Um Modelo de acidente vascular cerebral trombótico Baseado em Transient isquemia-hipoxia cerebral
18 de agosto de 2015
Os modelos de AVC tromboembólico são ferramentas vitais para otimizar a terapia de recanalização. Aqui relatamos um modelo de AVC trombótico murino baseado em insulto hipóxico-isquêmico cerebral transitório (tHI), que desencadeia trombose e infarto e responde favoravelmente à fibrinólise mediada pelo ativador de plasminogênio tecidual (tPA) em uma janela terapêutica semelhante à de pacientes com AVC.
O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo simples de acidente vascular cerebral trombótico com infarto cerebral estável e avaliar os efeitos protetores da terapia com ativador do plasminogênio tecidual, ou TPA. Primeiro, a indução de hipóxia-isquemia cerebral transitória ou THI é demonstrada por meio da dupla ligadura da artéria carótida comum direita ou RCCA e da exposição do animal ligado a condições hipóxicas para indução de trombose. Após 30 minutos de condição hipóxica, os dois nós na artéria carótida são soltos.
No passo final, são demonstradas a administração e a avaliação dos efeitos da terapia com TPA. Alternativamente, pode-se investigar a gravação em tempo real do fluxo sanguíneo cerebral, a formação da trombose e o grau de obstrução do vaso. Este modelo pode induzir acidente vascular cerebral trombótico em camundongos adultos e recorrer ao seu próprio sistema de coagulação.
Queremos usar este modelo para estudar como o cérebro regula seu próprio fluxo sanguíneo sob condições de isquemia hipotética. Também utilizá-lo para investigar como podemos melhorar a terapia trombolítica. A demonstração visual deste método é fundamental, pois pode ser difícil manter a temperatura corporal adequada e a respiração estável durante a infecção cerebral.
Passos da indução: pelo menos 15 minutos antes de iniciar o procedimento. Coloque a mesa cirúrgica sobre um aquecedor, ajuste para 37 graus Celsius e posicione um rolo cervical feito a partir do corpo de uma seringa de três mililitros sobre a mesa. Configure o sistema de hipóxia para fornecer 2% de isoflurano em 7,5% de oxigênio, equilibrado com 92,5% de nitrogênio, e ajuste os controladores de temperatura.
Coloque um camundongo macho C57 black six, com 10 a 13 semanas de idade e pesando de 22 a 30 gramas, sobre a mesa cirúrgica. Após confirmar a anestesia por meio do aperto dos dedos dos pés, aplique pomada nos olhos do animal. Estique os quatro membros ao longo do pescoço, enrole-os e fixe-os com fita adesiva médica.
Em seguida, utilizando um creme depilatório, remova os pelos do pescoço do animal e limpe o local cirúrgico. Agora, posicione a mesa cirúrgica sob um microscópio estereoscópico e faça uma incisão cervical direita de 0,5 centímetro na pele ao longo da linha média. Usando uma pinça fina, afaste a traqueia e o músculo para expor a artéria carótida comum direita e posicione duas suturas de seda 5-0 previamente cortadas sob a artéria.
Tenha cuidado para separar a artéria carótida do nervo vago em tempo real, não utilizando dois fios de seda 5-0 pré-cortados e liberáveis na ACCD. Em seguida, use fios de náilon monofilamento 4-0 para fechar a pele e transfira rapidamente o camundongo para o sistema de hipóxia. Coloque a máscara facial sobre o nariz e a boca do animal e um sensor retal para manter a temperatura corporal em 37,5 graus Celsius durante toda a administração da hipóxia.
Ajuste as lâmpadas de aquecimento após 30 minutos. Retorne o camundongo à mesa cirúrgica e solte os dois pontos. Em seguida, feche a ferida com cola tecidual e devolva o camundongo à sua gaiola, monitorando o animal até que esteja completamente recuperado.
Alternativamente, a imagem de contraste de speckle a laser pode ser utilizada para examinar o fluxo sanguíneo cerebral durante e após a hipóxia-isquemia. Posicione o animal em posição prona. Em seguida, abra o couro cabeludo com uma incisão mediana de um centímetro de comprimento para expor, mas não abrir, o crânio.
Em seguida, transfira imediatamente o animal para o equipamento de imagem de fluxo sanguíneo e inicie o registro do fluxo sanguíneo cerebral. Visualize as imagens de fluxo sanguíneo cerebral de acordo com as instruções do fabricante, utilizando o software FLPI para analisar as regiões selecionadas em tempo real. Para avaliar os efeitos da terapia com TPA, injete os animais por via intravenosa na veia da cauda no momento apropriado, após a oclusão carotídea unilateral transitória e hipóxia.
Em seguida, quantifique o volume do infarto por meio de TTC in vivo 24 horas após a isquemia hipóxica cerebral transitória. No dia seguinte, utilize um vibrom para obter cortes com espessura de um milímetro. Finalmente, obtenha uma série de quatro imagens cerebrais seccionadas por microscopia digital e utilize o software de imagem apropriado para quantificar o volume do infarto como a razão entre a área branca infartada e a área do hemisfério contralateral não danificado.
Além deste procedimento, outros métodos de trombólise podem ser utilizados para avaliar seus efeitos e potencial clínico. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área do acidente vascular cerebral isquêmico explorarem a terapia trombolítica no cérebro.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um modelo murino de acidente vascular cerebral trombótico que simula condições hipóxico-isquêmicas cerebrais transitórias (tHI). O modelo foi desenvolvido para avaliar a eficácia da terapia com ativador do plasminogênio tecidual (tPA) na indução da recanalização e na redução da infarto.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Modelos de AVC
- Intervenções Terapêuticas
Contexto
- Modelos de acidente vascular cerebral tromboembólico são essenciais para testar terapias.
- A hipóxia-isquemia cerebral transitória (tHI) pode induzir trombose.
- O tPA é um tratamento comum para pacientes com acidente vascular cerebral.
- Compreender a janela terapêutica é crucial para um tratamento eficaz.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um modelo confiável de acidente vascular cerebral trombótico em camundongos.
- Avaliar os efeitos protetores da terapia com tPA.
- Verificar o momento e a eficácia do tratamento após o acidente vascular cerebral.
Métodos Utilizados
- Indução de tHI por meio da dupla ligadura da artéria carótida direita.
- Exposição do animal a condições hipóxicas para desencadear trombose.
- Liberação da ligadura após 30 minutos de hipóxia.
- Administração de tPA e avaliação de seus efeitos sobre recanalização.
Resultados Principais
- O modelo induziu com sucesso infarto cerebral estável.
- A terapia com tPA demonstrou resultados favoráveis dentro da janela terapêutica.
- O fluxo sanguíneo cerebral e a formação de trombose foram efetivamente monitorados.
- O modelo permite o estudo dos mecanismos do acidente vascular cerebral e da eficácia do tratamento.
Conclusões
- O modelo murino de acidente vascular cerebral trombótico é uma ferramenta valiosa para a pesquisa.
- A terapia com tPA mostra potencial no tratamento de acidentes vasculares cerebrais tromboembólicos.
- Estudos adicionais podem aprimorar a compreensão do tratamento do acidente vascular cerebral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de acidente vascular cerebral trombótico aborda a lacuna translacional na pesquisa pré-clínica de AVC ao fornecer um sistema responsivo ao tPA que espelha a trombólise clínica. Ele permite a desmistificação mecanicista de terapias neuroprotetoras e trombolíticas por meio da indução reprodutível de trombose, sem embolização cirúrgica ou craniectomia. O modelo oferece confiança preditiva na validação de alvos e na avaliação da janela terapêutica para programas de desenvolvimento de medicamentos para AVC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias trombóticas e contribuições hemodinâmicas para lesão isquêmica.
- Valor Operacional: Fornece um modelo padronizado para leituras consistentes de infarto e mortalidade entre laboratórios.
- Valor Preditivo: Apoia a priorização de alvos ao modelar trombose sensível à tPA relevante para o acidente vascular encefálico tromboembólico clínico.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera pontos finais quantificáveis, incluindo volume de infarto, deposição de fibrina/plaquetas e dinâmica do fluxo sanguíneo cerebral.
- Valor Operacional: Facilita a padronização de ensaios por meio de hipóxia-isquemia transitória e ligadura reversível da carótida.
- Prontidão para Triagem: Permite a avaliação da resposta à dose de agentes trombolíticos com administração de tPA dependente do tempo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinhamento Translacional: Induz trombose na região da artéria cerebral média, refletindo a patologia do acidente vascular cerebral humano.
- Desvio Mecanístico: Permite o estudo das vias endógenas de fibrinólise e coagulação in vivo.
- Continuidade Pré-clínica: Conecta a descoberta à validação pré-clínica, modelando déficits de reperfusão e evolução do infarto.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo se insere na continuidade da descoberta de acidente vascular cerebral, desde a validação de alvos até a otimização de compostos líderes e a avaliação pré-clínica de eficácia, permitindo a avaliação iterativa de candidatos trombolíticos e neuroprotetores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a formação de trombose, lesão por reperfusão e mecanismos de circulação colateral.
- Triagem: Permite a avaliação padronizada de compostos por meio da redução do tamanho do infarto e da melhoria da sobrevida como desfechos quantitativos.
- Análises: Fornece resultados mensuráveis, incluindo imagem de contraste de speckle a laser do fluxo sanguíneo cerebral, coloração com TTC para quantificação do infarto e monitoramento da mortalidade.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao modelar a resposta ao tPA e os efeitos da janela terapêutica observados no acidente vascular cerebral clínico.
- Reutilização Corporativa: Oferece uma plataforma reutilizável para avaliação cruzada entre programas de estratégias antitrombóticas, fibrinolíticas e neuroprotetoras.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na patologia do acidente vascular cerebral ao modelar trombose clinicamente relevante e resposta ao ativador tissular do plasminogênio (tPA).
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de exposição padronizada à hipóxia, controle de temperatura e ligadura arterial reversível.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao identificar compostos com eficácia dependente do tempo em um modelo sensível à trombólise.
- Impacto no Portfólio: Permite avanço com ajuste de risco ao priorizar agentes que reduzem o tamanho do infarto e a mortalidade em um sistema com resposta ao tPA.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cirurgia de roedores, operação de sistema de hipóxia e monitoramento fisiológico.
- Depende da manutenção precisa da temperatura (37,5 ± 0,5°C) e da administração de gás hipóxico (7,5% O2 equilibrado com N2).
- Necessita padronização dos tempos de ligadura/desligadura e das janelas de administração de tPA (0,5, 1 ou 4 horas após tHI).
- As considerações para adaptação incluem a variabilidade da coagulação específica de linhagem e a validação da localização do infarto.
- As limitações práticas incluem a dependência do modelo em relação à coagulação endógena intacta e a sensibilidade à duração da hipóxia.
