Name: Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprenda a criar modelos 3D de tecido neural usando scaffolds de seda e colágeno com neurônios corticais de rato. Esta técnica permite estudar redes neurais e interações celulares para pesquisas em doenças neurodegenerativas.

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Agradecemos ao laboratório do Dr. Stephen Moss por fornecer tecidos cerebrais embrionários de ratos. M.D.T. projetou o protocolo original. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. foi apoiado com bolsa de pós-doutorado da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) (CH 1400/2-1).

O protocolo de isolamento tecido cerebral foi aprovado pelo Comitê da Universidade Tufts Animal Care Institucional e Use e está em conformidade com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institutional Animal Care e do Comitê Use B2011-45). 1. Silk Andaime Preparação <ol><li> Preparação de solução de seda Bombyx mori casulos como descrito anteriormente 19,20. <ol><li> Corte cada casulo em 8 pedaços iguais usando uma tesoura. Use cerca de 11 casulos para 5 g de casulos fragmentados. (15 min) </li><li> Prepare 2 L de 0,02 M Na 2 CO 3 solução e trazê-lo para ferver utilizando um prato quente. (15 min) </li><li> Pesar 5 g de casulos fragmentados e ferve-las em Na 2 CO 3 solução durante 30 min. Agita-se a seda ferver a cada dois minutos com uma espátula. Esta etapa, também chamado de-resinagem, purifica fibroína de seda a partir de proteínas hidrófilas, sericins. (30 min) </li><li&gt; Torça o fibroï¿½a à mão e lave-o em água destilada pelo menos três vezes para lavar qualquer sericina restante e produtos químicos. (5 min) </li><li> Coloque a fibroína molhado numa placa de Petri e secar o extracto de fibroína na câmara de fluxo S / N. </li><li> No dia seguinte, pesar a massa seca fibroína e colocar a fibroína numa proveta de vidro. (15 min) </li><li> A fim de dissolver a fibroína em 9,3 M solução de LiBr, calcular o volume necessário (em ml) de LiBr multiplicando a massa de fibroína seco por 4. verter lentamente sobre solução de LiBr a fibroína de seda e mergulhe todas as fibras de fibroína usando uma espátula. Tapar o copo para evitar a evaporação e colocá-lo a 60 ° C durante 4 horas para permitir que as fibras se dissolva. (15 min) </li><li> Usando a seringa, recolher a solução fibroï¿½a do copo e carregá-lo para os MWCO 3.500 cassetes de diálise. Executar a diálise contra água destilada durante 48 horas. Troque a água a cada duas horas. </li><li> Usando a seringa, recolher a solução de fibroínaas cassetes em tubos de 50 ml de centrífuga cónicos e duas vezes a 9000 rpm (~ 12.700 xg) a 4 ° C durante 20 min. Verter o sobrenadante para um tubo fresco após cada passo de centrifugação e descarte do sedimento. (40 min) </li><li> Medir a concentração de fibroína através da estimativa do peso seco. Despeje 1 ml de solução de seda em um barco pesar. Seca-se a amostra no forno a 60 ° C durante 2 horas. Pesar a fibroína de seda seca e calcular a concentração de uma solução de fibroína de seda, multiplicando o peso obtido por 100. A concentração esperada de solução de seda é de 6-9% (w / v). </li><li> Ajustar a concentração de seda a 6% (w / v) diluindo-o em água destilada. Ponto de paragem: O líquido de fibroína de seda pode ser armazenado a 4 ° C durante até um mês em um recipiente fechado. </li></ol></li><li> Preparação de matrizes porosas a partir de solução de seda. <ol><li> Peneirar o granulado de NaCl para separar os grânulos de tamanho 500-600 um, que será utilizado nas etapas posteriores. Descartar o grânulos dimensionados abaixo de 500 um e acima de 600 um. (15 min) </li><li> Pour 30 ml de solução de seda 6% no molde de politetrafluoretileno (PTFE) (Figura 1). Delicadamente espalhar 60 g de NaCl peneirada sobre a seda. Toque no recipiente para se obter uma camada uniforme de sal. Incubar 48 horas à temperatura ambiente para polimerizar o seda. </li><li> Coloque o molde de PTFE contendo andaime no forno a 60 ° C durante 1 h para finalizar a polimerização e evapora-se o líquido restante. </li><li> Colocar o conteúdo do molde de PTFE num copo contendo 2 L de água destilada durante 48 horas para lixiviar o sal. Troque a água 2-3 vezes por dia. Remover os andaimes de esponja dos moldes quando o sal é completamente lixiviado para fora do ponto final:. As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 ° C num recipiente fechado para evitar que os suportes de desidratação. </li><li> Quando estiver pronto, cortar os andaimes com 5 milímetros de diâmetro biópsia soco. Pré-cortar os andaimes para chegar a cerca de 2 mm de altura. PuNCH ​​para fora do centro do andaime com a 2 mm de diâmetro punção para biópsia (Figura 2A). (1 h) </li><li> Autoclave os andaimes imersas em água para esterilizá-los (ciclo molhado, 121 ° C, 20 min) Ponto de paragem:. As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 ° C num recipiente fechado para evitar que os suportes de desidratação. </li><li> Antes da sementeira celular prevista, imergir os suportes na solução estéril a 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (PDL). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> Lavar os andaimes 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover PDL não ligado. (30 min) </li></ol></li></ol> 2. Isolamento de Rato Os neurónios corticais <ol><li> Dissecar córtices do dia embrionário 18 ratos (E18) Sprague-Dawley como previamente descrito por Pacifici e Peruzzi 27 após protocolo de animais aprovado seja obtido. (2 h) </li><li> Incubar 10 córtices em 5 ml de 0,25% de tripsina com 0,3% de DNase I (a partir de pâncreas bovino) durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Inactivar a tripsina por adição de igual volume de 1 mg / ml de proteína de soja. </li><li> Triturar os córtices usando 10 ml de pipeta Pasteur por pipetagem cima e para baixo 20 vezes, até uma suspensão única célula é gerada. Seja gentil e evitar a formação de bolhas de ar. (10 min) </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 127 xg durante 5 min. </li><li> Re-suspender o sedimento celular em 10 ml de meio de cultura (meio Neurobasal, 1x suplemento de B27, 1x Glutamax, 1% de penicilina / estreptomicina). Contar as células. A concentração de células é de cerca de 2x10 esperado 7 / ml. (20 min) </li></ol> 3. Construa Assembleia e Cultura <ol><li> Semeadura andaime com células. <ol><li> Mova os andaimes estéreis e todos os utensílios necessários dentro de uma capa de cultura de célula. Utilizando fórceps estéreis os colocar andaimes em uma placa de 96 poços de cultura de células alocar um andaime por poço. (10 min) </li><li> Mergulhe os andaimes em meio de cultura de células para equilibrar-los antes para a célula de sementesing. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. (10 min) </li><li> Aspirar o excesso de a forma de andaimes. </li><li> Aplicar 100 ul de suspensão de células / andaime. (10 min) </li><li> Incubar as células a 37 ° CO / N para permitir a fixação de células ao andaime. </li><li> Na manhã seguinte aspirar as células não ligadas e aplicar 200 ul / poço de meio de cultura fresco. (10 min) </li></ol></li><li> Andaime com a incorporação de matriz de colagénio. (2 h) <ol><li> Coloque 10x PBS, água, NaOH 1 N e rato cauda I colágeno no gelo. Preparar uma solução de trabalho de colagénio de acordo com as instruções do fabricante. Manter em gelo até que as construções de células semeadas está pronto (até 1 hora). </li><li> Retirar as construções de células-seda semeado da incubadora e aspirar o excesso de meio. </li><li> Utilizando fórceps estéreis os andaimes para transferir os poços vazios na placa e assim imergir cada andaime em 100 ul de solução de colagénio de 3 mg / ml. Coloque a placa de cultura de tecidos de voltana incubadora durante 30 min para permitir a polimerização do colagénio. </li><li> Adicionar 100 ul de meio de cultura de células pré-aquecido / poço. Cultura das construções durante uma semana de mudar o meio todos os dias, substituindo metade do volume do meio. </li></ol></li></ol> 4. Análise de Microscopia <ol><li> Coloração Live / mortos (1 hr) <ol><li> Preparar a solução de estoque de iodeto de propídio (PI) a 1 mg / ml (1,5 mM) em água destilada. </li><li> Preparar a solução de estoque de diacetato de fluoresceína (FDA) de 2 mg / ml em acetona. </li><li> Preparar uma solução de trabalho contendo 10 PI uM e 0,15 uM FDA diluído em PBS. Pré-aquecer a solução a 37 ° C num banho de água. </li><li> Lavam-se as células com PBS pré-aquecido para remover as esterases do soro. Aspirar o PBS. </li><li> Aplicar a solução pré-aquecida de trabalho sobre as células durante 2 minutos e lavá-lo com PBS. </li><li> Uso de microscópio de epifluorescência a imagem das células (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). A mancha permanece estável ao longo de 40 min. Coloração prolongado pode resultar em coloração inespecífica resultante da absorção pelas células PI e de co-localização de PI / FDA em células. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> No ponto de tempo de cultura desejado fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 30 min à TA. Devido à toxicidade do PFA emanações o passo de fixação deve ser realizada na hotte química. </li><li> Lavar 3x com PBS andaimes Ponto de paragem:. As construções de PFA-fixadas podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante vários dias antes de prosseguir com outros passos. </li><li> Incubar os andaimes em 0,2% de Triton, 0,25% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS contendo anticorpo primário O / N a 4 ° C. </li><li> No dia seguinte descartar a solução de coloração e lavar os andaimes 3 x 30 min com PBS para remover o anticorpo primário não ligado. </li><li> Incubar as amostras com anticorpo secundário diluído em 0,2% de Triton, 0,25% de BSA em PBS durante 2h à TA. </li><li> Remover a solução de coloração e lavar os andaimes 3 x 30 min com PBS para remover o anticorpo secundário não ligado. </li><li> Imagem andaimes utilizando um microscópio confocal com objetivo 20X, tendo 100 mm z-seções da amostra com 1 um passo. Para visualizar as neurites finas a resolução da imagem deve ser de no mínimo 1.024 x 1.024 pixels. </li></ol></li><li> ARN, ADN e o isolamento das proteínas Nota: RNA, DNA e isolamento de proteínas é realizada utilizando um ADN comercial AllPrep / ARN / proteína Mini Kit de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Utilizando uma pinça estéril transferir os andaimes de placa de cultura para um tubo de 2 ml estéril. Coloque um andaime por tubo. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão RLT a cada tubo. </li><li> Disrupt a construção fragmentando-o com microtesoura estéreis. </li><li> Para homogeneizar o tecido perturbado, transferir o conteúdo do tubo para a coluna de centrifugação. Girar por 2 min a toda a velocidade numa micro.O lisado é homogeneizado à medida que passa através da coluna de spin. </li><li> Recolhe-se o fluxo através e utilizá-la imediatamente para isolar o ARN, ADN e proteína, seguindo o protocolo do fabricante. </li><li> Quantificar a produção dos ácidos nucleicos de qualquer outro método compatível (por exemplo, NanoDrop). </li><li> Quantificar a produção de proteína utilizando o BCA Protein Assay de acordo com as instruções do fabricante. Medir o resultado de ensaio usando leitor de microplacas a 562 nm de comprimento de onda. Nota: O rendimento esperado de ácidos nucleicos e proteínas, por construção, em relação à densidade de células é mostrada na Figura 4. </li></ol></li></ol>

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A publicação deste vídeo-artigo é patrocinado pela Corning.

Aqui descrevemos as diretrizes para montar um modelo de tecido semelhante ao cérebro 3D compartimentado. O modelo é caracterizado por uma densa cultura polarizada de neurônios, resultando no desenvolvimento de dois compartimentos morfologicamente diferentes: um contendo corpos celulares densamente compactados, o segundo contendo redes axonais puras. No geral, a arquitetura do andaime e o padrão de crescimento imitam o tecido cortical do cérebro, incluindo as seis camadas laminares e os tratos de substância branca21.
O modelo de tecido à base de proteína de seda em forma de rosquinha permite modificações e ajustes de propriedades mecânicas, formas estruturais versáteis, cargas de hidrogel e componentes celulares. Assim, este modelo de tecido estabelece uma plataforma base para uma ampla gama de estudos. A seda é uma candidata favorável para plataformas de biomateriais devido à sua biocompatibilidade, processamento à base de água e propriedades mecânicas e de degradação robustas22. A matriz de seda também serve como uma âncora estável para reduzir a contração do gel de colágeno ao longo do tempo em cultura. As propriedades como concentração de seda e porosidade do andaime usado neste modelo foram previamente ajustadas para alcançar o crescimento celular ideal e propriedades mecânicas, resultando em elasticidade do tecido semelhante ao cérebro18,23,24. Sugerimos manter esses parâmetros constantes para garantir o resultado bem-sucedido e a reprodutibilidade dos experimentos.
A formação da rede neuronal 3D foi alcançada pela combinação de dois tipos de biomateriais com diferentes propriedades mecânicas: um andaime rígido para fornecer ancoragem neuronal e uma matriz de gel mais macia para permitir a penetração e conectividade do axônio em 3D. As preferências materiais seletivas do andaime de seda e do hidrogel macio fornecem o princípio subjacente para compartimentar os neurônios das conexões axonais. Devido à natureza inerte do andaime de seda, a funcionalização com poli-D-lisina é necessária para a fixação neuronal. No entanto, outros fatores promotores de adesão celular podem ser aplicados, como RGD25 ou fibronectina26. Para alcançar a formação da rede 3D, o andaime de seda precisa ser preenchido com hidrogel em tempo hábil, assim que os neurônios estiverem ligados ao andaime. Da mesma forma, o preenchimento da matriz de colágeno pode ser substituído por outros hidrogéis, permitindo assim o estudo da influência de ambientes extracelulares 3D na formação da rede axonal para servir como uma plataforma para avaliar novos hidrogéis em termos de compatibilidade neuronal. Além disso, além dos neurônios corticais de ratos, outras fontes neuronais, como neurônios do hipocampo ou neurônios derivados de células pluripotentes induzidas (iPSc), podem ser utilizadas. Além disso, o modelo de tecido pode ser usado para estudar interações heterocelulares, incluindo células gliais junto com neurônios e para construir tecidos cerebrais mais complexos.
Como mostrado anteriormente, nosso modelo pode ser utilizado para avaliar a funcionalidade neuronal em microambiente 3D com uma variedade de ensaios, como viabilidade celular, expressão gênica, LC-MS/MS e eletrofisiologia, demonstrando assim a relevância fisiológica do modelo18. Outros métodos, que são frequentemente utilizados para avaliar construções de engenharia de tecidos 3D, como imunocoloração e microscopia8,9,11 , também podem ser usados para avaliar a distribuição celular e a extensão da formação da rede axonal. No entanto, deve-se notar que, devido à alta densidade da matriz de colágeno, a penetração de anticorpos e a profundidade da imagem são limitadas a algumas centenas de micrômetros. Além disso, a relação sinal-ruído pode ser afetada por fluorescência de fundo inespecífica. Isso pode ser superado com o uso de marcadores de células lipofílicas e proteínas fluorescentes geneticamente expressas, que diminuem a necessidade de imunomarcação11. Alternativamente, a imagem pode ser realizada com microscopia de 2 fótons em vez da técnica usual de um fóton, o que pode reduzir a perda de sinal, fotobranqueamento e pode ser estendido a várias centenas de micrômetros de profundidade.
Resumindo, o tecido semelhante ao cérebro à base de seda e colágeno oferece uma plataforma robusta para estudar redes neuronais em 3D e é um ponto de partida para o desenvolvimento de modelos mais avançados de distúrbios neurológicos no futuro. Independentemente do modo de avaliação, a relativa simplicidade deste modelo de tecido suporta sua utilidade, sucesso e reprodutibilidade.

O sistema nervoso central (SNC) pode ser afectada por uma variedade de desordens que envolvem vascular, estrutural, funcional, infecciosas ou degenerativas. Estima-se que 6,8 milhões de pessoas morrem a cada ano em conseqüência de distúrbios neurológicos, o que representa um fardo socioeconômico crescente em todo o mundo 1. No entanto, apenas algumas das desordens têm tratamentos disponíveis. Portanto, há uma necessidade crítica de estratégias terapêuticas inovadoras para pacientes que sofrem de distúrbios neurológicos. Infelizmente, muitas terapias CNS segmentados falhar durante os ensaios clínicos, em parte devido à utilização de modelos de investigação pré-clínica inadequados, que não permitem a avaliação dos impactos agudos e crônicos com leituras funcionais fisiologicamente relevantes. Apesar dos esforços de investigação significativos nas últimas décadas, há uma vasta quantidade desconhecida sobre a estrutura e função do SNC. A fim de ganhar mais conhecimento, modelos animais são freqüentemente nósEd para modelar estados patológicos, tais como lesão cerebral traumática (TBI) ou demência, especialmente em estudos pré-clínicos. No entanto, os animais a partir de seres humanos diferem significativamente tanto na anatomia do sistema nervoso central, bem como em função, a expressão do gene e metabolismo 2-4. Por outro lado, in vitro, culturas 2D são o método mais comum para investigar a biologia celular e são rotineiramente utilizado para descoberta de drogas. No entanto, as culturas de células em 2D falta a complexidade e relevância fisiológica em comparação com cérebro humano 5-7. Enquanto não há substituto para o baixo custo e simplicidade de estudos de cultura de células em 2D ou a complexidade fornecida por modelos animais, a engenharia de tecidos 3D poderia gerar melhores modelos de pesquisa para fechar a lacuna que existe entre o 2D in vitro e in vivo abordagens. Engenharia de tecidos 3D fornece condições experimentais mais fisiologicamente relevantes obtidos por 3D interacções célula-célula e sinais extracelulares previstos pelos andaimes biomaterial. Despite a evidência significativa por trás do valor das culturas 3D, existem atualmente apenas alguns modelos de tecido do sistema nervoso central, tais como 3D-tronco derivadas de células culturas organï¿½de 8-10, neurospheroids 11 e disperso culturas hidrogel 12,13. Métodos de técnicas avançadas de multicamadas, incluindo a litografia 14, e impressão em 3D 15 foram utilizados para o estudo do pulmão, fígado, rim e tecido. No entanto, existe a falta de modelos 3D do SNC que permitam o crescimento neuronal compartimentada, como imitando a arquitetura cortical e biologia. Separado do crescimento de neurites a partir de corpos de células neuronais foi anteriormente demonstrada em culturas 2D utilizando microfabricação 16,17 permitindo que o estudo de rastreio tracto axónio, o influxo de cálcio, arquitetura de rede e actividades. Esta idéia nos inspirou a desenvolver um tecido neural polarizada 3D onde os corpos celulares e tratos axonais estão localizados em diferentes compartimentos imitando a arquitetura em camadas do cérebro 18 </sup&gt;. A nossa abordagem é baseada no uso de design único andaime de seda que pode acomodar até alta densidade de células em um volume confinado e permite excrescência axonal de rede densa em um gel de colagénio. Aqui demonstramos o procedimento completo conjunto de tecido cerebral semelhante, incluindo a fabricação de andaime e cultura neuronal.

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td><td>de diálise Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500&nbsp;</td>Placa de aquecimento <td>Thermo Fisher</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrífuga Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>5804 R</td><td>Peneira Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>No. 270, No. 35, No. 30</td></tr><tr><td>Molde</td><td></td><td></td> de PTFE <td>feito em casa (<forte>Figura 1</forte>) 10 cm de diâmetro, 2 cm de altura</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>Punção de Biópsia 5&#160; mm</td><td>Instrumento de Precisão Mundial</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>Punção de Biópsia 2&#160; mm</td><td>Instrumento de Precisão Mundial</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>concentração final 10&#160; &#956; g/ml, dissolvido em água</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>concentração final 0,3%</td></tr><tr><td>Proteína de soja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>concentração final 1&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>aquecer até 37&#160; &deg; C antes de usar</td></tr><tr><td>Suplemento B27 50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, cauda de rato, 100&#160; mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>concentração final 3&#160; mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>corrosivo</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-10MG</td><td></td></tr><tr><td>tóxico Diacetato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX10</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>tóxico, concentração final 4%</td></tr> <tr><td>bovino Albumina sérica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta; IIITubulina anticorpo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>coelho 1:500</td></tr><tr><td>anti-coelho Alexa-546</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11010</td><td>cabra 1:250</td></tr><tr><td>soro de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP2 microscópio confocal</td><td>Leica</td><td></td><td>objetiva 20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Proteína Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico, Pure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 Espectrofotômetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td> BCA ensaio de proteína Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas Spectramax M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>absorbância 562 nm</td></tr><tr><td>Micro Tesoura, Economia, tipo Vannas</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

baseada em silk-colágeno engineered 3d model of tissue polarizada neural

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Apesar dos enormes esforços para decifrar a anatomia, composição e função do cérebro, ele continua sendo o órgão menos compreendido do corpo humano. Para obter uma compreensão mais profunda do sistema neural, os cientistas pretendem reconstruir de forma simplista o tecido, montando-o in vitro a partir de blocos de construção básicos usando uma abordagem de engenharia de tecidos. Nosso grupo desenvolveu um modelo cerebral 3D baseado em seda e colágeno de engenharia de tecidos, semelhante à substância branca e cinzenta do córtex. O modelo consiste em uma esponja porosa de seda, que é pré-semeada com neurônios derivados do cérebro de rato, imersos em matriz de colágeno mole. O crescimento neuronal polarizado e a formação de redes são observados com localização axonal e de corpo celular separadas. Essa arquitetura compartimental permite o desenvolvimento exclusivo de nichos que imitam o tecido neural nativo, permitindo assim a pesquisa sobre montagem de redes neuronais, orientação axonal, interações célula-célula e célula-matriz e funções elétricas.

Sólido de seda esponjas pré-cortada com a forma de rosca representam uma ideia original e simples para conseguir uma arquitectura semelhante a tecido neural compartimentada (Figura 2A). A estrutura altamente porosa do andaime com o tamanho de poro de cerca de 500 um resultado em área superficial excepcionalmente elevada permitindo a sementeira e o crescimento de elevada densidade celular dentro de um pequeno volume (2x10 7 / ml) (Figura 2B). Além disso, a elevada porosidade do andaime permite a difusão livre de nutrientes e resíduos que resultam em viabilidade superior de culturas celulares densas sobre quadros de tempo prolongado. Após a sementeira dos neurónios rápida e uniformemente aderem à superfície dos poros de andaime. Após a fixação das células está concluída e as células são equilibradas sobre o substrato de seda, o andaime esponja é preenchido com a matriz de colagénio macio, a fim de proporcionar um ambiente 3D para a formação da rede axonal (Figura 3 </strong&gt;). Na ausência de matriz de colagénio a compartimentalização dos axónios e corpos celulares não é possível, como neurónios extensões crescer apenas na superfície dos poros, resultando em redes mistas como encontrado com superfícies 2D (Figura 3B). Em contraste, o gel de colagénio proporciona uma malha que suporta grande crescimento axonal em 3D, enquanto que os corpos celulares neuronais permanecer ligado ao andaime de seda (Figura 3C). Este padrão de crescimento conduz a compartimentalização de corpos celulares axonais e redes puros (Figura 3D), o qual se assemelha a matéria cinzenta e branca do córtex do cérebro. Além de microscopia, as construções podem ser avaliadas com uma variedade de outros métodos de 18, dependendo da questão por trás do experimento. Por exemplo, o isolamento de ADN, ARN e proteína a partir das construções podem ser facilmente realizados utilizando kits comerciais (Figura 4). O rendimento de ácidos nucleicos e de proteínas PER construção depende do número de células inicialmente semeadas em andaimes de seda. Quanto mais células semeadas quanto maior o rendimento de ADN, ARN e proteína. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> Figura 1. PTFE molde utilizado para a preparação esponja seda andaime As dimensões:.. 10 cm de diâmetro, a 2 cm de altura <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> Figura 2. Modelo 3D tecido cerebral-like. (A) poroso esponja seda andaime. (B) Live / coloração de neurônios mortos no dia 1 após a semeadura na seda andaime antes de colágeno incorporação (células verdes-live, células red-mortos). Painéis sobre lado direito mostrar a magnification da área capturada em molduras vermelhas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> Figura 3. Neuronal conseqüência compartimentada no modelo de tecido cerebral do tipo 3D (A) compartimentos: Andaime. Compartimento corpo de células Red, Blue-compartimento axonal. (B) padrão de crescimento neuronal no dia 1 após a semeadura antes incorporação de colágeno. (C). Crescimento neuronal no dia 7 após a sementeira no compartimento do corpo da célula. (D) excrescência Neuronal no dia 7 após a semeadura no compartimento axonal. Green -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> Figura 4. Rendimento esperado de (A) RNA e DNA, e proteínas (B) por construção em relação à quantidade de células semeadas por andaime (± SD, n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .</a>

A percepção das ações complexas do cérebro requer ferramentas avançadas de pesquisa. Aqui, demonstramos um novo modelo de engenharia 3D baseado em colágeno de seda de tecido neural semelhante à arquitetura do cérebro. O modelo pode ser usado para estudar a montagem da rede neuronal, orientação axonal, interações célula-célula e atividade elétrica.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o processo de engenharia de tecidos semelhantes ao cérebro tridimensionais. Isso é alcançado primeiramente pela preparação de estruturas porosas a partir de solução de seda, utilizando uma técnica de lixiviação com sal. O segundo passo consiste em cortar previamente as estruturas em formato de rosca e prepará-las para o cultivo celular mediante esterilização e revestimento com poli-d-lisina ou PDL.Em seguida, os suportes preparados são semeados com neurônios corticais primários de rato recém-isolados. O passo final é a incorporação dos suportes em colágeno e transferência para as placas de cultura. Por fim, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para demonstrar o crescimento neural e o desenvolvimento de redes neurais.As implicações dessa técnica estendem-se à terapia ou diagnóstico de doenças que afetam o cérebro, pois este método pode ser usado como base para o desenvolvimento de novos modelos de pesquisa de Parkinson ou Alzheimer. Antes de iniciar, prepare a solução de seda a 6% conforme descrito no protocolo do texto e armazene-a a quatro graus Celsius. Para preparar os suportes porosos, primeiro peneire o cloreto de sódio granular e colete grânulos com diâmetro entre 500 e 600 micrômetros.Despeje 30 mililitros da solução de seda no molde de politetrafluoretileno ou PTFE e, em seguida, espalhe uniformemente 60 gramas de cloreto de sódio peneirado sobre a solução. Incube por 48 horas à temperatura ambiente para polimerizar a seda.Coloque o suporte contendo o molde em uma estufa ajustada a 60 graus Celsius por uma hora para finalizar a reticulação da seda e evaporar qualquer líquido remanescente. Em seguida, imerja a combinação de molde e suporte em um béquer de dois litros contendo água destilada por 48 horas. Para remover o sal, troque a água duas a três vezes por dia.Remova o andame do molde e corte-o em pequenos pedaços. Primeiro, com um punch de biópsia de cinco milímetros de diâmetro. Em seguida, corte o andame para que tenha dois milímetros de altura e remova o centro de cada peça com um punch de biópsia de dois milímetros.Esterilize as estruturas em autoclave em ciclo úmido por 20 minutos. Dentro de uma câmara de cultura celular, coloque um par de pinças esterilizadas, meio de cultura celular e as estruturas esterilizadas em autoclave. Retire uma placa de 96 poços da embalagem e coloque-a dentro para semear as estruturas.Primeiro, coloque um suporte estéril por poço. Na placa de 96 poços, adicione meio de cultura celular para imergir os suportes e incube a 37 graus Celsius em uma estufa de cultura de tecidos para equilibrá-los por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, aspire o excesso de meio dos suportes.Em seguida, adicione duas vezes 10 à sexta potência de células neuronais corticais de rato em 100 microlitros de meio neurobasal por andamio. Retorne a placa ao incubador e deixe durante a noite para permitir que as células se adiram ao andamio. Na manhã seguinte.Aspire cuidadosamente as células não aderidas e substitua por 200 microlitros de meio fresco de cultura celular. Incube a 37 graus Celsius por um período breve. Em seguida, aspire o meio dos poços utilizando pinças estéreis.Transfira os andamios contendo células para poços vazios da placa de 96 poços e, em seguida, adicione a cada andamio 100 microlitros de solução de colágeno de cauda de rato, diluída recentemente e mantida sob gelo, a três miligramas por mililitro. Retorne as células ao incubador a 37 graus Celsius para permitir a polimerização do colágeno por 30 minutos.Retire a placa do incubador e adicione 100 microlitros de meio de cultura celular pré-aquecido por poço. Devolva a placa ao incubador pelo período desejado de crescimento celular, substituindo metade do meio de cada poço por meio fresco diariamente, durante até uma semana.Nestas estruturas altamente porosas, as células neuronais podem ser cultivadas com alta densidade, conforme mostrado. Abaixo estão os resultados de viabilidade celular. Um dia após a semeadura, as células vivas marcadas com diacetato fluorescente aparecem em verde e o iodeto de propídio e a estrutura de seda.Em vermelho, observe a alta porcentagem de células vivas observadas em baixa ampliação. Esta figura mostra a compartimentalização dos corpos celulares neuronais e dos processos axonais dentro da estrutura em forma de rosca. Os corpos celulares neuronais permanecem aderidos ao suporte de seda, como visto aqui um dia após a semeadura; as células são imunomarcadas para a tubulina beta três e aparecem em verde.Como esperado, as células já haviam colonizado densamente a estrutura até o sétimo dia de cultivo. Em contraste, a matriz de colágeno no interior oco da estrutura fornece suporte para o crescimento extenso de axônios. É mostrada aqui a rede axonal.Sete dias após a semeadura. Este vídeo mostra uma varredura confocal em Z da janela central de colágeno do andamio contendo as células da rede neural marcadas por coloração para a tubulina beta três. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar os construtos de tecido tridimensionais semelhantes ao cérebro.

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Bioengineering

Bioengenharia

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