Name: Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Aprenda a quantificar oxidação de ácidos graxos e lipogênese em hepatócitos primários de camundongo. Este método permite avaliar intervenções farmacológicas e genéticas no metabolismo hepático.

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Gostaríamos de agradecer a Susan Gray e Umadevi Chalasani por sua ajuda com aspectos técnicos do protocolo de isolamento de hepatócitos. Este trabalho foi apoiado pela concessão NIDDK 5R01DK089185 (para M.P. Cooper) e pelo Programa Piloto e de Viabilidade DERC na UMMS (para M.P. Cooper).

Todos experimentação animal deve ser realizado em conformidade com os regulamentos locais e federais e com a aprovação de uma IACUC e segurança de radiação administração institucional. 1. Preparação <ol><li> Vários dias antes do ensaio, descongelar a garrafa de 500 ml de fígado Digest Médio (LDM) e recongelar ~ 35 ml de partes alíquotas em tubos cónicos de 50 ml. Armazenar a -20 ° C até serem necessárias. </li><li> Um dia antes do ensaio, pré-limpas esterilizar instrumentos de dissecação por autoclave. </li><li> No dia do ensaio, tratar a quantidade necessária de placas de cultura de 24 poços com colagénio. <ol><li> Misturar 1 parte de 3 mg / mL de colagénio de cauda de rato com 50 partes de PBS. Adicionar cerca de 500 uL a cada poço de uma placa de 24 poços e incuba-se durante 3-5 minutos à temperatura ambiente (TA). Remova a placa de colágeno e permitir ao ar seco na capa. Repetir pelo menos uma vez adicional. Nota: revestimento de colágeno pode ser realizada até uma semana em anúncioVance e as placas armazenadas a 4 ° C em filme plástico selado. </li></ol></li><li> Prepare LDM para ensaio: LDM Descongelar e aquecer a 37 ° C e ajustar o pH a 7,4 utilizando KOH 1N. Filtrar usando filtro de seringa de 0,2 um e coloque em um 42 ° C banho de água de recirculação. </li><li> Aqueça 25 ml de fígado Perfusão Médio a 42 ° C em banho de recirculação de água. </li><li> Prepare a 90% de sílica coloidal revestido com uma solução de polivinilpirrolidona: Adicione 1 ml de DPBS 10x a 9 ml de sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona. Ajustar o pH para 7,4 utilizando HCl 0,1 N. Filtrar com um filtro de seringa estéril de 0,2 um. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Quente meio de plaqueamento de 37 ° C. </li></ol> 2. Isolamento de principal do mouse hepatócitos <ol><li> Configure bomba peristáltica, tubulação, e mesa de dissecção: Esterilizar tubulação por lavagem com etanol a 5 ml de 70% em água destilada, seguido por 10 ml de água estéril. Coloque tubulação no fígado Perfusão Médio e executar bomba para enchertodo o comprimento do tubo. </li><li> Sacrifique rato pelo método aprovado institucionalmente. </li><li> Dissecar aberto a cavidade abdominal: Pulverizar o abdômen do rato generosamente com etanol 70%. Com uma tesoura de extremidade romba, fazer uma incisão na linha média através da derme do comprimento do abdómen e reflectir lateralmente. Adicione uma incisão semelhante no peritoneu para expor as vísceras. <ol><li> Utilizando um instrumento rombo, deslocar os intestinos suavemente para expor a vasculatura abdominal Localizar a veia cava inferior abdominal (IVC) e colocar uma sutura por baixo do vaso sanguíneo, distai em relação à veia renal </li></ol></li><li> Distalmente à sutura, colocar uma agulha e cateter na veia cava inferior, avançando para além do nível da sutura. Com a agulha ainda no lugar, amarrar a sutura ao redor do cateter para segurá-la no lugar. Remova cuidadosamente a agulha. Se isso for feito correctamente, o sangue com fluxo através do cateter. </li><li> Usando uma pipeta, encher o restante da área no meio de perfusão com cateter, assegurandoque nem o ar está presente. Com muito cuidado, coloque a tubulação para o cateter. </li><li> Dissecar aberto da cavidade pulmonar: refletir suavemente os lóbulos superiores do fígado para expor o diafragma. Perfurar cuidadosamente o diafragma com uma tesoura ponta afiada, em seguida, fazer uma incisão lateral para expor a cavidade pleural, tendo o cuidado de evitar a vesícula biliar e vasculatura pleural. Coloque um grampo de bulldog em torno da veia cava inferior torácica apenas proximal à veia hepática. </li><li> Corte a veia porta e ligar a bomba a 3 - 4 ml / min. Perfundir com o fígado Fígado Perfusão médio durante 5 min, utilizando aproximadamente 20 ml de meio de perfusão. Nota: O fígado deve mudar imediatamente de vermelho para cinza / tan. Se porções do fígado permanecer vermelho, isso provavelmente indica má perfusão, ea probabilidade de isolamento bem sucedido é muito reduzido. Durante a perfusão, tenha cuidado para garantir o meio não correr para fora e que não há bolhas de entrar na tubulação. </li><li> Após a 5 min de incubação, parara bomba e tubo para transferir o fígado Digest Médio. Reiniciar a bomba e perfundir o fígado por mais 10 - 15 minutos (até que o meio é esgotada). </li><li> No final da perfusão, parar a bomba. O fígado deve ter um tom rosado e aparecer um pouco alargada. Extirpar o fígado por dissecção cuidadosa. Remover a vesícula biliar e transferir o fígado a 10 cm prato de cultura de tecidos. </li><li> Em uma cabine de segurança biológica, adicionar 10 ml de chapeamento Médio (Tabela 1) para o fígado. Raspe o fígado utilizando quer uma pinça ou um escalpelo para remover os hepatócitos. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 100 mm e transferência para um tubo de 50 ml. Lave a placa com um adicional de 10 ml de Galvanização Médio e piscina no tubo de 50 ml. </li><li> Agregar as células por centrifugação durante 5 min a 350 xg, 4 ° C. </li><li> Aspirar médio e pellet ressuspender em 10 ml de Galvanização Médio e adicionar 10 ml de 90% de sílica coloidal revestido com polyvinylpyrrolidone. Misture delicadamente e centrifugar como na etapa 2.11. Após centrifugação, uma camada de células mortas vai ser flutuante na parte superior da mistura, enquanto que as células vivas irá sedimentar para o fundo. </li><li> Aspirar as células mortas e meio. Lavar 2 vezes com 20 ml de chapeamento Médio, centrifugar como em 2.11. </li><li> Ressuspender as células em 10 ml de chapeamento meio. Contar as células com um hemocitómetro e colocar 9 x 10 4 células / poço em pratos de 24 poços de cultura tratados com colagénio. Incubar em 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante 2 horas. Cada placa pode ser usado tanto para o ensaio de oxidação de ácido gordo ou o ensaio Lipogênese. </li><li> Opcionalmente, para alterar poços Meio de Manutenção (Tabela 1) e a cultura a 37 ° C. As células podem ser cultivadas durante 2 - 3 dias, sem afectar os resultados do ensaio. </li></ol> 3. Ácidos Graxos Oxidação Assay Aviso: O uso de radioactividade pode ser perigoso. Todas as compras, armazenamento, manipulação, e disposal de material radioativo deve ser realizado em conformidade com, estado, e regulamentos e diretrizes federais institucionais. <ol><li> 16 - 20 h antes do ensaio, células de lavar 2 vezes com PBS quente. Mudar as células ao soro inanição meio isento de soro (Tabela 1) com 20 nM de glucagon e incubar durante a noite a 37 ° C. Nota: Por causa de soro fetal bovino contém uma concentração desconhecida de hormônios metabólicos (por exemplo, insulina, glucagon), soro de morrer de fome as células para remover quaisquer efeitos de confusão que isso pode ter sobre o ensaio. As células são viáveis ​​em soro fome Médio para&gt; 24 hr. Tratamento glucagon é utilizado para estimular a oxidação do ácido gordo no interior dos hepatócitos. </li><li> Na manhã do dia do ensaio, preparar a pré-incubação Médio: Ressuspender uma quantidade apropriada de palmitato de sódio em água ultrapura para fazer uma solução 100 mM e aquecimento a 70 ° C durante 10 min. Entretanto, a quantidade necessária preparar (0,5 ml por poço de uma placa de 24 poços)de DMEM com 25 mM de HEPES, 1% de BSA Fracção V, e 20 nM de glucagon. Aquece-se a 37 ° C. <ol><li> Uma vez solubilizado, Palmitato de adicionar a uma concentração final de 250 uM para a forma. Mudar hepatócitos para a pré-incubação médio e incubar a 37 ° C durante 2 horas. Reservar alguns A pré-incubação do meio no 37 ° C, para utilização posterior. </li></ol></li><li> Durante a incubação, seco, uma quantidade adequada de 14 C-palmitato (0,5 uCi / poço) por evaporação sob atmosfera de azoto. <ol><li> Por exemplo, para medir 24 amostras numa placa de 24 poços, 120 ul de transferir 0,1 uCi / ml de C-14 Palmitato de um tubo de 1,5 ml. Lentamente, evapora-se o solvente etanol por sopragem de azoto gasoso através da solução a partir de uma distância de 3-5 cm numa hotte. O solvente deverá evaporar-se em cerca de 30 - 40 min, deixando a seco C-14 Palmitato no fundo do tubo. </li></ol></li><li> Aproximadamente 15 minutos antes do final da incubação, ressuspender o 14C-Palmitato em NaOH 0,1 N (12,5 mL / uCi). Incubar a 70 ° C durante 10 min. Adicione três volumes de quente Pré-Incubação Médio e misture pipetando cima e para baixo. </li><li> Pico de cada poço com 25 uL de 14 C diluída-palmitato. Misturar agitando suavemente a placa e incubar a 37 ° C durante 90 min. Esta é a placa de ensaio. </li><li> Durante a incubação, preparar a Placa de filtro de papel (Figura 1). <ol><li> Remova a tampa de uma estéril placa de 24 poços. Coloque um 2 cm x 2 cm pedaço de papel de filtro na parte inferior de cada um dos poços. Sobrepor a placa com um pedaço de 4 &quot;x 7&quot; parafilme. </li><li> Usando um grande objecto rectangular, tal como uma caixa de ponta de micropipeta, esfregue o parafilme nos poços para perfurar o parafilme as aberturas de poços e criar uma vedação ao longo do resto da placa. Remova os círculos perfuradas de parafilm agora cobre as cavidades. A placa deve agora ser firmemente coberto com filme plástico em todas as áreas, exceto o bem openings. </li></ol></li><li> 10 minutos antes do final da incubação, adicionar 200 uL de NaOH 3 N a cada poço da placa de papel de filtro, certificando-se o papel de filtro absorve o líquido todo. <ol><li> Opcionalmente antes da congelação, a transferência do médio para uma nova placa de 24 poços. Após lavagem uma vez com PBS, lisar as células remanescentes em HCl 0,1 N e calcular o teor de proteína por ensaio BCA. </li></ol></li><li> No final da incubação, snap-congelar a placa de ensaio em azoto líquido. Tenha cuidado para garantir que cada poço está completamente congelado antes de prosseguir. </li><li> Adicionar 100 ul de ácido perclórico a 70% a cada poço da placa de ensaio. Cubra imediatamente com a Placa de filtro de papel. Coloque as placas num agitador orbital e rock na velocidade orbital de 80 rpm à temperatura ambiente durante 2 horas. </li><li> Após a incubação, processar as amostras: <ol><li> Para medir a fracção de CO 2, transferir os quadrados de papel de filtro para 4 ml de fluido de cintilação líquida num cintilaçãofrasco e medida 14 do sinal C. </li><li> Para medir o material solúvel em ácido, transferir 400 ul de meio para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a velocidade máxima para 10 min. Adiciona-se 100 ul do sobrenadante resultante a 500 mL de 2: 1 de clorofórmio-metanol (v / v), e agitar com vortex brevemente. <ol><li> Adicionar 250 mL de água à mistura, e novamente vórtice. Centrifugar as amostras durante 10 min a 3.000 x g. Transferir 200 ul da fase superior a 4 ml de fluido de cintilação líquida num frasco de cintilação de 14 e medir o sinal C. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Lipogênese Assay <ol><li> A noite antes de iniciar o ensaio, lavar as células 2 vezes com PBS quente. Alterar os hepatócitos ao soro fome Médio com 100 nM de insulina. Incubar durante a noite a 37 ° C. Nota: Por causa de soro fetal bovino contém uma concentração desconhecida de hormônios metabólicos (por exemplo, insulina, glucagon), Soro de morrer de fome as células para remover quaisquer efeitos de confusão que isso pode ter sobre o ensaio. As células são viáveis ​​em soro fome Médio para&gt; 24 hr. A insulina é usada neste ensaio para estimular a lipogénese. </li><li> Faça Lipogênese Médio: Soro Fome médio com 100 nM de insulina, 10 ï¿½ de etilo frio e 0,5 uCi de 3 H-Acetato por poço. Mudar para células Lipogênese Médio e incubar a 37 ° C durante 2 horas. Inclui quaisquer compostos de interesse a ser testado. </li><li> Após o período de incubação, lavar as células 2 vezes com PBS. Lisar as células por raspagem em 120 ul de 0,1 N de HCl. Reserva de 10 uL para o ensaio de proteína (por avaliar ensaio BCA), e transferência de 100 uL para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Extrair lípidos pela adição de 500 ul de 2: 1 de clorofórmio-metanol (v / v). Vortex brevemente e incubar à TA durante 5 min. Adicionar 250 uL de água, vortex e incubar à temperatura ambiente durante um adicional de 5 min. Centrifugar as amostras 10 min a 3000 xg, RT. Cuidadosamentetransferência de fase inferior a 4 ml de fluido de cintilação líquida num frasco de cintilação e medir a actividade de 3 h. </li></ol>

<ol><li>Clark, J. M., Brancati, F. L., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+and+etiology+of+elevated+aminotransferase+levels+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 960-967 (2003).</li>
<li>Lazo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+nonalcoholic+Fatty+liver+disease+in+the+United+States%3A+the+third+national+health+and+nutrition+examination+survey%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of nonalcoholic Fatty liver disease in the United States: the third national health and nutrition examination survey, 1988-1994.</a> American journal of epidemiology. 178, 38-45 (2013).</li>
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<li>Adams, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+a+population-based+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study.</a> Gastroenterology. 129, 113-121 (2005).</li>
<li>Feldstein, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+apoptosis+and+fas+expression+are+prominent+features+of+human+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis.</a> Gastroenterology. 125, 437-443 (2003).</li>
<li>Day, C. P., James, O. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steatohepatitis%3A+a+tale+of+two+%27hits%27%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Steatohepatitis: a tale of two 'hits'.</a> Gastroenterology. 114, 842-845 (1998).</li>
<li>Donnelly, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+fatty+acids+stored+in+liver+and+secreted+via+lipoproteins+in+patients+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease.</a> The Journal of clinical investigation. 115, 1343-1351 (2005).</li>
<li>Lambert, J. E., Ramos-Roman, M. A., Browning, J. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+de+novo+lipogenesis+is+a+distinct+characteristic+of+individuals+with+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased de novo lipogenesis is a distinct characteristic of individuals with nonalcoholic fatty liver disease.</a> Gastroenterology. 146, 726-735 (2014).</li>
<li>Parks, E. J., Hellerstein, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+patient-oriented+research.+Recent+advances+in+liver+triacylglycerol+and+fatty+acid+metabolism+using+stable+isotope+labeling+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+lipid+research%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: patient-oriented research. Recent advances in liver triacylglycerol and fatty acid metabolism using stable isotope labeling techniques.</a> Journal of lipid research. 47, 1651-1660 (2006).</li>
<li>Befroy, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+assessment+of+hepatic+mitochondrial+oxidative+and+anaplerotic+fluxes+in+humans+using+dynamic+13C+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct assessment of hepatic mitochondrial oxidative and anaplerotic fluxes in humans using dynamic 13C magnetic resonance spectroscopy.</a> Nature medicine. 20, 98-102 (2014).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+journal%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malaria journal. 6, 169(2007).</li>
</ol>

Os autores indicam que não têm conflitos de interesse.

O tempo de sacrifício para perfusão deve ser inferior a 3 minutos para perfusão ideal e digestão com colagenase do fígado. Uma vez que a perfusão com Perfusão Médio é iniciada, o fígado deve imediatamente alterar a aparência do vermelho ao pálido. Após aproximadamente 10 minutos de incubação com LDM, o fígado aparece inchado e rosa. No caso em que a perfusão é insuficiente, o fígado podem não exibir estas mudanças, e este será normalmente resultam num rendimento mais baixa de hepatócitos. Ap...

A doença hepática gordurosa não alcoólica é uma das principais causas de doença hepática em culturas ocidentalizadas1,2. O acúmulo de lipídios no fígado está associado à morte celular, fibrose e insuficiência hepática por meio de mecanismos ainda desconhecidos3-6. Na doença hepática gordurosa, a oxidação de ácidos graxos β mediada por hepatócitos e a lipogênese de novo são determinantes importantes do acúmulo líquido de lipídios7,8. Este artigo irá, portanto, enfocar o isolamento de hepatócitos, seguido pela quantificação da oxidação de ácidos graxos β e lipogênese de novo.
Numerosas metodologias foram desenvolvidas para interrogar o metabolismo lipídico dos hepatócitos. Embora seja possível medir o metabolismo da gordura in vivo usando isótopos estáveis9,10, esses métodos são caros e requerem um grande número de animais. Além disso, a capacidade de investigar o efeito de produtos químicos exógenos é limitada devido à natureza da experimentação in vivo. Em contraste, o isolamento de hepatócitos primários do fígado de camundongo fornece um caminho acessível para buscar11. Além disso, o estudo de hepatócitos em cultura permite que os investigadores estudem os efeitos de produtos químicos variados no processamento de lipídios, contornando as dificuldades da experimentação in vivo. Finalmente, os hepatócitos isolados evitam qualquer confusão devido à genética variável, uma vez que são derivados do fígado de um único animal.
Aqui isolamos uma cultura de hepatócitos e medimos a oxidação de ácidos graxos β e a lipogênese de novo, usando palmitato radiomarcado. O protocolo detalhado abaixo é direto, eficaz e reproduzível.

<table><tbody><tr><td>Tecnologias de Vida Média de Perfusão Hepática</td><td></td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>Fígado Digest Tecnologias de Vida Média</td><td></td><td>17703034</td><td>Alíquota e armazene a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140079&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumina (BSA), Prato</td> de Cultura <td>de</td> 24 <td>Poços Fraction V MP Biomedicals</td> 103703 <td></td></tr><tr><td></td><td>Corning Falcon</td><td>353047&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação Tygon S3&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06460-34</td><td></td></tr><tr><td>Conectores de Trava de Leur Macho para 200 Barbs</td><td>Cole Parmer</td><td>45518-00</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4" Cateter</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand Silk Suture</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning Falcon</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD Recirculação Banho-maria</td><td>Fisher</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica MasterFlex C/L MasterFlex</td><td></td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Microclamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>Pré-esterilizar em autoclave</td></tr><tr><td>5" Tesoura de operação reta e romba</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>Pré-esterilizar em autoclave</td></tr><tr><td>Lâmina de 24 mm Tesoura de microdissecação reta e de ponta afiada</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Pré-esterilizar em autoclave</td></tr><tr><td>4" Pinça de microdissecação de ponta de 0,8 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5130</td><td>Pré-esterilizar em autoclave</td></tr><tr><td>4" Pinça de microdissecação de curva completa de ponta de 0,8 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-5137</td><td>Pré-esterilizar em autoclave</td></tr><tr><td>Seringa de 60 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 ml Ensaio</td> de proteína <td>BCA Corning Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr>Gabinete <td></td><td></td><td></td>de<td>biossegurança</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorológica pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000, 200, 20 &mu; l pipeta e dicas</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da oxidação de ácidos gordos e lipogênese em rato os hepatócitos primária

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

O metabolismo lipídico no fígado é complexo. Além de importar e exportar lipídios por meio de lipoproteínas, os hepatócitos podem oxidar lipídios por meio da oxidação de ácidos graxos ou, alternativamente, sintetizar novos lipídios por meio da lipogênese de novo. A soma líquida dessas vias é ditada por uma série de fatores, que em certos estados de doença levam à doença hepática gordurosa. O acúmulo excessivo de lipídios hepáticos está associado à resistência à insulina de todo o corpo e à doença cardíaca coronária. Ferramentas para estudar o metabolismo lipídico em hepatócitos são úteis para entender o papel do metabolismo lipídico hepático em certos distúrbios metabólicos.
No fígado, os hepatócitos regulam a quebra e a síntese de ácidos graxos por meio da oxidação β-gordurosa e da lipogênese de novo, respectivamente. A quantificação do metabolismo nessas vias fornece informações sobre o manuseio de lipídios hepáticos. Ao contrário da quantificação in vitro, usando hepatócitos primários, fazer medições in vivo é tecnicamente desafiador e consome muitos recursos. Portanto, quantificar a oxidação de ácidos graxos β e a lipogênese de novo em hepatócitos de camundongos cultivados fornece um método direto para avaliar o manuseio de lipídios de hepatócitos. 
Aqui descrevemos um método para o isolamento de hepatócitos primários de camundongos e demonstramos a quantificação da oxidação de ácidos graxos β e lipogênese de novo, usando substratos radiomarcados.

Isolamentos de hepatócitos normalmente resultam em 1 - 3 x 10 7 células totais. Após incubação durante a noite, as células aparece hexagonal, muitos dos quais serão binucleadas (Figura 2). As células saudáveis ​​deve ser desprovido de granulações ou bolhas, que são indicativas de morte celular. Em geral, o ensaio de oxidação de ácido gordo é executado em três a quatro réplicas por composto de teste. Conta para o CO 2 amostras são aproximadamente um quin...

De novo a lipogênese e oxidação do ácido β-gordo constituem vias metabólicas importantes em hepatócitos, caminhos que são perturbados em vários distúrbios metabólicos, incluindo a doença de fígado gordo. Aqui demonstramos isolamento de hepatócitos primários de rato e descrever quantificação da oxidação de ácidos graxos e β-lipogênese.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o metabolismo de ácidos graxos em hepatócitos primários de camundongo. Isso é realizado primeiramente perfundindo o fígado de um camundongo com meio de digestão, removendo-o e, em seguida, isolando os hepatócitos. O segundo passo é cultivar os hepatócitos em placas revestidas com colágeno.Em seguida, os hepatócitos são tratados com as intervenções experimentais a serem testadas. O passo final é incubar as células na presença de um substrato marcado com radiação. Por fim, a análise por cintilação líquida é utilizada para demonstrar os efeitos de diversas intervenções farmacológicas ou genéticas sobre a oxidação de ácidos graxos ou a lipogênese em hepatócitos primários.Este método pode ajudar a responder diversas questões fundamentais na área do metabolismo e diabetes, incluindo como intervenções farmacológicas e genéticas específicas afetam a biologia dos hepatócitos. A demonstração visual deste método é fundamental por dois motivos. Primeiro, condições específicas de perfusão que afetam a saúde dos hepatócitos são difíceis de obter, e segundo, a quantificação da liberação de dióxido de carbono.O gás não é intuitivo. A demonstração deste

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

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Biologia

Aqui, são descritos métodos otimizados para gerar modelos in vivo e in vitro de esteatose hepática e analisar os fenótipos esteatóticos e parâmetros fisiológicos relacionados.

Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Este artigo fornece três ensaios fáceis e acessíveis para avaliar o metabolismo lipídico em camundongos.

Avaliando a capacidade de manuseio de lipídios em camundongos

Este protocolo pretende ser uma ferramenta para estudar a esteatose e as alterações moleculares, bioquímicas, celulares produzidas pela exposição excessiva de hepatócitos a lipídios in vitro.

Um modelo de esteatose experimental in vitro: cultura celular hepatocitada em meio lipídidamente condicionado

O ácido graxo β-oxidação é uma via metabólica essencial responsável pela geração de energia em muitos tipos diferentes de células, incluindo hepatócitos. Aqui, descrevemos um método para medir o ácido graxo β-oxidação em hepatócitos primários recém-isolados usando ácido palmítico de 14C.

Medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de rato recém-isolados

A lipólise de triglicerídeos em adipócitos é um importante processo metabólico que resulta na liberação de ácidos graxos livres e glicerol. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para medir a lipólise basal e estimulada em adipócitos e tecido adiposo ex vivo de camundongos.

Mensuração da Taxa de Lipólise em Tecido Adiposo Murino Ex Vivo e Pré-adipócitos Primários Diferenciados In Vitro

Este artigo descreve o uso de células HepG2 induzidas por ácido oleico como modelo para doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica.

Modelagem in vitro da deposição de gordura na doença hepática esteatótica associada à disfunção metabólica

Descrição de um processo de fosforilação quantitativa usando cryolysis, solubilziation uréia, fracionamento e enriquecimento HILIC IMAC de peptídeos fosforilados.

Phosphoproteomics quantitativa em ácidos graxos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

Modelos animais ortotópico de câncer de ovário replicar melhor as doenças humanas e, portanto, melhorar nosso entendimento sobre a progressão do câncer e da resposta do tumor à terapia. Um modelo de camundongo recebe uma injeção de intrabursal luciferase células que expressam tumor de ovário. O tratamento é administrado através de gavagem oral. O crescimento do tumor é monitorado...

In vivo de imagens e tratamentos terapêuticos em um modelo de camundongo ortotópico de câncer de ovário

Aprenda a quantificar oxidação de ácidos graxos e lipogênese em hepatócitos primários de camundongo. Este método permite avaliar intervenções farmacológicas e genéticas no metabolismo hepático.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

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