Name: Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a técnica de deposição microfluídica de genipina para criar filmes finos musculares vasculares micropadronizados. Este método mantém a viabilidade tecidual e a contratilidade funcional por até duas semanas em cultura.

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Reconhecemos o apoio financeiro do American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) e da University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). Também reconhecemos os recursos de microfabricação do Minnesota Nano Center (MNC) e os recursos de processamento de imagem dos University Imaging Centers (UIC), ambos da Universidade de Minnesota. Partes deste trabalho foram realizadas no Centro de Caracterização da Universidade de Minnesota, que recebe apoio parcial da NSF por meio do programa MRS.

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<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, apresentamos um protocolo que se baseia em tecnologia vMTF anteriormente desenvolvido, permitindo tempos de experiência estendidas mais típico dos caminhos da doença vasculares crônicas 1,23,24. Para conseguir isso, micropadrão genipina, que tem sido mostrado previamente para fornecer funcionalização de longo prazo de PDMS substratos 11, usando uma técnica de deposição de microfluidos para se obter lamelas arterial concebido com melhoria da viabilidade do tecido vascular para uso em experiênc...

As doenças vasculares, tais como vasospasmo cerebral 1,2, 3 hipertensão, aterosclerose e 4, desenvolvem-se lentamente, são tipicamente de natureza crónica, e envolvem disfuncional força de geração de células do músculo liso vascular (VSMCs). Nosso objetivo é estudar essas disfunções vasculares em progressão lenta utilizando métodos in vitro com um controle mais preciso de condições experimentais do que em modelos in vivo. Nós já desenvolvidas películas finas musculares vasculares (vMTFs) para a medição da contractilidade funcional de engenharia de tecidos in vitro cardiovasculares 5, mas este método tem sido limitada a estudos relativamente curto. Aqui, nós apresentamos uma técnica de modificação substrato que se expande a nossa técnica anterior vMTF para medições de longo prazo. Enquanto o endotélio é também crítico na função vascular no geral, lamelas arterial projetado fornecer um sistema modelo útil para avaliar alterações na vascularcontractilidade durante a progressão da doença. Para manipular um modelo de tecido de doença vascular funcional, tanto a estrutura e função da lamela arterial, a unidade de base contrátil do recipiente, deve ser reproduzido com alta fidelidade. Arterial lamelas são concêntricos folhas, circunferencialmente alinhadas de VSMCs de contrácteis separadas por folhas de elastina 6. Microcontact impressão de matriz extracelular (ECM) proteínas sobre substratos de polidimetilsiloxano (PDMS) foi anteriormente utilizada para fornecer sinais de orientação para a organização do tecido para imitar alinhados tecido cardiovascular 5,7-10. No entanto, tecidos estampados com impressão microcontact pode perder a integridade após 3-4 dias em cultura, o que limita a sua aplicabilidade em estudos crônicos. Este protocolo fornece uma solução para este problema, substituindo técnicas de impressão microcontact anteriores com uma nova técnica de deposição de microfluidos. Genbutsu et al. PDMS substratos modificados com genipina e found viabilidade de miócitos prolongada até um mês na cultura 11. Aqui, usamos uma abordagem semelhante para estender a cultura de células de músculo liso vascular estampados em PDMS. Genipina, um derivado hidrolítica natural da fruta gardénia, é um candidato desejável para modificação do substrato, devido à sua toxicidade relativamente baixa em comparação com agentes de reticulação similares e a sua crescente utilização como biomaterial nos domínios da reparação de tecidos e modificação 12,13 ECM 14, 15. Neste protocolo, a fibronectina é utilizada como um sinal de orientação de células, tal como nos processos anteriores de impressão microcontacto; no entanto, genipina é depositada sobre substratos de PDMS antes da fibronectina padronização. Assim, como as células degradam a matriz modelado, ECM recém-sintetizados a partir de VSMCs de anexados podem ligar-se ao substrato revestido PDMS-genipina. Este protocolo utiliza um dispositivo de fornecimento de microfluidos de genipina de duas etapas e de deposição de ECM. O design do dispositivo microfluídico imita micromedidorpadrões de impressão ntact utilizados para lamelas arterial engenharia em estudos anteriores 16. Assim, esperamos que este protocolo para produzir imita lamelas arterial que recapitulam o sucesso altamente alinhado na estrutura vivo e função contrátil de lamelas arterial. Nós também avaliar a contratilidade tecido para confirmar que genipina é um composto modificação substrato adequado para longo prazo em modelos de doenças vasculares in vitro.

<table><tbody><tr><td>Suporte para coloração de lamínula</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura para microscópio - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poli(N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Adesivos Ellsworth (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 KIT SIL ELAST 0,5KG</td></tr><tr><td>Microesferas fluorescentes</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>Wafers de silício</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Fotorresistente&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Alinhador de máscara de contato</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Desenvolvedor</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-triclorossilano</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>Punção de biópsia cirúrgica</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X solução salina tamponada com fosfato</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning, Inc.</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Células musculares lisas da artéria umbilical</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Componentes da solução de Tyrode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>vários</td></tr><tr><td>estereomicroscópios</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>Plataforma com temperatura controlada</td><td>Warner Instruments</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

técnica microfluídico genipina deposição de cultura extensão da micropatterned vasculares musculares filmes finos

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

A natureza crônica da progressão da doença vascular requer o desenvolvimento de técnicas experimentais que simulem comportamentos vasculares fisiológicos e patológicos em escalas de tempo relevantes para a doença. Anteriormente, a impressão de microcontato foi usada para fabricar imitações arteriais funcionais bidimensionais por meio da padronização da proteína da matriz extracelular como pistas de orientação para a organização do tecido. Filmes finos musculares vasculares utilizaram esses mimetismos para avaliar a contratilidade funcional. No entanto, a técnica de fabricação de impressão por microcontato usada normalmente incorpora substratos PDMS hidrofóbicos. À medida que o tecido revira a matriz extracelular subjacente, novas proteínas devem sofrer uma mudança conformacional ou desnaturação para expor resíduos de aminoácidos hidrofóbicos às superfícies hidrofóbicas do PDMS para fixação, resultando em bioatividade alterada da proteína da matriz, delaminação e morte dos tecidos.
Aqui, apresentamos uma técnica de deposição microfluídica para padronização do composto reticulador genipina. A genipina serve como intermediária entre os tecidos padronizados e os substratos PDMS, permitindo que as células depositem proteínas da matriz extracelular recém-sintetizadas em uma superfície mais hidrofílica e permaneçam ligadas aos substratos PDMS. Também mostramos que as proteínas da matriz extracelular podem ser padronizadas diretamente na genipina depositada, permitindo a ditadura da estrutura do tecido projetado. Os tecidos fabricados com esta técnica mostram alta fidelidade tanto no alinhamento estrutural quanto na função contrátil do tecido muscular liso vascular em um modelo de filme fino muscular vascular. Essa técnica pode ser estendida usando outros tipos de células e fornece a estrutura para estudos futuros da funcionalidade crônica em nível de tecido e órgão.

O principal objetivo deste trabalho foi estender a viabilidade de VSMCs micropatterned em substratos PDMS hidrofóbicas. Isto foi conseguido por incorporação de um sistema de entrega de microfluidos para depositar modelado genipina e fibronectina em PDMS (Figura 1). Deposição de proteínas ECM usando entrega microfluídico rendeu transferência de alta fidelidade do padrão de canal com PDMS descalços entre as linhas de genipina e fibronectina (Figura 1D). As células ligadas (Figura ...

Apresentamos um método para deposição microfluídica de genipina e fibronectina padronizadas em substratos PDMS, permitindo a viabilidade estendida de tecidos densos de células musculares lisas vasculares. Este método de fabricação de tecidos é combinado com a tecnologia anterior de filme fino muscular vascular para medir a contratilidade vascular ao longo de cursos de tempo relevantes para a doença.

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um modelo in vitro da função contrátil do músculo liso que possa ser utilizado para estudar os mecanismos de disfunções vasculares, como vasoespasmos cerebrais, em escalas de tempo relevantes para a doença. Isso é realizado com filmes finos musculares vasculares de longo prazo, primeiramente preparando substratos de elastômero por meio da aplicação sequencial, em lamínulas, de uma camada de piam seguida por PDMS, utilizando centrifugação. O segundo passo consiste em utilizar um dispositivo de deposição microfluídico para depositar sequencialmente genina e fibronectina sobre a superfície.Para fornecer pistas de orientação para a auto-organização tecidual em filmes finos vasculares e musculares, o passo final consiste em realizar um ensaio de contratilidade cortando os filmes finos vasculares e musculares, induzindo contração e relaxamento enquanto se realiza a imagem da amostra. Em última análise, esta abordagem produz tecidos que mantêm fidelidade estrutural e contratilidade funcional por até duas semanas em cultura. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como os filmes finos musculares impressos por microcontato, é que a integridade tecidual e a contratilidade funcional são mantidas por semanas, enquanto os tecidos construídos com métodos anteriores começam a degradar-se após três a quatro dias.Em cultura, este método fornece uma plataforma para estudar questões fundamentais em doenças vasculares, como as alterações na mecânica funcional das artérias durante a progressão de doenças crônicas. Aqui estamos estudando a mecânica vascular, mas este método pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos modelo, como tecnologias de órgãos em chip para recapitular a função cardíaca ou do músculo esquelético. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método ao buscar estudar disfunções vasculares de desenvolvimento lento e descobrimos que os métodos atuais ou não podiam ser usados para quantificar a função de células musculares lisas vasculares, ou não mantinham a integridade por um período de tempo suficiente.A deposição microfluídica Jin fornece um molde para a auto-organização celular de maneira semelhante à impressão por microcontato, mas também permite que os tecidos padronizados mantenham sua estrutura e integridade em escalas de tempo apropriadas para o estudo do remodelamento vascular. Para começar, limpe um lote de lamínulas de vidro com diâmetro de 25 milímetros conforme descrito no protocolo de texto complementar; cubra as bordas das lamínulas limpas colocando fita adesiva em suas laterais, deixando uma faixa exposta de vidro no centro. Em seguida, corte as lamínulas separando-as do recipiente e coloque-as, uma a uma, sobre um porta-lâmina com revestimento por centrifugação.Usando pin&ccedil;as, adicione 150 microlitros de uma solu&ccedil;&atilde;o a 10% de poli N isop perfil. Acrilamida, tamb&eacute;m chamada de poli pam ou Piam, dissolvida em butanol-1. Certifique-se de cobrir completamente a &aacute;rea exposta da lam&iacute;nula.Em seguida, ligue o centrífugo e aumente a velocidade durante 10 segundos até 3000 RPMs. Aguarde cinco segundos e, em seguida, aumente durante 10 segundos até 6.000 RPMs. Mantenha por um minuto em 6.000 RPMs e depois reduza gradualmente até 3000 RPMs ao longo de 10 segundos.Mantendo-o nessa posição por cinco segundos antes de finalizar o ciclo de centrifugação. Após secar, remova cuidadosamente a fita adesiva de todas as lamínulas, deixando a lamínula inteira exposta com uma fina camada de revestimento de piam no centro da lamínula de vidro. Em seguida, aplica-se por centrifugação uma camada de PDMS dessalgado sobre cada lamínula.Deslize e cure em forno a 90 graus Celsius por pelo menos 1,5 hora. Projete uma máscara fotolitográfica microfluídica para tecidos e, em seguida, prepare uma pastilha de silício com padrão conforme descrito no protocolo de texto complementar. Após a padronização, aqueça a pastilha utilizando técnicas padrão e coloque-a com o lado dos padrões voltado para cima em uma placa de Petri.Em seguida, misture 100 gramas de PDMS com agente de reticulação na proporção de 10 para 1, puxando o PDMS para dentro do recipiente de forma completa e uniforme, cobrindo totalmente a pastilha moldada. Coloque o recipiente em um dessecador a vácuo por aproximadamente 30 minutos, até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Em seguida, cure o PDMS no recipiente a 90 graus Celsius por pelo menos 1,5 hora.Após a cura, corte o excesso de PDMS e retire lentamente o PDMS moldado restante do lado do molde da pastilha. Remova o excesso de PDMS ao redor dos moldes usando uma lâmina de barbear e corte os dispositivos em formato retangular para facilitar a remoção do dispositivo em etapas posteriores. Em seguida, utilize um furador cirúrgico de biópsia de um milímetro para criar os orifícios de entrada e saída.Sonicar dispositivos microfluídicos em etanol 70% por pelo menos 30 minutos antes de cada uso. Coloque até 10 lamínulas de substrato de filme fino muscular vascular em um limpador de ozônio ultravioleta por oito minutos. Em seguida, prepare uma solução de genina a cinco miligramas por mililitro adicionando um mililitro de água estéril duplamente destilada a um recipiente com cinco miligramas de genina liofilizada.Misture a solução usando um agitador de vórtice e deixe o frasco em repouso à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Coloque os dispositivos microfluídicos limpos com o lado funcional voltado para baixo sobre cada tampa. Insira um por vez.Pressione firmemente os dispositivos para garantir uma vedação adequada com as lamínulas revestidas com PDMS. Coloque rapidamente uma gota de etanol 70% na entrada de cada dispositivo para o condicionamento. Após cinco a dez minutos, aspire cuidadosamente o etanol em excesso na entrada e substitua imediatamente por aproximadamente 100 microlitros de PBS.Use um vácuo para puxar o PBS através até a saída dos dispositivos, removendo o etanol. Pare quando apenas uma pequena quantidade de PBS permanecer na entrada. Em seguida, coloque 60 microlitros da solução de genina a cinco miligramas por mililitro em cada entrada, puxando a solução de genina através dos dispositivos, substituindo a ponta do aspirador de vácuo na saída.Interrompa a sucção quando restar apenas uma pequena quantidade de solução na entrada. Em seguida, coloque gotas de PBS tanto na entrada quanto na saída para evitar que a solução seque. Durante a incubação, transfira a placa contendo os dispositivos para uma estufa umidificada ou incubadora ajustada a 37 graus Celsius e incube por quatro horas.Durante a incubação, reconstitua a fibronectina até uma concentração de 50 microgramas por mililitro em água estéril duplamente destilada e coloque-a no gelo por pelo menos 30 minutos após a incubação com Jin. Passe através, ou, mas uma quantidade mínima de PBS na entrada. Em seguida, adicione 100 microlitros de uma solução de fibronectina a 50 microgramas por mililitro.Em cada entrada, aspire a solução através dos dispositivos utilizando uma ponteira de aspirador a vácuo. Na saída, transfira o recipiente descoberto contendo os dispositivos para uma estufa ou incubadora ajustada a 37 graus Celsius e incube por 24 horas. Após a incubação, remova cuidadosamente os dispositivos das lamínulas desprendendo lentamente o dispositivo por um canto, enquanto segura levemente a lamínula com a outra mão, e coloque as lamínulas em placas estéreis de seis poços.Adicione pelo menos cinco mililitros da solução de penicilina-estreptomicina a cada poço e, em seguida, coloque as placas em um incubador estéril a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Após a esterilização, aspire a solução de penicilina-estreptomicina e semeie as lamínulas com células cultivadas de músculo liso vascular da artéria umbilical humana numa concentração de 80.000 células por centímetro quadrado. Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 24 horas antes dos testes.Para iniciar os testes, coloque uma amostra de tecido em uma placa de 100 milímetros. Adicione solução de Tyro estéril pré-aquecida, com pH 7,4, para cobrir a amostra. Usando uma lâmina de barbear, faça vários cortes paralelos na lâmina celular, perpendiculares à borda do braço do tubo.Realize cortes que produzam seções de tecido mais largas com cerca de dois milímetros de espessura. Isso resultará em filmes finos vasculares musculares alternando com tiras finas que serão removidas posteriormente. Em seguida, gire o recipiente 90 graus e faça dois cortes retos e paralelos no meio do tecido, paralelos à tira de pia-máter.Remova as tiras finas entre as películas vasculares e musculares para evitar que as películas adjacentes entrem em contato. Em seguida, coloque a placa em uma plataforma com controle de temperatura sobre a platina do microscópio estereoscópico e inicie a captura de imagens em lapso de tempo, luz transmitida e luz fluorescente nos intervalos desejados ao longo do ensaio de tratamento. Trate sequencialmente as películas vasculares musculares com 50 nanomolar de endotélio, por 20 minutos para induzir contrações, seguido por 100 micromolar de HA 10 77 por 30 minutos para induzir relaxamento após resfriamento abaixo de 32 graus Celsius.A piam dissolve-se, liberando as finas camadas musculares vasculares. A medição do comprimento de projeção pode ser convertida em um raio de curvatura, sendo utilizada para calcular a tensão média na camada celular sobre o filme, conforme mostrado aqui nas imagens sequenciais de luz transmitida de um ensaio representativo de contratilidade. Essas imagens podem ser convertidas em valores de tensão, a partir dos quais são calculados o tônus basal e a contratilidade induzida.Neste vídeo, é apresentado um exemplo representativo de lapso temporal de um ensaio completo de contratilidade. As películas musculares finas atingem o equilíbrio contrátil e, em seguida, contraem-se mais após a adição de 50 nM de endotelina. Uma película relaxa após a adição de 100 µM de HA 10 77.A leve diminuição no tônus basal e na contratilidade do tecido no final do ensaio é provavelmente o resultado direto da redução no número de células que compõem o tecido. Como as células musculares lisas vasculares privadas de soro não proliferam, aqui são apresentadas imagens de contraste de fase de células musculares lisas cultivadas em superfícies modificadas com genina, em diferentes pontos temporais de sacrifício, variando de um dia a duas semanas. A imuno-histoquímica foi utilizada aqui para destacar a confluência e o alinhamento celular dos tecidos, corando os filamentos de actina F, coloridos em verde, após um, quatro e sete dias de privação de soro.A avaliação quantitativa da confluência tecidual ao longo desse intervalo de tempo mostrou deterioração mínima nessas superfícies. O alinhamento dos filamentos de actina F foi quantificado e confirmou-se que o alinhamento foi mantido ao longo das duas semanas. Em cultura, uma vez dominada esta técnica de fabricação de tecidos in vitro, ela pode ser realizada em dois dias.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de iniciar a deposição microfluídica um dia antes do semeadura celular prevista e manter uma temperatura fisiológica constante durante os experimentos com filmes finos. Após este procedimento, métodos tradicionais de bioquímica, como Western blot e PCR, podem ser realizados para estudar alterações na expressão de proteínas e genes, correlacionando o fenótipo celular com o comportamento funcional. Esta técnica abre caminho para que pesquisadores explorem a progressão de disfunções vasculares de desenvolvimento lento, como vasoespasmo cerebral, hipertensão e aterosclerose, além de modelos in vitro da parede arterial humana.

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de uma matriz microactuator de posts verticalmente deslocadas em que a tecnologia é baseada, e como essa tecnologia base pode ser modificado para conduzir alto rendimento de cultura de células mecanicamente dinâmica em ambos cultura bidimensional e tridimensional paradigmas.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

Fabricação de hidrogéis micropatterned para Sistemas de Cultura Neural usando fotolitografia Projeção Dinâmica Máscara

Um método para a cultura de uma monocamada de células endoteliais em toda a superfície interior 3D inteiro de um dispositivo micro com microvascular de tamanho canais (= 30 mm) é descrito.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.

Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

A criação de microtecidos funcionais dentro de dispositivos microfluídicos requer a estabilização dos fenótipos celulares, adaptando as técnicas tradicionais de cultura celular às dimensões espaciais limitadas em microdispositivos. A modificação do colágeno permite a deposição camada por camada de conjuntos de colágeno ultrafinos que podem estabilizar células primárias, como hepatócitos, como modelos de tecido microfluídico.

Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

O protocolo descreve como engenheiro uma rede vascular perfusable em um esferoide. Microambiente ao redor do spheroid é concebido para induzir a angiogênese e conectar o spheroid para os microcanais em um dispositivo microfluidic. O método permite a perfusão do spheroid, que é uma técnica muito aguardada em culturas tridimensionais.

Perfusable rede Vascular com um modelo de tecido em um dispositivo Microfluidic

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

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Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele simplificado e indiferenciado tridimensional usando uma plataforma microfluida micromaquinda. Uma abordagem de fluxo paralelo permite a deposição in situ de um compartimento dérmico para a semeadura de células epiteliais em cima, todas controladas por bombas de seringa.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

Aprenda a técnica de deposição microfluídica de genipina para criar filmes finos musculares vasculares micropadronizados. Este método mantém a viabilidade tecidual e a contratilidade funcional por até duas semanas em cultura.

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

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