Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

O objetivo geral do teste de irritação ocular é classificar e rotular substâncias e misturas de acordo com seu potencial de irritação ocular. Este procedimento utiliza um modelo tridimensional de córnea reconstruída como tecido. À chegada, o kit de ensaio é pré-incubado durante a noite no meio de ensaio no dia seguinte, os tecidos são hidratados, seguindo-se a aplicação tópica dos controlos positivo e negativo e dos produtos químicos de ensaio de interesse nas superfícies dos tecidos em duplicado.

Após um período fixo de exposição, os produtos químicos de teste são removidos por lavagem. Os tecidos são pós-incubados em meio de ensaio fresco e a toxicidade dos produtos químicos é então avaliada pelo ensaio MTT. Em última análise, o potencial irritante dos artigos de teste pode ser avaliado comparando a viabilidade relativa dos tecidos tratados com o artigo de teste com os tecidos tratados com controle negativo.

A principal vantagem desta técnica dos métodos existentes, como testes rápidos de irritação de traços, é que ela não envolve animais de laboratório. Ele utiliza o cornal desconstruído in vitro como modelo de tecido ocular, que compreende células humanas normais. É aplicável a todos os tipos de substâncias e misturas e pode discriminar entre produtos químicos que induzem irritação ocular ou danos oculares graves causados por materiais.

Não irritantes que não requerem classificação e rotulagem. A córnea humana reconstruída como tecido epitelial ou epi. O Ocular é preparado em inserções com uma membrana porosa através da qual os nutrientes passam para as células.

O tecido reconstruído forma um epitélio não queratinizado que modela o epitélio da córnea com células progressivamente estratificadas, mas não cornificadas. Após o recebimento da córnea humana, como kit epitelial, equilibre os tecidos no contêiner de 24 poços à temperatura ambiente Após 15 minutos, abra a bolsa contendo a placa de tecido de 24 poços em condições estéreis e inspecione todos os tecidos quanto a bolhas de ar entre o gel agros e as inserções. Cortar. Abra a fita.

Remova a tampa com uma gaze estéril e inspecione a superfície do tecido. Em seguida, alíquota de um mililitro de meio de ensaio de kit de 37 graus Celsius nos poços de placas de seis poços pré-rotuladas. Em seguida, use uma pinça estéril para secar suavemente o tecido contendo inserções em gaze estéril para remover qualquer aros de transporte restante e colocá-los em poços individuais das placas de seis poços.

Após uma hora, substitua o meio por um mililitro de meio de ensaio fresco a 37 graus Celsius e incube os tecidos em condições de cultura padrão durante a noite. No dia seguinte, acariciei 20 microlitros de DPBS livre de cálcio e magnésio na superfície apical de cada tecido. Se a SPBD não se espalhar pelos tecidos, segure suavemente a inserção com uma pinça e bata na placa para garantir que a solução salina molhe toda a superfície do tecido.

Incube as placas por 30 minutos. Em seguida, para tratar os tecidos com artigos de teste líquidos, aplique 50 microlitros do controle negativo, do controle positivo e dos artigos de teste apropriados em duplicata de acordo com o cronograma. Tome cuidado para garantir que os tratamentos cubram todas as superfícies do tecido e, em seguida, incube as inserções por 30 minutos para tratar os tecidos com artigos de teste sólidos.

Primeiro, transfira as inserções para uma superfície estéril. Mantenha a placa coberta para evitar contaminação com partículas sólidas transportadas pelo ar. Em seguida, usando uma colher nivelada, aplique topicamente 50 miligramas do artigo de teste nos tecidos duplicados de acordo com o cronograma, cuidando para que o tratamento cubra toda a superfície do tecido.

Como alternativa, use uma seringa pré-cheia de um mililitro com a cabeça cortada. Para colocar os pós diretamente na cultura. Pressione o êmbolo para aplicar o pó imediatamente após a aplicação dos artigos de teste sólidos, retorne as inserções às placas de seis poços e incube os tecidos por seis horas para enxaguar os tecidos.

Após o tratamento, encher 3 copos de 150 mililitros por artigo de ensaio com 100 mililitros de DPBS no final da incubação de exposição. Segure a borda superior das pastilhas com uma pinça curva para removê-las dos poços. Em seguida, usando uma pinça, pegue duas inserções do mesmo tratamento pelas bordas superiores e transvase os tratamentos em um material absorvente limpo.

Em seguida, mergulhe as inserções no primeiro béquer de DPBS lavando os tecidos com um movimento circular por dois segundos. Em seguida, levante as inserções de modo a que fiquem quase todas preenchidas com DPBS e decantar o líquido de volta para o copo. Repetir a lavagem duas vezes no primeiro copo.

Em seguida, enxágue as inserções no segundo e terceiro copos do DPB S3 vezes cada uma da mesma maneira após a última lavagem. Gire cada inserto em um ângulo de aproximadamente 45 graus com a extremidade aberta voltada para baixo e toque o lábio superior no material absorvente para decantar qualquer DPBS restante. Em seguida, mergulhe imediatamente os tecidos em cinco mililitros de meio de ensaio à temperatura ambiente.

Em uma placa pré-rotulada de 12 poços no final do período de imersão pós-imersão, decantar o meio de ensaio e seque as inserções em um material absorvente. Em seguida, transfira as inserções para uma nova placa de seis poços contendo um mililitro de meio de ensaio quente por poço e coloque as placas na incubadora para iniciar o ensaio de viabilidade do MTT. Transfira as pastilhas para uma placa de 24 poços contendo 0,3 mililitros de solução MTT recém-preparada.

Aplique as inserções no material absorvente antes da transferência. Libere todas as bolhas de ar presas embaixo das inserções e devolva os tecidos à incubadora após três horas, coloque o fundo das inserções no material absorvente. Em seguida, para a extração submersa de artigos de teste líquidos não corantes, mergulhe as inserções em uma placa pré-rotulada de 24 poços contendo dois mililitros da solução de extração apropriada por poço para uma extração não submersa de corantes sólidos ou líquidos.

Transfira as inserções para uma placa pré-marcada de seis poços contendo um mililitro de solução de extração por poço. Em seguida, sele as placas com um selador térmico ou paraforme para inibir a evaporação e extraia em um agitador orbital por duas a três horas em temperatura ambiente com agitação suave no final da extração submersa. Perfure os lenços e depois transvase o líquido dentro de cada inserção de volta para o poço e descarte as inserções com os lenços.

Misturar a solução de extracto em cada alvéolo e transferir duas alíquotas de 200 microlitros de cada amostra para os alvéolos apropriados de uma placa de 96 poços pré-rotulada, conforme ilustrado no esquema no final da extracção não submersa. Descarte as inserções e tecidos sem perfurar e adicione um mililitro de solução de extração a cada um. Misture bem a solução de extração nos poços e transfira duas alíquotas de 200 microlitros de cada amostra para os poços apropriados de uma placa pré-rotulada de 96 poços, conforme demonstrado.

Finalmente, leia a densidade óptica das amostras em um espectrofotômetro de 96 poços em um comprimento de onda de 570 nanômetros sem usar um filtro de referência e insira os resultados em uma planilha para calcular os respectivos passivos teciduais. Considere as correções devido à interferência do produto químico de teste conforme indicado no protocolo de texto aqui, resultados representativos do teste de irritação ocular realizados com 10 artigos de teste e controles negativos e positivos são mostrados neste experimento. Observou-se uma densidade óptica média de 1,31 para o controle negativo, correspondendo a 100% de viabilidade tecidual, com uma viabilidade tecidual relativa de 31,2%Para o teste de controle positivo, os artigos 1, 2, 4, 7 e oito exibiram variabilidades teciduais superiores a 60%, classificando esses artigos como não irritantes, os artigos de teste 3, 5, 6, 9 e 10.

Por outro lado, exibiram variabilidades teciduais menores ou iguais a 60%, resultando em sua classificação como irritantes. A diferença na viabilidade do tecido entre os tecidos duplicados neste experimento foi inferior a 20% para todos os artigos testados, com exceção do artigo de teste dois. Portanto, os resultados de todos os artigos de teste, exceto o artigo de teste dois, foram considerados qualificados, pois atenderam a todos os critérios de aceitação do teste de irritação ocular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como ele deve realizar o teste de DICAÇÃO, utilizando córnea humana reconstrutiva in vitro como tecido modelo quatro, rotulagem de identificação de perigo de produtos químicos. Este procedimento foi implementado nas diretrizes de teste EOC D como parte da estratégia de teste de nível.