Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural
23 de outubro de 2015
A percepção das ações complexas do cérebro requer ferramentas avançadas de pesquisa. Aqui, demonstramos um novo modelo de engenharia 3D baseado em colágeno de seda de tecido neural semelhante à arquitetura do cérebro. O modelo pode ser usado para estudar a montagem da rede neuronal, orientação axonal, interações célula-célula e atividade elétrica.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o processo de engenharia de tecidos cerebrais 3D. Isso é conseguido preparando primeiro os andaimes porosos a partir de solução de seda usando uma técnica de lixiviação de sal. O segundo passo é pré-cortar os andaimes em formas de rosquinha e prepará-los para cultura de células por esterilização e revestimento com poli de licina ou PDL.
Em seguida, os andaimes preparados são semeados com neurônios corticais primários de ratos recém-isolados. A etapa final é a inclusão de colágeno dos andaimes e a transferência para as placas de cultura. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência é usada para mostrar o crescimento neural e o desenvolvimento das redes neurais.
As implicações dessa técnica se estendem à terapia ou diagnóstico de doenças que afetam o cérebro, porque essa técnica pode ser usada como base para o desenvolvimento de novos modelos de pesquisa de Parkinson ou Alzheimer. Antes de começar, prepare a solução de seda a 6% conforme descrito no protocolo de texto e armazene-a a quatro graus Celsius. Para preparar andaimes porosos, primeiro peneire, o cloreto de sódio granular e colete grânulos entre 500 e 600 micrômetros de diâmetro.
Despeje 30 mililitros da solução de seda no molde de politetrafluoretileno ou PTFE e, em seguida, espalhe 60 gramas de cloreto de sódio peneirando uniformemente. A solução. Incubar por 48 horas em temperatura ambiente para polimerizar a seda.
Coloque o andaime contendo o mofo em um forno regulado a 60 graus Celsius por uma hora para finalizar a reticulação da seda e evaporar qualquer líquido restante. Em seguida, mergulhe a combinação de molde e andaime em um copo de dois litros de água destilada por 48 horas. Para lixiviar o sal, troque a água duas a três vezes por dia.
Retire o andaime do molde e corte-o em pedaços pequenos. Primeiro com um punção de biópsia de cinco milímetros de diâmetro. Em seguida, corte o andaime com dois milímetros de altura e remova o centro de cada peça com um punção de biópsia de dois milímetros.
Autoclave os andaimes em ciclo úmido por 20 minutos. Dentro de uma capa de cultura de células, coloque um par de pinças esterilizadas, meios de cultura de células e os andaimes da autoclave. Remova uma placa de 96 poços de sua embalagem e coloque dentro para semear os andaimes.
Primeiro lugar, um andaime estéril por poço. Na placa de 96 poços, adicione meio de cultura de células para imergir os andaimes e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos para equilibrá-los por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, aspirar o excesso de meio dos andaimes.
Em seguida, adicione duas vezes 10 às seis células neuronais corticais de rato em 100 microlitros de meio neurobasal por andaime. Retorne a placa para a incubadora e deixe durante a noite para permitir que as células se prendam ao andaime. Na manhã seguinte.
Aspire cuidadosamente as células não aderidas e substitua por 200 microlitros de cultura de células frescas. Média. Incube a 37 graus Celsius por um breve período. Em seguida, aspire o meio dos poços usando uma pinça estéril.
Transfira os andaimes contendo células para poços vazios dos 96. Poço em cada andaime a 100 microlitros de solução de colágeno de cauda de rato recém-diluída, três miligramas por mililitro de rabo de rato. Retorne as células à incubadora de 37 graus Celsius para permitir a polimerização do colágeno por 30 minutos.
Retire a placa da incubadora e adicione 100 microlitros de cultura de células pré-aquecidas. Retorno médio por poço. Vire a placa para a incubadora pelo período desejado de crescimento celular, substituindo metade do meio de cada poço por meio fresco todos os dias por até uma semana.
Nesses andaimes altamente porosos, as células neuronais podem ser cultivadas em uma alta densidade mostrada. Aqui estão os resultados da viabilidade celular. Um dia após a semeadura de diacetato fluorescente, as células vivas marcadas aparecem em verde e iodeto de propídio e andaime de seda.
Em vermelho, observe a alta porcentagem de células vivas observadas sob baixa ampliação. Esta figura mostra a compartimentalização dos corpos celulares neuronais e processos axonais dentro do andaime em forma de rosquinha. Os corpos celulares neuronais permanecem ligados ao andaime de seda, como visto aqui, um dia após a semeadura, as células são imunocoradas para beta três tubulina e aparecem verdes.
Como esperado, as células povoaram densamente o andaime no sétimo dia de cultura. Em contraste, a matriz de colágeno na cavidade central do andaime fornece suporte para o crescimento axonal extenso. Aqui é mostrada a malha axonal.
Sete dias após a semeadura. Este filme mostra uma varredura Z confocal da janela central de colágeno do andaime contendo as células da rede neural marcadas por coloração para beta três tubulina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar as construções de tecido 3D semelhantes ao cérebro.
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo modelo tridimensional de tecido neural projetado com base em seda-colágeno que imita a arquitetura semelhante à do cérebro. O modelo facilita a investigação da montagem de redes neuronais, orientação axonal, interações célula-célula e atividade elétrica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Engenharia Biomédica
- Engenharia de Tecidos
Contexto
- Compreender a função cerebral exige modelos avançados.
- A engenharia de tecidos 3D pode replicar estruturas semelhantes ao cérebro.
- Este modelo tem como objetivo aprimorar a pesquisa sobre interações neurais.
- Aplicações potenciais incluem o estudo de doenças neurodegenerativas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo 3D para estudar tecido neural.
- Investigar o comportamento neuronal em um ambiente controlado.
- Fornecer uma plataforma para pesquisas terapêuticas futuras.
Métodos Utilizados
- Preparação de scaffolds porosos de seda utilizando lixiviação com sal.
- Cultivo celular de neurônios corticais primários de rato em scaffolds.
- Embebição em colágeno para suportar o crescimento neuronal.
- Microscopia de imunofluorescência para visualizar redes neurais.
Resultados Principais
- Criação bem-sucedida de construtos tridimensionais de tecido semelhante ao cérebro.
- Comprovação da adesão e crescimento neuronal em scaffolds.
- Visualização de processos axonais e viabilidade celular.
- Potencial para modelar doenças como Parkinson e Alzheimer.
Conclusões
- O modelo de seda-colágeno é eficaz para estudos neurais.
- Ele oferece insights sobre interações neuronais e crescimento.
- Essa técnica pode auxiliar no desenvolvimento de novos modelos de pesquisa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Modelos de tecido neural 3D engenheirizados de seda-colágeno atendem à necessidade crítica de sistemas in vitro fisiologicamente relevantes para estudar a arquitetura e a função cerebral. Esta plataforma permite a investigação preditiva da montagem de redes neurais, do direcionamento axonal e das interações célula-matriz, apoiando a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na pesquisa de doenças neurodegenerativas. Seu design compartimentalizado aumenta a continuidade translacional, desde a descoberta até o desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a avaliação funcional do crescimento neuronal e da formação de redes em um ambiente tridimensional controlado.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao modelar a arquitetura de tecido neural compartimentalizado.
- Facilita estudos orientados por hipóteses sobre o direcionamento axonal e as interações célula-célula relevantes para vias de doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Oferece um suporte reprodutível para avaliação quantitativa da viabilidade neuronal e montagem de redes.
- Padroniza a preparação do sistema biológico para triagem de compostos ou estudos de perturbação posteriores.
- Permite imagens de alto conteúdo e leituras baseadas em imunofluorescência para o desenvolvimento de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se à modelagem relevante para doenças relacionadas a distúrbios neurodegenerativos, como Parkinson e Alzheimer.
- Apóia a continuidade da descoberta in vitro à validação pré-clínica, imitando compartimentos nativos do tecido neural.
- Reduz o risco de translação ao fornecer dados fisiologicamente relevantes sobre o comportamento da rede neural.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este modelo de tecido neural tridimensional integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico, conectando estudos mecanicistas iniciais e pesquisas translacionais em neurobiologia.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre a montagem de redes neurais e a compartimentalização axonal.
- Triagem: Fornece plataformas padronizadas e reprodutíveis para análise quantitativa de viabilidade e de redes.
- Análises: Apoia a imunofluorescência e o imageamento de células vivas/mortas para obtenção de dados robustos.
- Pesquisa Translacional: Facilita o alinhamento com a arquitetura de tecido neural relevante para doenças em estudos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um sistema modular e adaptável para diversos fluxos de pesquisa neurobiológica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos neurais e em estudos mecanicistas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a escalabilidade dos fluxos de trabalho de modelagem de tecidos neurais.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avanço ou interrupção ao reduzir a ambiguidade biológica na fase inicial de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de programas voltados a doenças neurodegenerativas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em engenharia de tecidos e técnicas de cultivo primário de neurônios.
- Necessita de acesso a infraestrutura de cultivo celular, fabricação de scaffolds e imagem avançada.
- Exige padronização entre equipes para o preparo reprodutível de scaffolds e semeadura celular.
- Adaptável a diversas fontes neuronais, mas pode exigir otimização do protocolo para diferentes espécies ou tipos celulares.
- As limitações incluem a dependência de neurônios primários de rato e possíveis restrições de escalabilidade para aplicações de alto rendimento.
