Name: Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda o teste de irritação ocular utilizando modelo de tecido epitelial reconstruído semelhante à córnea humana. Este método avalia a viabilidade celular por ensaio MTT para classificar substâncias químicas quanto ao potencial irritante ocular.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. John Harbell por seu apoio e tempo científico dedicado ao projecto IET. Os autores também gostaria de agradecer a Beiersdorf AG (Alemanha), IIVS (EUA), Mary Kay Inc. (EUA), Avon Products Inc. (EUA), Procter &amp; Gamble / Cosmital (Suíça), Pierre Fabre Laboratoire (França), Harlan Laboratories (Reino Unido), e LVMH Parfume (França) para a participação no Centro de Estudos Multi-Internacional de pré-validação e de validação do teste de irritação ocular 15.

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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Globally+Harmonized+System+of+Classification+and+Labelling+of+Chemicals+%28GHS%29%22">Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS)</a>. , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).</li>
<li>Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+Study+of+Irritation+and+Toxicity+of+Substances+Applied+Topically+to+the+Skin+and+Mucous+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther+November%22%5BJournal%5D)">Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes.</a> J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).</li>
<li>Adriaens, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+analysis+of+the+Draize+test+for+serious+eye+damage%2Feye+irritation%3A+importance+of+understanding+the+in+vivo+endpoints+under+UN+GHS%2FEU+CLP+for+the+development+and+evaluation+of+in+vitro+test+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+tox%22%5BJournal%5D)">Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods.</a> Arch tox. 88, 701-723 (2014).</li>
<li>Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EC%2FHO+international+validation+study+on+alternatives+to+the+Draize+eye+irritation+test%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.</a> Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+safety%3A+a+silent+%28in+vitro%29+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Ocular safety: a silent (in vitro) success story.</a> Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).</li>
<li>Wilhelmus, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Draize+Eye+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Survey+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">The Draize Eye Test.</a> Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).</li>
<li>Curren, R. D., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+alternatives+for+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+health+persp%22%5BJournal%5D)">In vitro alternatives for ocular irritation.</a> Environ health persp. 106, 485-492 (1998).</li>
<li>McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+ocular+irritation+ranges+of+market-leading+cosmetic+and+personal-care+products+using+an+in+vitro+tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent.</a> Toxicologist. 66, 243(2002).</li>
<li>Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+EpiOcular+assay+for+preclinical+qualification+of+formulas+for+human+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies.</a> Toxicologist. 96, 249(2007).</li>
<li>Yin, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+ocular+irritation+potential+of+surfactants-based+formulations+at+different+concentrations+using+the+EpiOcular+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologist%22%5BJournal%5D)">Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model.</a> Toxicologist. 108, 378(2009).</li>
<li>Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarbell%2C+J+%22Handbook+of+Toxicology%22">Handbook of Toxicology</a>. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+for+hazard+identification+and+labelling+of+eye+irritating+chemicals+in+response+to+the+requirements+of+the+EU+cosmetics+directive+and+REACH+legislation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation.</a> Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).</li>
<li>Pfannenbecker, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cosmetics+Europe+Multi-Laboratory+Pre-Validation+of+the+EpiOcular+Reconstituted+Human+Tissue+Test+Method+for+the+Prediction+of+Eye+Irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation.</a> Toxicol in vitro. , (2013).</li>
<li>MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).</li>
<li>Kaluzhny, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiOcular+Eye+Irritation+Test+%28EIT%29+for+Hazard+Identification+and+Labeling+of+Eye+Irritating+Chemicals%3A+Protocol+Optimization+for+Solid+Materials+and+Extended+Shipment+Times%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times.</a> Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).</li>
<li>Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-house+validation+of+the+EpiOcular%28TM%29+eye+irritation+test+and+its+combination+with+the+bovine+corneal+opacity+and+permeability+test+for+the+assessment+of+ocular+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation.</a> Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).</li>
<li>Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guideline for the Testing of Chemicals</a>. , (2014).</li>
<li>Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).</li>
<li>Kandarova, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EpiDerm+Test+Protocol+for+the+Upcoming+ECVAM+Validation+Study+on+In+Vitro+Skin+Irritation+Tests+%E2%80%94+An+Assessment+of+the+Performance+of+the+Optimised+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test.</a> Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).</li>
</ol>

Taxas de publicação do presente artigo foram pagos pela MatTek Corporation.

Nós apresentamos o Olho Irritação Test (Figura 1), que foi desenvolvido para o modelo de tecido EpiOcular. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS Categorias 1 e 2 combinados) a partir de materiais que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria) com alto grau de sensibilidade e especificidade 17. O IET, tal como apresentado aqui não discrimina entre GHS Categoria 1 de Categoria 2 produtos químicos. O EIT foi validado para a classificação e rotulagem de irritação ocular potencial de uma vasta gama de produtos químicos, incluindo cosméticos e farmacêuticos ingredientes. Em conjunto com outros testes in vitro, o IET irá servir como um substituto para o ensaio de irritação in vivo do olho de coelho. O IET utiliza dois protocolos similares mas distintas de materiais líquidos e sólidos, os quais variam no tempo de exposição e períodos de incubação de pós-exposição (Figura 1). O endpoint utilizado na EITé a viabilidade do tecido, determinada pelo ensaio de MTT, que tenha sido previamente usado em modelos validados de tecidos epiteliais humanos 20,21. Para realizar este ensaio, não é necessário nenhum equipamento especial além de equipamentos de cultura de células padrão. Devido ao nível elevado de reprodutibilidade de tecido-a-tecido, n = 2 tecidos, em vez de o habitualmente recomendado n = 3 são utilizados. A capacidade de utilizar n = 2 tecidos é um aspecto crítico do protocolo, uma vez que permite que um operador experiente para processar simultaneamente dois tecidos, minimizando assim a variabilidade do ensaio que podem surgir devido ao diferente tratamento dos tecidos individuais 14. Além disso, usando n = 2 tecidos por artigo, o teste de irritação de 10 substâncias de teste do mesmo estado físico (sólido ou líquido), juntamente com os controlos positivos e negativos, pode ser avaliada utilizando um kit (24 tecidos). Outros pontos-chave que garantem classificação confiável de materiais estão as especificações para o controlo positivo substance (a viabilidade do tecido ≤50.0%), reprodutibilidade entre os tecidos duplicados (diferença &lt;20,0%), e leituras de controle negativo (&gt; 0,8 e &lt;2,5). Ao realizar o teste IET, é importante para aderir ao protocolo e validado para a dosagem sugerida e enxaguamento horários (Tabelas 3 e 4), uma vez que o desvio a partir do protocolo ou alterações nos períodos de incubação pode resultar em resultado alterada. Da mesma forma, os desvios do tempo de 3 horas para MTT incubação irá resultar em leituras diferentes MTT e pode afetar o resultado do ensaio. Ocasionalmente, um produto químico de teste pode ter propriedades ópticas ou outras que possam interferir com o ensaio de viabilidade de tecido ou a redução de MTT causa de MTT. Por exemplo, um produto químico de teste pode reduzir directamente o MTT em azul-violeta do produto de reacção, ou pode ser uma substância que absorve a luz colorida no mesmo intervalo de formazano de MTT (~ 570 nm). No entanto, esses produtos químicos de teste vai present um problema apenas, se no momento do ensaio MTT, uma quantidade suficiente do material ainda está presente no (ou absorvidas por) o tecido. Para evitar esta interferência, procedimentos de lavagem extensivos são incorporados ao protocolo de TIE. Se a lavagem não remove o TA eo TA interfere com a redução do MTT, controles adicionais devem ser usadas para detectar e corrigir para ele. Resumidamente, se houver suspeita de redução MTT direta da substância química de ensaio, 50 jul (ou 50 mg de sólidos) do produto químico em questão é incubada durante 3 horas com uma solução de MTT a trabalhar na SCC (NC, 50 mL de água deionizada estéril, deve ser executados simultaneamente). Se a solução MTT fica azul-roxa, o artigo de teste se presume ter reduzido o MTT. Neste caso, um teste de funcionamento utilizando os controlos de tecidos mortos a criodessecagem, devem ser realizadas para avaliar se a substância de ensaio é obrigatório para o tecido e que conduz a uma redução do MTT sinal falso. Se houver redução MTT apreciável no TA-exposto, controlo de tecido morto(em relação à quantidade no tecido viável não tratada), a viabilidade dos tecidos significativo do artigo de teste deve ser corrigida subtraindo a viabilidade média do controlo morto. O IET erra no lado da segurança, como demonstrado pela baixa incidência de falsos negativos classificações 14,15,18. É importante ressaltar que nenhum dos GHS Categoria 1 produtos químicos, que são corrosivos para o olho e que representam o mais sério perigo ocular, foram classificadas como não-irritante neste ensaio 14,15,18,19. Finalmente, uma das principais vantagens do método de ensaio rhce em vitro, é a possibilidade de testar puro líquido e matérias sólidas (as quais não é possível com culturas de células, submersas bidimensionais). O EIT contribuirá significativamente para a determinação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS. A substituição dos animais para determinar otoxicidade cular tem sido uma meta da pesquisa toxicológica por muitos anos. O método de ensaio EIT concluiu um estudo de validação formal apoiado por EURL ECVAM em 2014 eo EpiOcular EIT foi implementada nas Orientações de ensaio da OCDE como a OCDE TG 492 em 2015.

Produtos de consumo, como cosméticos, detergentes e produtos de limpeza domésticos incluem uma variedade de produtos químicos que podem induzir sérios danos se entrar em contato com os olhos. Portanto, o teste desses agentes para irritação dos olhos é exigido pelas agências reguladoras dos EUA e da UE para garantir a segurança dos consumidores 1. Uma avaliação do potencial de irritação ocular de misturas e formulações é também um requisito para o cumprimento REACH (Registo, Avaliação, Autorização e Restrição de Produtos Químicos) legislação para a rotulagem dos ingredientes cosméticos no âmbito da Directiva Cosméticos da UE para o transporte de produtos químicos, e para a rotulagem dos pesticidas e produtos domésticos 2. Atualmente, as agências reguladoras requerem avaliação de perigo ocular usando o Sistema Globalmente Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS) 3. GHS é baseada principalmente no teste de irritação ocular de Draize, o ensaio de irritação ocular mais amplamente utilizado em que substâncias estranhas e mixtures são introduzidos directamente no saco conjuntival do olho do coelho 4. Segundo a classificação GHS, GHS Categoria 1 (substâncias corrosivas oculares) refere-se a testar produtos químicos que causam lesão inicial grave para os tecidos oculares ou sérios danos aos olhos e visão que não é totalmente reversível nos 21 dias após a exposição 3,5. GHS Categoria 2 se refere a testar substâncias químicas que produzem mudanças significativas no olho que são totalmente reversível nos 21 dias de exposição. Produtos químicos de teste que não são corrosivos ou irritantes são referidos como GHS n Categoria. Por mais de 40 anos, o teste de olho de coelho Draize tem sido criticado por sua falta de reprodutibilidade, superestimação da resposta humana, bem como a utilização de animais vivos 5-8. Estas preocupações têm incentivado muitas propostas de aperfeiçoamento, redução e substituição do ensaio in vivo 9. A necessidade de alternativas à experimentação animal validados foi reforçadapela adopção da sétima alteração à Directiva Cosméticos, que proibiu a utilização de animais na avaliação da segurança dos produtos cosméticos (em 2005) e ingredientes (em 2009) 2. Desde 1996, o modelo de tecido córnea semelhante reconstruído tem sido amplamente utilizada na indústria cosmética para avaliar o potencial de irritação de matérias-primas, as formulações à base de surfactante, e misturas que são concebidos para serem utilizados no composto, ou nas imediações do, olho 10-13. A utilização do modelo de tecido rhce permite a aplicação tópica directa do material de teste sobre a superfície do tecido, na sua forma nativa, não diluído. Desta forma, as formulações não solúveis em água podem ser controlados sem a sua diluição com solventes. Em resposta a EURL do ECVAM (Laboratório de Referência da União Europeia Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos) pedido de um método amplamente aplicável, simples e econômica do Irritação dos olhos Test (EIT), que utiliza um single tempo de exposição e é capaz de separar substâncias irritantes oculares e corrosivos a partir de materiais que não necessitam de marcação foi desenvolvido (Figura 1) 14. Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e 39 de sólidos), o IET alcançado 95,5 / 68,2 / e 81,8% de sensibilidade / especificidade e precisão (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / e 84,6% SS &amp; A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS &amp; A global. Em 2007, um estudo de pré-validação multi-laboratório patrocinado pela Cosmetics Europa (anteriormente Colipa), sob os auspícios do ECVAM EURL avaliada a relevância ea fiabilidade do IET, com o objetivo de trazê-lo para validação formal 15. Neste estudo, 298 ensaios independentes foram realizados em sete laboratórios independentes. Os resultados do estudo demonstraram concordância de 99,7% na previsão com baixos coeficientes de variação entre todos os laboratórios participantes 15. Como resultado, em 2010 o protocolo EIT entrou formal EURL ECVAMprograma de validação. O estudo de validação utilizados 104 produtos químicos de teste codificados, incluindo substâncias individuais e misturas químicas, para os quais os dados de referência in vivo (dados de irritação ocular de Draize) estavam disponíveis. Baseado no sucesso deste trabalho, uma diretriz projecto de ensaio da OCDE foi apresentado em 2014. Prevê-se que o IET contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS da ONU.

irritação dos olhos test (eit) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída humano córnea-like epitelial (rhce) modelo tissue

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Para cumprir com a Emenda Sétimo à legislação Directiva Cosméticos e REACH EU EU, são necessários que não envolvam animais métodos alternativos validados para avaliação confiável e precisa de toxicidade ocular no homem. Para endereçar esta necessidade, nós desenvolvemos um teste de irritação ocular (TIE), que utiliza um modelo tridimensional humana reconstruída córnea epitelial semelhante (rhce) de tecido que é baseado em células humanas normais. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS categorias 1 e 2 combinado) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria). O teste utiliza dois protocolos distintos, um concebida para produtos químicos líquidos e um segundo protocolo, similar para artigos de teste sólidos. O modelo de previsão IET utiliza um único período de exposição (30 minutos para os líquidos, para 6 h de sólidos) e uma única viabilidade do tecido de corte (60,0% como determinado pelo ensaio de MTT). Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e sólidos 39) IET alcançado 95,5 / 68,2 / 81,8% e sensitivity / especificidade e precisão (SS &amp; A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / 84,6% e SS &amp; A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS &amp; A global. O EIT contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de produtos químicos líquidos e sólidos sem a utilização de animais para atender aos requisitos regulamentares de teste. O método EpiOcular EIT foi implementada em 2015 para as Directrizes de Ensaio da OCDE como TG 492.

Resultados IET representativos realizados com 10 artigos de teste (TA) e controlos negativos e positivos estão apresentados na Tabela 6 e na Figura 3. A média de OD = 1,31 para o NC corresponde a 100% de viabilidade do tecido, portanto, o PC (média OD = 0,41) tinha a viabilidade do tecido relativa de 31,2%. Quando o protocolo IET foi realizado em 15 experiências independentes válidos em 7 laboratórios usando o protocolo de exposição líquido e em 8 experiências válidas independentes em 4 laboratórios, utilizando o protocolo de exposição contínua, a viabilidade média dos tecidos para o PC, utilizando o protocolo de líquido foi de 36,4 ± 4,0 e 32,3% ± 6,4% para o protocolo de sólidos. Em todos os casos, os resultados do controlo positivos estavam abaixo do valor de corte de 60,0% 15. Como mostrado na Figura 3, a TA1, TA2, TA4, TA7, e tinha TA8 viabilidades dos tecidos&gt; 60,0% e, portanto, foram classificados como &quot;NI&quot;. TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10 teve viabilidades tecido X04; 60,0% e, portanto, foram classificados como &quot;I&quot;. A diferença de viabilidade do tecido entre os tecidos foi duplicado &lt;20,0% para todas as agências de viagens com uma exceção de TA2. Portanto, os resultados para todos os artigos de teste, com uma exceção de TA2, foram considerados &quot;qualificados&quot; desde que se conheceram todos os critérios de aceitação do IET (Seção 10.2). Devido a grande variabilidade entre tecidos em duplicado para TA2 na experiência inicial, uma segunda experiência foi necessária para obter resultados IET qualificados. O método de ensaio EIT como aqui descrito, utilizando o modelo de tecido RHCE foi utilizado para a avaliação da irritação ocular em diversos estudos de validação multilaboratory, incluindo a validação formal pelo ECVAM EURL / Cosméticos Europa 15,17-19. Em todos os estudos, o IET se mostrou reprodutível e foi capaz de identificar corretamente produtos químicos (ambas as substâncias e misturas) que não requer classificação e rotulagem da irritação ocular ou lesões oculares graves acgundo ONU GHS 15,17-19. O método de ensaio EIT cumprido os critérios de aceitação do grupo de gestão de validação (VMG), para irritação dos olhos para a sensibilidade, especificidade e acurácia geral e atualmente encontra-se pendente implementação formal como um substituto parcial para o teste in vivo coelho Draize 19. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema do protocolo EIT para artigos de teste líquidos e sólidos abreviações utilizadas: AM, meio de ensaio;. SCC, condições de cultura padrão; PBS de Dulbecco tamponada com fosfato salino; RT, temperatura ambiente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig2.jpg" /> Figura 2:. A configuração da placa de 96 poços normalizada para o teste de viabilidade MTT tecido Duas alíquotas de 200 ul são transferred aos poços apropriados de uma pré-marcado com 96-poços. Abreviaturas utilizadas: NC, controle negativo; PC, controlo positivo; TA1-TA20, artigos de teste 1-20; Solução em branco, extrator. 96- configuração placa MTT é usado com planilha Excel projetado para calcular a viabilidade do tecido RHCE e os resultados do IET. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52979/52979fig3.jpg" /> Figura 3: Resultados do IET obtida para 10 artigos de teste, NC e controles de PC usando o modelo de tecido RHCE O gráfico é gerado a partir de uma planilha do Excel projetado para apresentar os resultados do IET.. Produtos químicos de teste que reduziu a viabilidade do tecido ≤ 60,0% em relação ao NC são classificados como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e produtos químicos de teste que tiveram a viabilidade do tecido&gt; 60,0% são classificados como não-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="7"> Tempo para as etapas de trabalho protocolo EIT (um dia de trabalho para um operador) começam </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada linha corresponde a um par de tecidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pedido de passos: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Líquidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposição </td><td> Pós- Embeber </td><td> Pós- <td> MTT Reação </td><td> MTT Extração </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> 12 min </td><td> 120 min </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 10:00 </td><td> 10:12 </td><td> 00:12 </td><td> 15:12 </td><td> depois </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:01 </td><td> 09:31 </td><td> 10:01 </td><td> 10:13 </td><td> 00:13 </td><td> 15:13 </td><td> 17:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 10:02 </td><td> 10:14 </td><td> 00:14 </td><td> 15:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 &lt;/ strong&gt; </td><td> 09:03 </td><td> 09:33 </td><td> 10:03 </td><td> 10:15 </td><td> 00:15 </td><td> 15:15 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 10:04 </td><td> 10:16 </td><td> 00:16 </td><td> 15:16 </td><td></td></tr><tr><td> AT 4- </td><td> 09:05 </td><td> 09:35 </td><td> 10:05 </td><td> 10:17 </td><td> 00:17 </td><td> 15:17 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 10:06 </td><td> 10:18 </td><td> 00:18 </td><td> 15:18 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:07 </td><td> 09:37 </td><td> 10:07 </td><td> 10:19 </td><td> 00:19 </td><td> 15:19 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 10:08 </td><td> 10:20 </td><td> 00:20 </td><td> 15:20 </td><td></td></tr><tr><td><stro<html> ng&gt; TA-8 </td><td> 09:09 </td><td> 09:39 </td><td> 10:09 </td><td> 10:21 </td><td> 00:21 </td><td> 15:21 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 10:10 </td><td> 10:22 </td><td> 00:22 </td><td> 15:22 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:11 </td><td> 09:41 </td><td> 10:11 </td><td> 10:23 </td><td> 00:23 </td><td> 15:23 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3:. Cronograma de amostras para testes de artigos de teste líquidos etapas do Protocolo, incluindo o pré-molhar os tecidos com DPBS, Aplicação dos artigos de teste (TAS), lavagem e pós-estabilização, período de pós-incubação, MTT, Extração de MTT, e medição de OD MTT são apresentados nas colunas. Os tempos para os tecidos duplicados são organizados em fileiras. Todo o teste de ensaio de 10 assistentes técnicos e controles pode ser terminado em um dia. e_content &quot;&gt; <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" height="439" width="582"><tbody><tr><td colspan="6"> Hora de início para as etapas do protocolo do IET (2 dias trabalhar para um operador) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cada linha corresponde a um par de tecidos </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dia 1 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Dia 2 (dia seguinte) </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pedido de passos: </td><td> 1 </strong&gt; </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Sólidos: </td><td> PBS </td><td> TA Exposição </td><td> Pós- Embeber </td><td> Pós- Incubaction </td><td> MTT Reação </td><td> MTT Extração </td><td> Medida </td></tr><tr><td></td><td> 30 min </td><td> 6 hr </td><td> 26 min </td><td> 18 hr </td><td> 180 min </td><td> 120 min </td><td> OD </td></tr><tr><td> NC </td><td> 09:00 </td><td> 09:30 </td><td> 15:30 </td><td> 15:56 </td><td> 09:56 </td><td> 12:56 </td&gt; <td> depois </td></tr><tr><td> PC </td><td> 09:02 </td><td> 09:32 </td><td> 15:32 </td><td> 15:58 </td><td> 09:58 </td><td> 12:58 </td><td> 15:30 </td></tr><tr><td> TA-1 </td><td> 09:04 </td><td> 09:34 </td><td> 15:34 </td><td> 16:00 </td><td> 10:00 </td><td> 13:00 </td><td></td></tr><tr><td> TA-2 </td><td> 09:06 </td><td> 09:36 </td><td> 15:36 </td><td> 16:02 </td><td> 10:02 </td><td> 13:02 </td><td></td></tr><tr><td> TA-3 </td><td> 09:08 </td><td> 09:38 </td><td> 15:38 </td><td> 16:04 </td><td> 10:04 </td><td> 13:04 </td><td></td></tr><tr><td> AT 4- </td><td> 09:10 </td><td> 09:40 </td><td> 15:40 </td><td> 16:06 </td><td> 10:06 </td><td> 13:06 </td><td></td></tr><tr><td> TA-5 </td><td> 09:12 </td><td> 09:42 </td><td> 15:42 </td><td> 16:08 </td><td> 10:08 &lt;/ td&gt; <td> 13:08 </td><td></td></tr><tr><td> TA-6 </td><td> 09:14 </td><td> 09:44 </td><td> 15:44 </td><td> 16:10 </td><td> 10:10 </td><td> 13:10 </td><td></td></tr><tr><td> TA-7 </td><td> 09:16 </td><td> 09:46 </td><td> 15:46 </td><td> 16:12 </td><td> 10:12 </td><td> 13:12 </td><td></td></tr><tr><td> TA-8 </td><td> 09:18 </td><td> 09:48 </td><td> 15:48 </td><td> 16:14 </td><td> 10:14 </td><td> 13:14 </td><td></td></tr><tr><td> TA-9 </td><td> 09:20 </td><td> 09:50 </td><td> 15:50 </td><td> 16:16 </td><td> 10:16 </td><td> 13:16 </td><td></td></tr><tr><td> TA-10 </td><td> 09:22 </td><td> 09:52 </td><td> 15:52 </td><td> 16:18 </td><td> 10:18 </td><td> 13:18 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 4: calendário amostra para o teste dos artigos em ensaio sólidos. Etapas do Protocolo, incluindo o pré-molhar os tecidos com DPBS, Aplicação dos artigos de teste, Enxaguar e Pós-molhe, período de pós-incubação, MTT, Extração de MTT, e Mensuração de MTT OD são apresentados em colunas. Os tempos para os tecidos duplicados são organizados em fileiras. Todo o ensaio testando 10 ATs e controles é realizado ao longo de um período de dois dias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Quantidade </td><td> Reagente </td><td> Condições de armazenamento </td><td> Fonte </td><td> Descrição </td><td> Data de validade </td></tr><tr><td> 1 frasco, 2 ml </td><td> Concentrado de MTT (MTT-100-CON) </td><td> Protegido da luz (-20ºC) </td><td> MatTek </td><td> Congelado concentrado MTT </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 frasco, 8 ml </td><td> MTT diluente </td><td> 2-8 &amp;# 186; C </td><td> MatTek </td><td> Para a diluição de concentrado de MTT antes da utilização no ensaio de MTT </td><td> 2 meses </td></tr><tr><td> 1 garrafa, 60 ml </td><td> Isopropanol (CAS # 67-63-0) </td><td> RT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Solução de extracção </td><td> N / D </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Componentes do MTT-100 kit de ensaio. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Código N ° </td><td> Tecido </td><td colspan="2"> Dados não tratados </td><td colspan="2"> Dados corrigidos em branco </td><td rowspan="2"> média de OD </td><td rowspan="2"> % De viabilidade </td></tr><tr><td></td><td> n </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td><td> Aliq. 1 </td><td> Aliq. 2 </td></tr><tr><td> NC </td><td>1 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.316 </td><td> 1.352 </td><td> 1.334 </td><td> 101.6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.277 </td><td> 1.309 </td><td> 1.293 </td><td> 98,4 </td></tr><tr><td> PC </td><td> 1 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,379 </td><td> 0,397 </td><td> 0,388 </td><td> 29,6 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,419 </td><td> 0,442 </td><td> 0,431 </td><td> 32,8 </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.213 </td><td> 1.244 </td><td> 1.229 </td><td> 93,5 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 1.355 </td><td> 103.2 </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 1 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.210 </td><td> 1.122 </td><td> 1.166 </td><td> 88,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,828 </td><td> 0,837 </td><td> 0,833 </td><td> 63,4 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 1 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 0,168 </td><td> 0,167 </td><td> 12,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,138 </td><td> 0,136 </td><td> 0,137 </td><td> 10,4 </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.137 </td><td> 1.160 </td><td> 1.149 </td><td> 87,4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.262 </td><td> 1,191 </td><td> 1.262 </td><td> 1,191 </td><td> 1.227 </td><td> 93,4 </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 1 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0.610 </td><td> 0,621 </td><td> 0,616 </td><td> 46,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,480 </td><td> 0,484 </td><td> 0,482 </td><td> 36,7 </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 1 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,502 </td><td> 0,513 </td><td> 0,508 </td><td> 38,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,396 </td><td> 0,407 </td><td> 0,402 </td><td> 30,6 </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.048 </td><td> 1.050 </td><td> 1.049 </td><td> 79,9 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.149 </td><td> 1.150 </td><td> 1.150 </td><td> 87,5 </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 1 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.032 </td><td> 1.034 </td><td> 1.033 </td><td> 78,7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,941 </td><td> 0,935 </td><td> 0,938 </td><td> 71,4 </td></tr><tr><td> TA9 </td&gt; <td> 1 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 0,022 </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,144 </td><td> 0,149 </td><td> 0,147 </td><td> 11.2 </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 1 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 0,150 </td><td> 11,4 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,254 </td><td> 0,255 </td><td> 0,255 </td><td> 19,4 </td></tr></tbody></table><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> significar </td><td> Dif. </td><td> média de </td><td> Dif. </td><td> Dif. / 2 </td><td colspan="2"> Classificação </td></tr><tr><td></td><td> de OD </td><td> de OD </td><td> viabilidades [%] </td><td> de viabilidades </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NC </td><td> 1.314 </td><td> 0,041 </td><td> 100.0 </td><td> 3.12 </td><td> 1.56 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> PC </td><td> 0.410 </td><td> 0,043 </td><td> 31,2 </td><td> 3.23 </td><td> 1.62 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA1 </td><td> 1.292 </td><td> 0,127 </td><td> 98,3 </td><td> 9.63 </td><td> 4.81 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA2 </td><td> 0.999 </td><td> 0,333 </td><td> 76,1 </td><td> 25.36 </td><td> 12,68 </td><td> NI </td><td> D&gt; 20 </td></tr><tr><td> TA3 </td><td> 0,152 </td><td> 0,030 </td><td> 11,6 </td><td> 2.32 </td><td> 1.16 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA4 </td><td> 1.188 </td><td> 0,078 </td><td> 90,4 </td><td> 5,94 </td><td> 2.97 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA5 </td><td> 0,549 </td><td> 0,134 </td><td> 41,8 </td><td> 10.16 </td><td> 5.08 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA6 </td><td> 0,455 </td><td> 0,106 </td><td> 34,6 </td><td> 8,07 </td><td> 4.03 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA7 </td><td> 1.100 </td><td> 0,101 </td><td> 83,7 </td><td> 7,65 </td><td> 3,82 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA8 </td><td> 0,986 </td><td> 0,095 </td><td> 75,0 </td><td> 7,23 </td><td> 3.62 </td><td> NI </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA9 </td><td> 0,085 </td><td> 0,125 </td><td> 6.4 </td><td> 9.48 </td><td> 4,74 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr><tr><td> TA10 </td><td> 0,203 </td><td> 0,105 </td><td> 15,4 </td><td> 7.95 </td><td> 3.98 </td><td> EU </td><td> qualificado </td></tr></tbody></table> Tabela 6:. Resultados do IET obtidos por 10 artigos de teste, controles NC e PC As mesas estão produced por uma planilha do Excel projetado para calcular a viabilidade do tecido e os resultados do IET. Produtos químicos de teste que reduziu a viabilidade do tecido ≤ 60,0% em relação ao NC são classificados como irritantes (&quot;I&quot;, TA3, TA5, TA6, TA9, e TA10) e produtos químicos de teste que tiveram a viabilidade do tecido&gt; 60,0% são classificados como não-irritantes (&quot; NI &quot;, TA1, TA2, TA4, TA7, e TA8).

Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

O objetivo geral do teste de irritação ocular é classificar e rotular substâncias e misturas de acordo com seu potencial de irritação ocular. Este procedimento utiliza um modelo tridimensional de tecido reconstruído semelhante à córnea. Após a chegada, o kit de teste é pré-incubado durante a noite no meio do ensaio; no dia seguinte, os tecidos são hidratados, seguido pela aplicação tópica dos controles positivo e negativo e das substâncias químicas de teste de interesse sobre as superfícies dos tecidos em duplicata.Após um período fixo de exposição, os produtos químicos em teste são removidos por lavagem. Os tecidos são pós-incubados em meio de ensaio fresco e a toxicidade dos produtos químicos é então avaliada por ensaio de MTT. Em última análise, o potencial irritante dos artigos em teste pode ser avaliado comparando-se a viabilidade relativa dos tecidos tratados com o artigo em teste aos tecidos tratados com o controle negativo.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como testes rápidos de irritação em traço, é que ela não envolve animais de laboratório. Utiliza um modelo de tecido ocular desmontado in vitro semelhante à córnea, composto por células humanas normais. É aplicável a todos os tipos de substâncias e misturas e pode discriminar entre produtos químicos que induzem irritação ocular ou dano ocular grave e materiais que não os induzem.Substâncias não irritantes que não requerem classificação e rotulagem. O tecido epitelial reconstruído semelhante à córnea humana ou epi. Ocular é preparado em inserts com uma membrana porosa pela qual os nutrientes passam para as células.O tecido reconstruído forma um epitélio não queratinizado que modela o epitélio da córnea com células progressivamente estratificadas, mas não cornificadas. Após receber o kit epitelial semelhante ao da córnea humana, equilibre os tecidos na embalagem de transporte de 24 poços à temperatura ambiente. Após 15 minutos, abra a bolsa contendo a placa de tecidos de 24 poços em condições estéreis e inspecione todos os tecidos quanto à presença de bolhas de ar entre o gel agros e os insertos. Corte. Abra a fita.Remova a tampa com uma gaze estéril e inspecione a superfície do tecido. Em seguida, distribua alíquotas de um mililitro do meio do ensaio do kit a 37 graus Celsius nos poços de placas de seis poços previamente rotuladas. Depois, use pinças estéreis para absorver suavemente os insertos contendo o tecido sobre uma gaze estéril, removendo qualquer líquido de transporte remanescente, e coloque-os em poços individuais das placas de seis poços.Após uma hora, substitua o meio por um mililitro de meio de ensaio fresco a 37 graus Celsius e incube os tecidos em condições padrão de cultura durante a noite. No dia seguinte, adicione 20 microlitros de DPBS sem cálcio e sem magnésio na superfície apical de cada tecido. Se o DPBS não se espalhar sobre os tecidos, segure suavemente o inserto com pinça e bata levemente no placa para garantir que a solução salina umedeça toda a superfície do tecido.Incube as placas por 30 minutos. Em seguida, para tratar os tecidos com substâncias de teste líquidas, aplique 50 microlitros do controle negativo, do controle positivo e das substâncias de teste apropriadas em duplicata, conforme o cronograma. Tenha cuidado para garantir que os tratamentos cubram toda a superfície dos tecidos e, então, incube os insertos por 30 minutos para tratar os tecidos com substâncias de teste sólidas.Primeiro, transfira os inserções para uma superfície estéril. Mantenha a placa coberta para prevenir contaminação por partículas sólidas no ar. Em seguida, utilizando uma colher nivelada, aplique topicamente 50 miligramas do artigo em teste sobre os tecidos em duplicata de acordo com o cronograma, tomando cuidado para que o tratamento cubra toda a superfície do tecido.Alternativamente, utilize uma seringa pré-cheia de um mililitro com a extremidade cortada. Para colocar os pós diretamente sobre o cultivo. Pressione o êmbolo para aplicar o pó imediatamente após a aplicação dos artigos de teste sólidos, devolva os insertos às suas placas de seis poços e incube os tecidos por seis horas para lavar os tecidos.Após o tratamento, preencha 3 béqueres de 150 mililitros por amostra com 100 mililitros de DPBS ao final da incubação de exposição. Segure a borda superior dos insertos com pinças curvas para removê-los dos poços. Em seguida, usando pinças, pegue dois insertos do mesmo tratamento pelas suas bordas superiores e decante os tratamentos sobre um material absorvente limpo.Em seguida, mergulhe os insertos no primeiro béquer de DPBS, lavando os tecidos com um movimento circular e giratório durante dois segundos. Em seguida, levante os insertos de modo que fiquem quase totalmente preenchidos com DPBS e despeje o líquido de volta no béquer. Repita a lavagem duas vezes no primeiro béquer.Em seguida, enxágue os insertos nos segundo e terceiro béqueres de DPBS 3 vezes cada, da mesma forma, após a última lavagem. Gire cada inserto para um ângulo aproximado de 45 graus, com a extremidade aberta voltada para baixo, e encoste o lábio superior no material absorvente para decantar qualquer DPBS remanescente. Em seguida, imerja imediatamente os tecidos em cinco mililitros de meio de ensaio à temperatura ambiente.Em uma placa pré-rotulada de 12 poços, ao final do período de imersão pós-saturação, decante o meio do ensaio e seque os insertos em um material absorvente. Em seguida, transfira os insertos para uma nova placa de seis poços contendo um mililitro de meio do ensaio aquecido por poço e coloque as placas no incubador para iniciar o ensaio de viabilidade MTT. Transfira os insertos para uma placa de 24 poços contendo 0,3 mililitros de solução de MTT recém-preparada.Pressione levemente os insertos sobre o material absorvente antes da transferência. Remova quaisquer bolhas de ar aprisionadas sob os insertos e retorne os tecidos ao incubador após três horas, apoiando as bases dos insertos sobre o material absorvente. Em seguida, para a extração submersa de artigos de teste líquidos não corantes, imergir os insertos em uma placa de 24 poços previamente rotulada contendo dois mililitros da solução de extração apropriada por poço; para uma extração não submersa de corantes sólidos ou líquidos.Transfira os insertos para uma placa de seis poços previamente rotulada, contendo um mililitro de solução de extração por poço. Em seguida, feche as placas com um selador térmico ou parafilm para inibir a evaporação e realize a extração em um agitador orbital por duas a três horas à temperatura ambiente, com agitação suave ao final da extração submersa. Fure os tecidos e, então, decante o líquido de cada inserto de volta para o poço correspondente, descartando em seguida os insertos com os tecidos.Misture a solução extratora em cada poço e transfira duas alíquotas de 200 microlitros de cada amostra para os poços apropriados de uma placa de 96 poços previamente rotulada, conforme ilustrado no esquema no final da extração não submersa. Descarte os insertos e os tecidos sem perfurar e adicione um mililitro de solução extratora a cada um. Misture bem a solução extratora nos poços e transfira duas alíquotas de 200 microlitros de cada amostra para os poços apropriados de uma placa de 96 poços previamente rotulada, como acabou de ser demonstrado.Por fim, leia a densidade óptica das amostras em um espectrofotômetro de 96 poços a um comprimento de onda de 570 nanômetros, sem utilizar um filtro de referência, e insira os resultados em uma planilha para calcular as viabilidades teciduais respectivas. Considere correções devido à interferência do produto químico em teste conforme indicado no protocolo textual aqui. Resultados representativos de testes de irritação ocular realizados com 10 artigos em teste, além de controles negativo e positivo, são mostrados neste experimento. Uma densidade óptica média de 1,31 para o controle negativo, correspondente a 100% de viabilidade tecidual, foi observada, com uma viabilidade tecidual relativa de 31,2% para o controle positivo. Os artigos em teste 1, 2, 4, 7 e 8 exibiram viabilidades teciduais superiores a 60%, classificando esses artigos como não irritantes. Os artigos em teste 3, 5, 6, 9 e 10.Por outro lado, tecidos que apresentaram variabilidades iguais ou inferiores a 60% foram classificados como irritantes. A diferença na viabilidade tecidual entre tecidos duplicados neste experimento foi inferior a 20% para todos os artigos testados, com exceção do artigo teste dois. Portanto, os resultados de todos os artigos testados, exceto o artigo teste dois, foram considerados válidos, pois atenderam a todos os critérios de aceitação do teste de irritação ocular.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar o teste DICATION, utilizando o modelo in vitro de tecido corneano humano reconstruído semelhante ao tipo 4, para identificação de riscos e rotulagem de produtos químicos. Este procedimento foi implementado nas diretrizes do teste EOC D como parte da estratégia de testes em etapas.

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Neste vídeo, demonstramos a EpiDerm teste de irritação da pele (EpiDerm SIT) desenvolvido e validado...

Um In Vitro Teste de Irritação da pele (SIT), utilizando o EpiDerm Reconstruído epidérmico humano Model (RHE)

Nós fornecemos um método reprodutível para monocamadas confluentes de cultura humana fetal células epitélio pigmentar da retina (hfRPE) células que apresentam morfologia, fisiologia, polaridade, e proteína e os padrões de expressão gênica do tecido nativo adulto. Este trabalho foi estendido para um modelo animal de várias doenças oculares.

Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

Este relatório descreve um método para induzir o olho seco autoimune experimental crônico em ratos Lewis através da imunização com uma emulsão de extrato da glândula lacrimal de rato, ovalbumina e adjuvante completo de Freund, seguido da injeção de extrato da glândula lacrimal e ovalbumina na subconjunctiva forniceal e glândulas lacrimais Seis semanas depois.

Um modelo crônico de Rato de olho seco autoimune com aumento de células de memória E Effect no tecido do globo ocular

A triagem de RNA inibitória pequena de alta taxa de transferência é uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. Aqui, apresentamos o desenvolvimento e validação de modelos de exposição e métodos para o rastreio de alto rendimento de fluoreto de hidrogênio e cloropicrina-induzido por lesão epitelial de córnea.

High Throughput Screening de SiRNA para lesão de células epiteliais de cloropicrina e córnea induzida pelo fluoreto do hidrogênio

Este artigo descreve o desenvolvimento de um método para induzir doenças agudas ou crônicas do olho seco em coelhos injetando concanavalina A a todas as porções do sistema de glândula lacrimal orbital. Esse método, superior aos já relatados, gera um modelo reprodutível e estável de olho seco adequado para o estudo de agentes farmacológicos.

Um modelo de coelho da doença aquosa-deficiente do olho seco induzida pela concanavalina Uma injeção nas glândulas lacrimal: aplicação a estudos de eficácia de drogas

O objetivo deste protocolo é avaliar se diferentes formulações artificiais podem proteger as células epiteliais da córnea humana da dessecação usando um modelo in vitro. Após a exposição a formulações artificiais de lágrimas e proficação, as células epiteliais da córnea humana são avaliadas para a atividade metabólica.

Efeito das formulações de lágrimas artificiais na atividade metabólica das células epiteliais da córnea humana após exposição à dessecação

Este protocolo descreve um método simples para cultivar epiderme humana reconstituída tridimensional de forma reprodutível e robusta. Além disso, caracteriza a relação estrutura-função do modelo de barreira epidérmica. Também são apresentadas as respostas biológicas da epiderme humana reconstituída sobre estímulos proinflamatórios.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

Este artigo descreve os procedimentos utilizados para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas em uma linhagem celular primária e imortalizada.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

A cultura de órgãos ex vivo da córnea suína e a cicatrização de feridas epiteliais fornecem um meio econômico, ético, reprodutível e quantitativo para testar a toxicidade ocular de produtos químicos. Eles também ajudam a elucidar os mecanismos subjacentes à regulação da epitelização e reparo tecidual e na avaliação terapêutica para o tratamento de ceratopatia diabética e cicatrização retardada de feridas.

Avaliação da toxicidade terapêutica e química usando córneas suínas cultivadas em órgãos e cicatrização de feridas epiteliais

Um protocolo reprodutível é apresentado para a preparação, enriquecimento e aplicação de um hidrogel in situ de luz azul e reticulável gelatina–riboflavina para reparo de feridas estromais corneanas em coelhos, incluindo etapas procedimentais para manuseio cirúrgico, tarsórrafia parcial e cuidados pós-operatórios.

Fabricação e Aplicação Cirúrgica de Hidrogéis Enriquecidos de Gelatina–Riboflavina com Foto-Cruzamento para Reparo de Feridas Corneanas em Coelhos

Aprenda o teste de irritação ocular utilizando modelo de tecido epitelial reconstruído semelhante à córnea humana. Este método avalia a viabilidade celular por ensaio MTT para classificar substâncias químicas quanto ao potencial irritante ocular.

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue (Vídeo) | JoVE Journal

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

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