Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o metabolismo de ácidos graxos em hepatócitos primários de camundongo. Isso é realizado primeiramente perfundindo o fígado de um camundongo com meio de digestão, removendo-o e, em seguida, isolando os hepatócitos. O segundo passo é cultivar os hepatócitos em placas revestidas com colágeno.

Em seguida, os hepatócitos são tratados com as intervenções experimentais a serem testadas. O passo final é incubar as células na presença de um substrato marcado com radiação. Por fim, a análise por cintilação líquida é utilizada para demonstrar os efeitos de diversas intervenções farmacológicas ou genéticas sobre a oxidação de ácidos graxos ou a lipogênese em hepatócitos primários.

Este método pode ajudar a responder diversas questões fundamentais na área do metabolismo e diabetes, incluindo como intervenções farmacológicas e genéticas específicas afetam a biologia dos hepatócitos. A demonstração visual deste método é fundamental por dois motivos. Primeiro, condições específicas de perfusão que afetam a saúde dos hepatócitos são difíceis de obter, e segundo, a quantificação da liberação de dióxido de carbono.

O gás não é intuitivo. A demonstração deste procedimento será feita por Tom Akey, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Monte a bomba peristáltica colocando uma extremidade de um tubo estéril no meio de perfusão hepática pré-aquecido e a outra extremidade em um recipiente de resíduos.

Execute a bomba até que todo o comprimento do tubo esteja preenchido com meio. Após o sacrifício de um camundongo de interesse, pulverize abundantemente o abdômen do camundongo com etanol 70%. Em seguida, use uma tesoura de ponta romba para fazer uma incisão mediana através da derme, ao longo do abdômen, e refletir lateralmente.

Realize uma incisão semelhante no peritônio para expor as vísceras. Usando um instrumento rombo, desloque suavemente os intestinos. Para expor a vasculatura abdominal, localize a veia cava inferior abdominal e coloque uma sutura sob o vaso sanguíneo distal à veia renal, distal à sutura.

Coloque uma agulha e um cateter na veia cava inferior e avance-o além da sutura. Com a agulha ainda no lugar, amarre a sutura ao redor do cateter para mantê-lo fixo e, em seguida, remova cuidadosamente a agulha. Se realizado corretamente, o sangue fluirá através do cateter usando uma pipeta.

Preencha a área restante no cateter com meio de perfusão e certifique-se de que não haja ar presente. Em seguida, com muito cuidado, conecte o tubo ao cateter. Depois, fure cuidadosamente o diafragma com uma tesoura de ponta fina e faça uma incisão lateral para expor a cavidade pleural.

Tendo cuidado para evitar a vesícula biliar e a vasculatura pleural, coloque um grampo bulldog na veia cava torácica logo acima da veia hepática. Em seguida, corte a veia porta e ligue a bomba em três a quatro mililitros por minuto. Perfunda o fígado com meio de perfusão hepática por cinco minutos, utilizando aproximadamente 20 mililitros de meio de perfusão.

Durante esse período, observe a mudança imediata da cor do fígado, que passa de vermelha para um tom acinzentado e acastanhado. Se partes do fígado permanecerem vermelhas, isso provavelmente indica uma perfusão inadequada e a probabilidade de um isolamento bem-sucedido é grandemente reduzida. Após a perfusão de cinco minutos, pare a bomba e transfira a tubulação para o meio de digestão do fígado.

Reinicie a bomba e perfunda o fígado por mais 10 a 15 minutos, a uma taxa de três a quatro mililitros por minuto, até que o meio seja esgotado. Ao final da perfusão, pare a bomba.

O fígado deve ter uma tonalidade rosada e parecer um pouco aumentado. Neste momento, excise o fígado mediante dissecação cuidadosa. Transfira para uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros e remova a vesícula biliar.

Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de plaqueamento ao fígado e comece a raspar suavemente o fígado usando um bisturi. Para remover os hepatócitos, filtre a suspensão com um filtro celular de 100 mícrons e transfira-a para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave a placa com mais 10 mililitros de meio de plaqueamento e aspire o líquido para o tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, pelletize as células a quatro graus Celsius, centrifugando por cinco minutos a 350 Gs, aspire o meio e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de plaqueamento. A seguir, adicione 10 mililitros de sílica coloidal a 90% revestida com polivinil perone misturando suavemente, e então pelletize as células como antes. Após a centrifugação, aspire a camada de células mortas que flutua na parte superior da mistura.

Em seguida, lave as células vivas em pellet duas vezes com 20 mililitros de meio de plaqueamento. Re-suspenda o pellet celular final em 10 mililitros de meio de plaqueamento e conte as células utilizando um hemocitômetro. Coloque 90.000 células por poço em placas de cultura de 24 poços revestidos com colágeno. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas, 16 a 20 horas antes de iniciar o ensaio.

Lave as células duas vezes com PBS morno e mude as células para um meio livre de soro com privação de soro. Meio contendo 20 nanomoles de glucagon. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na manhã do ensaio.

Prepare o meio de pré-incubação e, em seguida, substitua pelo meio com soro em privação. Meio para o período de pré-incubação. Incube as células nesta mistura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas durante a incubação.

Seque 0,5 microcuries por poço de palmitato C14 evaporando o solvente etanólico sob nitrogênio aproximadamente 15 minutos antes do fim da incubação; reconstitua o palmitato C14 a 12,5 microlitros por microcurie em hidróxido de sódio 0,1 N. Incube a mistura a 70 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione três volumes do meio de pré-incubação morno e misture pipetando para cima e para baixo.

Adicione 25 microlitros da mistura diluída de palmitato C 14 a cada poço, agitando suavemente a placa, e incube-a a 37 graus Celsius por 90 minutos. Esta é a placa do ensaio. Durante a incubação, remova a tampa de uma placa estéril de 24 poços e coloque um pedaço de papel filtro de dois centímetros por dois centímetros no fundo de cada poço. Em seguida, cubra a placa com um pedaço de param com quatro polegadas por sete polegadas, utilizando um objeto retangular grande, como uma caixa de ponteiras de micropipeta.

Esfregue o paraform nos poços para perfurar o paraform nas aberturas dos poços e criar um selo sobre o restante da placa. Em seguida, remova os círculos perfurados de parfum. Agora, cobrindo os poços 10 minutos antes do final da incubação, adicione 200 microlitros de hidróxido de sódio normal três a cada poço da placa de papel filtro, certificando-se de que o papel filtro absorva todo o líquido.

No final da incubação, congele rapidamente a placa do ensaio em nitrogênio líquido. Em seguida, adicione 100 microlitros de ácido perclórico a 70% a cada poço da placa do ensaio. Cubra imediatamente com uma placa de papel filtro e coloque as placas em um agitador orbital.

Agite as placas a uma velocidade orbital de 80 RPM à temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, meça a fração de dióxido de carbono transferindo os quadrados de papel filtro para quatro mililitros de fluido de cintilação líquida em frascos de cintilação e meça o sinal de C 14 em um contador de cintilação para determinar o material solúvel em ácido. Transfira 400 microlitros do meio para um tubo microfuge de 1,5 mililitro, centrifugue na velocidade máxima por 10 minutos e, em seguida, adicione 100 microlitros do sobrenadante resultante a 500 microlitros de uma mistura dois para um de clorofórmio e metanol.

Vortex a mistura brevemente e, em seguida, adicione 250 microlitros de água à mistura e vortex novamente. Centrifugue as amostras por 10 minutos a mil Gs. Em seguida, transfira 200 microlitros da fase superior para quatro mililitros de fluido de cintilação líquida em um frasco de cintilação e meça o sinal de C 14 após o jejum de soro nas células. Troque as células para meio de lipogênese.

Adicione os compostos de interesse a serem testados e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas após o período de incubação. Lave as células duas vezes com PBS antes de lisar as células adicionando 120 microlitros de ácido clorídrico 0,1 normal. Em cada poço, raspe os poços para liberar o lisado e, em seguida, pipete 100 microlitros do lisado em um tubo microfuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione 500 microlitros de uma mistura dois para um de clorofórmio e metanol a cada tubo. Agite brevemente em vórtex e, em seguida, incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, adicione 250 microlitros de água, agite em vórtex e, então, incube a amostra por mais cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, centrifugue as amostras por 10 minutos a 3000 Gs. Transfira cuidadosamente a fase inferior do líquido separado para quatro mililitros de coquetel de cintilação líquida em um frasco de cintilação e meça a atividade de trítio utilizando um contador de cintilação. Este procedimento geralmente resulta no isolamento de 10 a 30 milhões de hepatócitos por camundongo. Após incubação durante a noite, as células saudáveis apresentam-se hexagonais, muitas das quais estarão nucleadas.

Culturas não saudáveis frequentemente contêm granulações ou bolhas, que são indicativas de morte celular. Aqui são apresentados os resultados de um ensaio de oxidação de ácidos graxos, no qual a adição do promotor da respiração celular F-C-C-P-A e da oligomicina, um inibidor da respiração, foi comparada com um controle veicular para medir a oxidação completa. A razão entre dióxido de carbono e material solúvel em ácido é calculada.

Substâncias que promovem a respiração celular, como o FCCP, deslocarão essa proporção em direção ao dióxido de carbono, indicando maior oxidação por meio do ciclo do ácido tricarboxílico. Inibidores da cadeia respiratória reduzirão a oxidação como um todo quando medidos. Para compostos com atividade lipídica, que aumentam a oxidação de ácidos graxos, como o FCCP, ou que diminuem a síntese de ATP, como a oligomicina, haverá redução da atividade lipídica em hepatócitos cultivados quando comparados aos controles com veículo. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que a perfusão ocorra completamente e em tempo hábil após a eutanásia do animal.

Além disso, durante o ensaio de oxidação de ácidos graxos, o congelamento completo do meio é essencial para medições reprodutíveis de gás carbônico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar hepatócitos primários, bem como utilizar essas células para analisar a oxidação de ácidos graxos e a lipogênese in vitro.