% L929 sobrenadante (meio condicionado a partir de macrófagos factor estimulador de colónias (M-CSF), produzindo células L929). Poços de sementes de acordo com a Tabela 1 para ter em conta as condições individuais. Adicionar lamelas aos poços utilizados como controlos (Tabela 1). </li><li> Incubar as células durante a noite numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Permeabilização </td><td colspan="3"> Coloração </td></tr><tr><td></td><td> Lamela de vidro </td><td> Salmonella </td><td> Digitonin </td><td> Saponin </td><td> anti-Salmonella </td><td> anti-Calnexina </td><td> anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (amostra) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (amostra) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (amostra) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (sem controle de permeabilização) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (controle completo permeabilização) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (coradas para calnexina) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (coradas para calnexina) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (coradas para calnexina) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (manchadopara PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (coradas para PDI) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (coradas para PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Regime de chapeamento de medula óssea macrófagos derivados (BMDMs) num formato de 24 poços para a infecção subsequente com Salmonella, permeabilização e coloração * Dependendo se um protocolo ou protocolo 2 é feito.. <ol start="3"><li> Preparando as bactérias para a infecção. <ol><li> No dia seguinte, determinar a concentração de Salmonella em cultura durante a noite por diluição da cultura a 1:10 em PBS e medindo a OD 600 de encontro a um único controlo PBS. Isto assegura que a OD 600 é medida na lgama inear do espectrofotômetro. </li><li> Calcular a concentração de salmonelas por ml. Uma OD600 de 1 corresponde a 1 x 10 9 bactérias. </li><li> Dilui-se as bactérias em forma de macrófagos para atingir uma concentração de Salmonella de 1,25 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> A infecção de células com Salmonella. <ol><li> Remover o meio de BMDMs. Adicionar 1 ml de meio aos poços de macrófagos de controlo não infectados (B1-B3, C1-C3). Adicionar 1 ml de suspensão de Salmonella poços A1 - A5 a chegar a uma multiplicidade de infecção (moi) de 10 bactérias por célula. </li><li> Centrifugar a placa durante 15 minutos a 300 xg a 37 ° C para sincronizar a infecção. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Matar Salmonella extracelular com gentamicina. <ol><li> A 1 h pós-infecção, remova a placa da incubadora e adicionar 0,1 ml de meio de macrófagos contendo 0,1 mg / ml de gentamicinapara matar as bactérias extracelulares. Adicionar gentamicina a todas as cavidades, mesmo com os controlos não infectados, para assegurar que todas as células são tratadas da mesma maneira. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Lavar as células. <ol><li> Às 2 h após a infecção, remover placa da incubadora e lavar os poços 2x com 1 ml de DMEM simples (pré-aquecido a 37 ° C) e substituí-lo por meio de macrófagos (pré-aquecido a 37 ° C) contendo 10 ug / ml &#160; Gentamicina para prevenir o crescimento de todas as bactérias extracelulares restantes. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Preparando padrões frescos com detergentes e anticorpos. <ol><li> Imediatamente antes do ponto de tempo de análise desejado, preparar uma solução de reserva fresca de digitonina a 1 mg / ml em tampão de KHM (acetato de potsio 110 mM, HEPES 20 mM, 2 mM de MgCl2, pH 7,3). Filtrar o estoque e diluir em KHM tampão para uma concentração de trabalhode 50 ug / ml de digitonina. Além disso, preparar uma solução de saponina a 0,1% em tampão de KHM, anticorpo anti- Salmonella acoplado a FITC (CSA-1-FITC) a 1/500, anti-calnexina a 1/100 ou anti-PDI a 1/100 em KHM tampão suplementado com 3% de BSA. </li></ol></li><li> Permeabilização celular. <ol><li> Retire a placa da incubadora e lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C). Remover KHM tampão e adicionar 0,25 ml planície KHM buffer para poços A4 e B1 / C1, KHM tampão com digitonina para poços A1 - A3 e B2 / C2 ou KHM tampão com saponina para poços A5 e B3 / C3 (de acordo com a Tabela 1). Incubar durante exactamente 1 min à temperatura ambiente e imediatamente lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C). </li></ol></li><li> Coloração de anticorpo primário. <ol><li> Remover o tampão de KHM e adicionar as soluções de anticorpos primários (anticorpo de cabra anti -FITC Salmonella, 250 ul / poço, 0,1 ug / ml) aos poços apropriados (Figura 1 </strong&gt;, Tabela 1). Incubar a placa durante 15 minutos num incubador a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Lavam-se as células com 1 ml de 1x PBS. </li></ol></li><li> As células infectadas (poços A1 - A5): análise FACS <ol><li> Lavar as células 3x com PBS e adicionar 0,5 ml de PBS gelado contendo 0,1% de Triton. Transferir para um tubo de 5 ml com tampão FACS coador de células para romper os agregados de células. Manter as amostras em gelo. </li><li> Analisar as amostras de um FACS. Usando os controles totalmente permeabilizadas, defina a porta para as bactérias totais com base na dispersão frontal e lateral (FSC / SSC) em primeiro lugar, eo sinal mCherry (610 nm ± 20 nm filtro). </li><li> Em seguida, analisar o sinal FITC na população bacteriana total usando os controles permeabilizadas totalmente permeabilizadas e não para definir as portas para as bactérias citossólicos (FITC +, mCherry +) e bactérias vacuolares (FITC, mCherry +) (Figura 3). </li><li> Com os portões definido, analisar as amostras e determinar a percentagem de vs citosólicavacuolares bactérias que utilizam software FlowJo de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Permeabilização controles não infectados (poços B1 - B3, C1 - C3): microscopia <ol><li> Fixação <ol><li> Remover PBS e adicionar 250 ul de PFA a 4% em PBS. Incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS e adicionar 250 ul de 0,1 M de glicina em PBS durante 10 minutos para extinguir o fixador. Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Coloração com anticorpo secundário. <ol><li> Controlos permeabilização da mancha por 1 hora à TA com anticorpos secundários acoplados com fluoróforos adequados em PBS suplementado com 0,1% de saponina e BSA a 3% para permeabilizar células completamente. </li><li> Lavar 3x lamelas com 1 ml de PBS e montar as lamelas para análise no meio de montagem com DAPI (1,5 ug / mL). </li></ol></li><li> Análise de microscopia. <ol><li> Analisar as lamelas com os controles em um aumento de 40 vezes 63X ou usando um fluo confocalmicroscópio rescência. Se a permeabilização tem trabalhado, não deve haver nenhuma coloração para células não-permeabilizadas, coloração Calnexina para ambas as células digitonin- e Saponina-permeabilizadas e PDI coloração apenas para células permeabilizadas-saponina (Figura 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Digitonin Ensaio com Unlabeled Salmonella (Análise baseada em Microscopia) <ol><li> Preparando bactérias para o / n culturas. <ol><li> Inocular não marcado Salmonella de tipo selvagem SL1344 (resistente à estreptomicina) 1 dia antes da infecção em 3 ml de meio LB suplementado com estreptomicina (90 ug / ml) num agitador a 37 ° CO / N. </li><li> Chapeamento de células para a infecção. <ol><li> BMDMs semente em uma placa de 24 poços contendo lamelas de vidro esterilizadas a uma densidade de 1,25 x 10 5 células / poço em 1 ml de meio de macrófagos (DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS, complementado-de, 56 ° C,30 min), 1% de HEPES, 1% de aminoácidos L-aminoácidos não-essenciais (NEAA), 1% de L-glutamina e 10% de sobrenadante L929). Poços de sementes de acordo com a Tabela 1 para ter em conta as condições individuais. </li><li> Incubar as células S / N em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Preparando as bactérias para a infecção. <ol><li> No dia seguinte, determinar a concentração de Salmonella na cultura D / N por diluição da cultura a 1:10 em PBS e medindo a OD 600 de encontro a um único controlo PBS. Isto assegura que a OD 600 é medida na gama linear do espectros otómetro. </li><li> Determinar a concentração de Salmonella por mililitro. Uma OD600 de 1 corresponde a 1 x 10 9 bactérias. </li><li> Dilui-se as bactérias em forma de macrófagos para atingir uma concentração de Salmonella de 1,25 x 10 6 células / ml. </li></ol></li><li> A infecção de células com Salmonella. <ol&gt; <li> Remover o meio de todos os poços. Adicionar 1 ml de meio de macrófagos claro para poços de controlo não infectados (B1 - B3, C1 - C3). Adicionar 1 ml de suspensão de Salmonella poços A1 - A5 a chegar a uma multiplicidade de infecção (moi) de 10 bactérias por célula. </li><li> Centrifugar a placa durante 15 minutos a 300 xg a 37 ° C para sincronizar a infecção. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Matar Salmonella extracelular com gentamicina. <ol><li> A 1 h pós-infecção, remova a placa da incubadora e adicionar 0,1 ml de meio contendo macrófagos 1 mg / ml de gentamicina para matar bactérias extracelulares para todos os poços. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Lavar as células. <ol><li> Às 2 h pós-infecção, remova a placa da incubadora e cada poço lavar 3x com 1 ml de meio fresco contendo macrófagos 10 ng / mL Gentamicina para evitaro crescimento de todas as bactérias extracelulares restantes. Transferir a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Preparando padrões frescos com detergentes e anticorpos. <ol><li> Imediatamente antes do ponto de tempo de análise desejado, preparar uma solução de reserva fresca de digitonina a 1 mg / ml em tampão de KHM (acetato de potsio 110 mM, HEPES 20 mM, 2 mM de MgCl2, pH 7,3). Filtra-se o estoque e diluir em tampão de KHM para uma concentração de trabalho de 50 ug / ml de digitonina. </li><li> Além disso, preparar uma solução de saponina a 0,1% em tampão de KHM, anti- Salmonella -FITC (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexina a 1/100 ou anti-PDI a 1/100 em tampão de KHM suplementado com BSA a 3% (ver tabela materiais para a concentração de anticorpo). </li></ol></li><li> Permeabilização celular. <ol><li> Retire a placa da incubadora e lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C). Remover KHM tampão e adicionar 0,25 ml planície KHM bufferpara poços A4 e B1 / C1, KHM tampão com digitonina para poços A1 - A3 e B2 / C2 ou KHM tampão com saponina para poços A5 e B3 / C3 (de acordo com a Tabela 1). Incubar durante exactamente 1 min à temperatura ambiente e imediatamente lavar os poços 3x com 0,5 ml de tampão de KHM (pré-aquecido a 37 ° C). </li></ol></li><li> Coloração de anticorpo primário. <ol><li> Remover o tampão de KHM e adicionar as soluções de anticorpos primários (anticorpo de cabra anti-FITC Salmonella AST1, 250 ul / poço, 0,1 ug / ml) aos poços apropriados (Figura 2, Tabela 1). Incubar a placa durante 15 minutos num incubador a 37 ° C e 5% de CO 2. Lavar 3x com 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Fixação. <ol><li> Remover PBS e adicionar 250 ul de PFA a 4% em PBS. Incubar durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS e adicionar 250 ul de 0,1 M de glicina em PBS durante 10 minutos para extinguir o fixador. Lavar os poços 2x com 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> TotalSalmonella coloração de amostras infectadas. <ol><li> Lavar lamelas 3x com PBS com 0,1% de saponina / BSA a 3% e incubar as amostras com um anticorpo anti-AST1 (de cabra anti-AST1, 0,1 ug / ml, de ratinho anti-LPS funciona bem, 0,1 ug / ml) durante 1 hora à TA em PBS com 0,1% de saponina / BSA a 3%. </li><li> Lavar 3x em PBS com 0,1% de saponina / BSA a 3%. Incubar as amostras com um anticorpo secundário anti-cabra acoplado a escolha do fluoróforo em PBS com 0,1% de saponina / 3% de BSA durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar 3x lamelas com 1 ml de PBS e montar as lamelas para análise no meio de montagem com DAPI (1,5 ug / mL). </li></ol></li><li> Análise de microscopia. <ol><li> Aquisição de dados com um microscópio confocal por contagem de Salmonella citosólica (anti- Salmonella -FITC positivo) e Salmonella total (duplo positivo) (Figura 5). Controles permeabilização deve mostrar: nenhuma coloração para células não permeabilizadas, Calnexina stenção para células permeabilizadas-digitonina e coloração PDI para células permeabilizadas-saponina (Figura 4). Wells A4 e A5 vai servir como controles internos para a coloração de Salmonella. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Não temos nada a divulgar.

Diferencial de permeabilização é um método fácil e robusto para analisar e quantificar a distribuição subcelular de agentes patogénicos bacterianos entre compartimentos vacuolares e o citosol. O mesmo ensaio foi usado com sucesso com bactérias tais como Francisella novicida 2,4 e 12 Shigella flexneri. No entanto, uma vez que muitos patógeno intracelular alterar ou modificar as estruturas de acolhimento de Endomembrane, a robustez da permeabilização digitonina terá de ser determina...

Agentes patogénicos bacterianos intracelulares replicar quer directamente no citosol da célula hospedeira, ou em compartimentos vacuolares especializados 1. Durante a fase inicial da infecção a maioria dos patógenos são internalizadas por fagocitose ou por células especializadas (tais como macrófagos) ou por promover activamente a sua própria absorção em células não fagocíticas. Em células fagocíticas, o fagossoma funde normalmente com lisossomas para formar um compartimento de degradação, em que as partículas são digeridas fagocitados. Bactérias citosólicas especializados, tais como Francisella novicida ou Shigella flexneri, escapar degradação phagosomal por induzir a ruptura do fagossoma e subsequentemente escapar para o citosol 2,3. Isso requer associada a virulência mecanismo como a ilha de patogenicidade Francisella (FPI) ou a Shigella flexneri T3SS, que injeta proteínas efetoras que promovem a ruptura vacuolar 2-4. As características citosol da célula hospedeiraum número de receptores de reconhecimento de padrões conservados que normalmente reconhecem a presença de patógenos e induzem imune inata sinalização 5. Além disso, xenophagy, uma forma anti-microbiana de autofagia pode degradar bactérias que entram no citosol. Citossólicos bactérias são normalmente bem adaptado para diminuir ou burlar estas respostas usando estratégias diferentes. Por exemplo, Francisella modifica suas LPS para evitar o reconhecimento de acolhimento e Shigella impede recrutamento autofagia utilizando proteínas efetoras secretadas 6,7. Outra estratégia para escapar degradação lisossomal é empregado pelo modelo vacuolar patógeno Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, a seguir referido como Salmonella typhimurium. Salmonella usa um T3SS para injetar effectors que remodelar o phagosome inicial em seu nicho intracelular, a Salmonella -contendo vacúolo (SCV) 8,9. Manipulação contínua de vias de acolhimento énecessária para manter este vacúolo recrutando lípidos e outros nutrientes para o vacúolo. De facto, um mutante de Salmonella sifa falha para manter a estabilidade vacuolar, e entra no citosol das células hospedeiras em questão de horas após a infecção, o que resulta na activação de vias imunes inatas e recrutamento autofagia 8. Fuga vacuolar de Salmonella varia dependendo do tipo de célula que é estudos, e vários relatórios demonstraram que em células epiteliais mesmo WT Salmonella pode escapar do VCE e hyperreplicate no citosol 10. Relatórios recentes mostram que a detecção de agentes patogénicos imune inata vacuolares também depende da capacidade do hospedeiro em reconhecer e desestabilizar vacúolos contendo agentes patogénicos PCVs (11-14). Dado que tanto o hospedeiro ou bactérias genótipo pode afectar a distribuição de bactérias intracelulares entre o vacuolar e compartimento citosólico, é necessário para quantificar o número de vacuolar vs.bactérias citosólicas. Uma vez que, em configurações experimentais mais células hospedeiras são infectados com mais do que uma bactéria e, subsequentemente, pode abrigar várias bactérias em diferentes compartimentos subcelulares, uma técnica é necessário que permite a quantificação do nível de bactérias individuais. Permeabilização diferencial (também conhecido como teste de protecção phagosomal) fornece essa resolução 2,4,10,12. O ensaio é baseado na permeabilização selectiva da membrana plasmática da célula hospedeira com o detergente digitonina, o qual deixa intacta membranas vacuolares e, assim, permite que a coloração selectiva de bactérias citosólicas com anticorpos. Aqui nós fornecemos dois protocolos para a quantificação de cytosolic e vacuolar Salmonella typhimurium usando diferencial permeabilização. O princípio deste método é descrita na Figura 1: macrófagos da medula óssea derivadas (BMDMs) são infectadas com fase estacionária mCherry-expressando Salmonella. Fase estacionária Salmonella precisa tO ser utilizados porque regular negativamente a expressão do SPI-1 T3SS, cuja actividade de outro modo seriam reconhecidos pelo inflammasome NLRC4 e induzir a morte celular rápida (pyroptosis) do BMDMs 15. Após a infecção as células são lavadas e tratadas com 50 ug / ml de digitonina para 1 minuto. As células são lavadas mais uma vez e imediatamente incubadas com anticorpos anti- Salmonella acoplado a FITC para marcar as bactérias com o acesso ao citosol. Após um passo de lavagem adicional células são lisadas e a percentagem das bactérias mCherry + (vacuolar) e FITC + / + mCherry (citosólica) é determinada por FACS. Nós também relatam uma adaptação deste método que pode ser utilizado se não há estirpes que expressam proteínas fluorescentes estão disponíveis (Figura 2). Os passos adicionais são introduzidas após a marcação com FITC, em que as células são fixadas e permeabilizadas completamente. Posteriormente, todas as bactérias são coradas com anticorpos anti-Salmonella e anticorpos secundários correspondentes. Detec ç ã o é em seguida feito por microscopia, em vez de análise de FACS.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td>50 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de potássio</td><td>Sigma</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Calnexina</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>anti-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti Coelho anticorpo-488</td><td>Molecular Sondas</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu; g/ml e 10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>imagem feita a 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD tecnologias</td><td></td><td>detecção mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>Detecção de tecnologias</td><td></td> <td>FACS Fortessa</td> BD <td>FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; salmonella</em&gt; em macrófagos primários por permeabilização diferencial

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Agentes patogénicos bacterianos intracelulares podem replicar no citosol ou no vacúolo contendo agentes patogénicos especializados (PCVs). Para atingir o citossol, bactérias como Shigella flexneri e Francisella novicida precisa para induzir a ruptura do fagossoma. Em contraste, Salmonella typhimurium replica num compartimento vacuolar, conhecido como Salmonella vacúolo molecular contendo (SCV). Todavia, certos mutantes de Salmonella não conseguem manter a integridade do VCE e são, assim, libertado para o citosol. A percentagem de bactérias citosólica vs vacuolares sobre o nível de bactérias individuais podem ser medidos por permeabilização diferencial, também conhecido como ensaio de protecção fagossoma. A abordagem faz uso da propriedade de detergente digitonina para se ligar seletivamente o colesterol. Uma vez que a membrana de plasma contém mais colesterol do que outras membranas celulares, digitonina pode ser usado selectivamente para permeabilizar a membrana plasmática, enquanto deixando as membranas intracelularesintacta. Em resumo a seguir à infecção, com o agente patogénico expressando uma proteína marcador fluorescente (por exemplo mCherry entre outros), a membrana plasmática de células hospedeiras é permeabilizadas com uma curta incubação em tampão contendo digitonina. As células são então lavadas e incubadas com um anticorpo primário (acoplado a um fluoróforo de escolha) dirigido contra a bactéria de escolha (por exemplo, anti- -FITC de Salmonella) e lavou-se novamente. Se forem utilizadas as bactérias não marcados, um passo adicional pode ser feito, em que todas as membranas são permeabilizadas e todas as bactérias coradas com um anticorpo correspondente. Após a coloração, a percentagem de vacuolares e citosólicos bactérias podem ser quantificados por microscopia de FACS ou por contagem de eventos simples ou duplos positivos. Aqui nós fornecemos detalhes experimentais para a utilização desta técnica com a bactéria Salmonella typhimurium. A vantagem deste teste é que, em contraste com o outro ensaio, que fornece uma quantificação do nível de único bactericidaRia, e se analisou por microscopia fornece o número exacto de citosólica e bactérias vacuolares numa dada célula.

Figura 1 e Figura 2 mostra o esquema do ensaio digitonina descritos no protocolo 1 e 2 protocolo ilustra as etapas críticas do protocolo e os resultados obtidos. A Figura 3 mostra os resultados típicos de FACS. Os controlos positivos e negativos são usados ​​para definir as portas para mCherry + / bactérias FITC (vacuolar Salmonella) e mCherry + / FITC + bactérias (cytosolic Salmonella). Com base nestes portões a percentagem de bactérias citosólicas e vacuolares pode ser d...

Descrevemos a quantificação de Salmonella typhimurium citosólica e vacuolar em macrófagos derivados da medula óssea usando permeabilização diferencial de digitonina.

Quantificação de citosólico vs vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Em macrófagos primários por Permeabilização Diferencial

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a porcentagem de *Salmonella Typhimurium* citosólica e vacuolar em macrófagos derivados de medula óssea infectados. Isso é alcançado infectando macrófagos com *Salmonella Typhimurium* que expressa mCherry. Como segundo passo, as células são tratadas com o detergente digitonina, que permeabiliza a membrana plasmática, mas não as membranas vacuolares.Em seguida, as células são coradas com um anticorpo anti-Salmonella conjugado ao fluoróforo Zi. Para marcar a Salmonella typhimurium citosólica, os resultados mostram a porcentagem de bactérias citosólicas entre as bactérias totais com base na triagem de células ativadas por fluorescência ou FACS. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da interação com patógenos, como se um patógeno intracelular se replica em uma vacúolo ou no citosol. Inocule a cepa bacteriana um dia antes da infecção em três mililitros de meio Luria-Bertani suplementado com estreptomicina e ampicilina, em agitador a 37 graus Celsius durante a noite, considerando as condições individuais. Adicione lamínulas aos poços de uma placa de 24 poços que serão usados como controles para semear as células para infecção; plante macrófagos derivados de medula óssea selvagens, ou BMdMs, numa densidade de 0,125 milhão de células por poço em um mililitro de meio de macrófago primário, e então incube as células durante a noite em um incubador a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No dia seguinte, determine a concentração de salmonela na cultura de crescimento prolongado medindo a densidade óptica a 600 nanômetros ou OD 600 da cultura diluída em relação ao salino tamponado com fosfato. Isso garante que o OD 600 seja medido na faixa linear do espectrofotômetro.Calcule a concentração de salmonela por mililitro e OD 600 de um que corresponde a 1 bilhão. Dilua as bactérias no meio de macrófagos para atingir uma concentração de salmonela de 1,25 milhão de células por mililitro para infectar as células com salmonela. Remova o meio dos B MDMs.Adicione um mililitro de meio para macrófagos aos poços do controle não infectado, B um a B três e C um a C3. Em seguida, adicione um mililitro de suspensão de Salmonella aos poços A um a A cinco para atingir uma multiplicidade de infecção de 10 bactérias por célula. Centrifugue a placa por 15 minutos a 300 ×g e 37 °C para sincronizar a infecção antes de transferir a placa para incubação a 37 °C e 5% de CO₂ uma hora após a infecção. Retire a placa do incubador para adicionar 0,1 mililitro de meio para macrófagos contendo gentamicina para eliminar as bactérias extracelulares.Adicione gentamicina a todas as placas, inclusive aos controles não infectados, para garantir que todas as células sejam tratadas da mesma forma. Em seguida, transfira a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono duas horas após a infecção. Retire a placa da incubadora e lave todas as placas duas vezes com um mililitro de meio Eagle modificado pré-aquecido, ou DMEM.Substitua o DMEM pelo meio para macrófagos pré-aquecido contendo gentamicina para impedir o crescimento de quaisquer bactérias extracelulares remanescentes antes de transferir a placa de volta para o incubador, logo antes do ponto de tempo desejado para análise. Prepare soluções frescas do tampão KHM, do tampão KHM com digitonina e do tampão KHM com saponina. Além das soluções de anticorpos descritas no protocolo textual para realizar a permeabilização celular, remova a placa do incubador e lave as cavidades três vezes com 0,5 mililitros de tampão KHM pré-aquecido.Em seguida, remova o tampão KHM e adicione 0,25 mililitros de tampão KHM simples aos poços A4, B1 e C1; tampão KHM com digitoína aos poços A1 a A3, B2 e C2; e tampão KHM com saponina aos poços A5, B3 e C3. Incube exatamente por um minuto à temperatura ambiente antes de lavar imediatamente todos os poços três vezes com 0,5 mililitros de tampão KHM PRÉ-AQUECIDO. Por fim, remova o tampão KHM e adicione as soluções de anticorpo primário aos poços apropriados antes de incubar a placa por 15 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, lave as células uma vez com um mililitro de PBS para as células infectadas nos poços A1 a A5.Prepare-se para a análise em fax centrifugando as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de PBS gelado contendo 0,1% de Triton. A seguir, transfira a suspensão celular para um tubo de fax de cinco mililitros com tampa dotada de estrainer celular para dissociar agregados celulares, mantendo as amostras no gelo.Analise as amostras em um citômetro de fluxo utilizando os controles totalmente permeabilizados. Defina a porta para bactérias totais com base na dispersão para frente e na dispersão lateral, bem como no sinal mCherry. Em seguida, analise o sinal fitz na população bacteriana total utilizando os controles permeabilizados e não permeabilizados para definir as portas para bactérias citosólicas e bactérias vacuolares com a porta definida.Analisar as amostras e determinar a porcentagem de bactérias citoplasmáticas versus vacuolares utilizando o software FlowJo. De acordo com o protocolo do fabricante para os controles de permeabilização não infectados nas poças B um a B três e C um a C três, preparar para microscopia removendo o PBS e adicionando 250 microlitros de paraformaldeído 4% em PBS, incubando por 10 minutos a 37 graus Celsius após a incubação. Lavar as poças duas vezes com um mililitro de PBS e adicionar 250 microlitros de glicina 0,1 molar em PBS por 10 minutos para neutralizar o fixador, em seguida lavar as poças duas vezes com um mililitro de PBS para realizar a coloração com anticorpo secundário.Incube os controles de permeabilização por uma hora à temperatura ambiente com anticorpos secundários apropriados conjugados a fluorocromos em PBS, suplementado com 0,1% de saponina e 3% de BSA. Para permeabilizar completamente as células, lave as lamínulas três vezes com um mililitro de PBS e monte as lamínulas para análise em meio de montagem com DAPI.Analise as lamínulas com os controles em uma ampliação de 40 x ou 63 x utilizando um microscópio de fluorescência confocal. São apresentados aqui os resultados típicos. Os controles positivo e negativo são utilizados para definir as portas para bactérias positivas para m-cherry e FITC positivas, que correspondem a *Salmonella* citosólica, e m-cherry positiva e FITC negativa, que corresponde a *Salmonella* vacuolar.Com base nestas portas, a porcentagem de bactérias citosólicas e vacuolares é determinada nas amostras experimentais. Neste exemplo, o tipo selvagem de Salmonella typhimurium positivo para mCherry é comparado a um mutante com deleção CA em macrófagos derivados de medula óssea MI, mostrados aqui com coloração para calnexina e PD1 obtida em controles de permeabilização tratados com digitonina ou saponina. Como a calnexina é uma proteína de membrana do retículo endoplasmático, sua coloração pode ser observada por todo o citoplasma e ao redor do núcleo tanto nas células permeabilizadas com digitonina quanto com saponina. Nos controles permeabilizados com digitonina, nenhuma coloração para PD1 é visível.Embora a coloração possa ser observada em células sasin e permeabilizadas. Um resultado de coloração anti-salmonela em células que foram permeabilizadas com tonina é mostrado aqui. As bactérias totais estão em vermelho, enquanto as bactérias citosólicas estão em verde.A população E positiva é composta por salmonelas com acesso ao citosol. Enquanto isso, a população fite negativa corresponde a bactérias que permanecem em uma vacuolo contendo salmonela intacto, ou VCS, e que, portanto, estão protegidas da marcação por FSE de salmonela. Aqui, a salmonela selvagem é comparada a uma linhagem mutante com deleção de CFE. Como CA é necessário para a salmonela manter a integridade do VCS, uma porcentagem aumentada de salmonela é observada. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a porcentagem de bactérias vacuolares e citosólicas.

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Research

JoVE Journal

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Quantificação de citosólico vs vacuolar

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