Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

O objetivo geral deste procedimento é avaliar o metabolismo de ácidos graxos em hepatócitos primários de camundongos. Isso é feito primeiro perfundindo um fígado de camundongo com digestão, meio de digestão, removendo-o e, em seguida, isolando os hepatócitos. O segundo passo é cultivar hepatócitos em placas revestidas de colágeno.

Em seguida, os hepatócitos são tratados com as intervenções experimentais a serem testadas. A etapa final é incubar as células na presença de um substrato marcado com rádio. Em última análise, a análise de cintilação líquida é usada para mostrar os efeitos de várias intervenções farmacológicas ou genéticas na oxidação de ácidos graxos ou na lipogênese em hepatócitos primários.

Este método pode ajudar a responder a várias questões-chave no campo do metabolismo e diabetes, incluindo como intervenções farmacológicas e genéticas específicas afetam a biologia dos hepatócitos. A demonstração visual desse método é fundamental por dois motivos. Um, condições específicas de perfusão que afetam a saúde dos hepatócitos são difíceis de obter, e dois, quantificação do dióxido de carbono liberado.

O gás não é intuitivo. Demonstrando este procedimento estará Tom Akey, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Configure a bomba peristáltica colocando uma extremidade do tubo estéril na perfusão hepática pré-quente, meio, e a outra em um recipiente de resíduos.

Ligue a bomba até que todo o comprimento da tubulação esteja cheio de meio. Após o sacrifício de um rato de interesse, borrife o abdômen do camundongo generosamente com 70% de etanol. Em seguida, use uma tesoura de ponta romba para fazer uma incisão na linha média através da derme, do comprimento do abdômen, e refletir lateralmente.

Faça uma incisão semelhante no peritônio para expor as vísceras. Usando um instrumento contundente, desloque suavemente os intestinos. Para expor a vasculatura abdominal, localize a veia cava inferior abdominal e coloque uma sutura sob o vaso sanguíneo distal à veia renal, distal à sutura.

Coloque uma agulha e um cateter na veia cava inferior e avance-o além da sutura. Com a agulha ainda no lugar, amarre a sutura ao redor do cateter para mantê-lo no lugar e, em seguida, remova cuidadosamente a agulha. Se feito corretamente, o sangue fluirá através do cateter usando uma pipeta.

Preencha a área restante do cateter com meio de perfusão e certifique-se de que não há ar. Em seguida, com muito cuidado, conecte o tubo ao cateter. Em seguida, perfure cuidadosamente o diafragma com uma tesoura de ponta afiada e faça uma incisão lateral para expor a cavidade pleural.

Tomando cuidado para evitar a vesícula biliar e a vasculatura pleural, coloque uma pinça bulldog ao redor da veia cava inferior torácica logo proximal à veia hepática. Em seguida, corte a veia porta e ligue a bomba a três a quatro mililitros por minuto. Perfunda o fígado com meio de perfusão hepática por cinco minutos usando aproximadamente 20 mililitros de meio de perfusão.

Durante esse período, observe a mudança imediata de cor do fígado de vermelho para castanho acinzentado. Se porções do fígado permanecerem vermelhas, isso indica má perfusão e a probabilidade de isolamento bem-sucedido é muito reduzida. Após a perfusão de cinco minutos, pare a bomba e transfira o tubo para o meio de digestão do fígado.

Reinicie a bomba e perfunda o fígado por mais 10 a 15 minutos. De três a quatro mililitros por minuto até que o meio se esgote. No final da perfusão, pare a bomba.

O fígado deve ter uma tonalidade rosada e parecer um pouco aumentado. Neste ponto, excise o fígado por dissecção cuidadosa. Transfira para uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros e remova a vesícula biliar.

Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de revestimento ao fígado e comece a raspar suavemente o fígado usando um bisturi. Para remover os hepatócitos, filtre a suspensão com um filtro de células de 100 mícrons e transfira-a para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave a placa com mais 10 mililitros de meio de revestimento e puxe o líquido no tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, pulverize as células a quatro graus Celsius, centrifusão por cinco minutos A 350 Gs, aspire o meio e ressuspenda o pellet celular em 10 mililitros de meio de plaqueamento. Em seguida, adicione 10 mililitros de sílica coloidal a 90% revestida com polivinil perona misturada suavemente e, em seguida, peletize as células como antes. Após a centrifugação, aspire a camada de células mortas flutuando no topo da mistura.

Em seguida, lave as células peletizadas vivas duas vezes com 20 mililitros de chapeamento. Médio resus. Suspenda o pellet celular final em 10 mililitros de meio de plaqueamento e conte as células usando um hemocitômetro coloque 90.000 células por poço em placas de cultura de 24 poços revestidas de colágeno incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas, 16 a 20 horas antes de iniciar o ensaio.

Lave as células duas vezes com PBS quente e mude as células para a falta de soro livre. Meio com 20 nanomoles de glucagon. Incube as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono na manhã do ensaio.

Prepare o meio de pré-incubação e, em seguida, troque a falta de soro. Meio para o meio de pré-incubação. Incube as células nesta mistura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas durante a incubação.

Seque 0,5 micro curies por poço de palmitato de C 14 evaporando o solvente de etanol sob nitrogênio aproximadamente 15 minutos antes do final da incubação, ressuspenda o palmitato de C 14 a 12,5 microlitros por micro curie em 0,1. O hidróxido de sódio normal incuba a mistura a 70 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione três volumes de pré-incubação quente, médio, e misture pipetando para cima e para baixo.

Crave cada poço com 25 microlitros de mistura diluída de palmitato C 14 balançando suavemente a placa e incube a 37 graus Celsius por 90 minutos. Esta é a placa de ensaio Durante a incubação, remova a tampa de uma placa estéril de 24 poços e coloque um pedaço de papel de filtro de dois centímetros por dois centímetros no fundo de cada um dos poços. Em seguida, sobreponha a placa com um pedaço de papel medindo quatro polegadas por sete polegadas usando um objeto retangular grande, como uma caixa de ponta de micropipetadora.

Esfregue a paraforma nos poços para perfurar a paraforma nas aberturas do poço e criar uma vedação sobre o restante da placa. Em seguida, remova os círculos perfurados de parfum. Agora cobrindo os poços 10 minutos antes do final da incubação, adicione 200 microlitros de três hidróxido de sódio normal a cada poço da placa de papel de filtro, certificando-se de que o papel de filtro absorva todo o líquido.

No final da incubação, congele a placa de ensaio em nitrogênio líquido. Em seguida, adicione 100 microlitros de 70% por ácido calórico a cada poço da placa de ensaio. Cubra imediatamente com uma placa de papel de filtro e coloque as placas em um agitador orbital.

Balance as placas a uma velocidade orbital de 80 RPM à temperatura ambiente por duas horas. Em seguida, meça a fração de dióxido de carbono transferindo os quadrados de papel de filtro para quatro mililitros de fluido de cintilação líquido em frascos de cintilação e meça o sinal C 14 em um contador de cintilação para medir o material solúvel em ácido. Transfira 400 microlitros de meio para uma centrífuga de tubo micro fuge de 1,5 mililitro na velocidade máxima por 10 minutos e, em seguida, adicione 100 microlitros do sobrenadante resultante a 500 microlitros de uma mistura de dois para um de clorofórmio e metanol.

Vortex a mistura brevemente e, em seguida, adicione 250 microlitros de água à mistura e vórtice. Novamente, centrifugue amostras por 10 minutos a mil Gs.Em seguida, transfira 200 microlitros da fase superior para quatro mililitros de fluido de cintilação líquido em um frasco de cintilação e meça o sinal C 14 após a falta de soro das células. Transforme as células em meio de lipogênese.

Adicione quaisquer compostos de interesse a serem testados e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por duas horas após o período de incubação. Lave as células duas vezes com PBS antes de lisar as células adicionando 120 microlitros de ácido clorídrico normal 0,1. Para cada um, raspe bem os poços para liberar o lisado e, em seguida, pipete 100 microlitros do lisado em um tubo de micro fuga de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione 500 microlitros de uma mistura de dois para um de clorofórmio e metanol a cada tubo. Vortex brevemente e depois incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação a 250 microlitros de vórtice de água e, em seguida, incubar a amostra por mais cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, centrifugue as amostras por 10 minutos a 3000 Gs.Transfira cuidadosamente a fase inferior do líquido separado para quatro mililitros de fluido de cintilação líquido em um frasco de cintilação e meça a atividade do trítio usando um contador de cintilação. Este procedimento normalmente resulta no isolamento de 10 a 30 milhões de hepatócitos por camundongo. Após a incubação durante a noite, as células saudáveis parecem hexagonais, muitas das quais serão nucleadas.

Culturas não saudáveis geralmente contêm granulações ou bolhas, que são indicativas de morte celular. Os resultados de um ensaio de oxidação de ácidos graxos são mostrados aqui, onde a adição do promotor da respiração celular FCCPA e oligomicina, um inibidor da respiração, foi comparada com um controle de veículo para medir a oxidação completa. A proporção de dióxido de carbono para material solúvel em ácido é calculada.

Substâncias que promovem a respiração celular, como o FCCP, mudarão essa proporção para o dióxido de carbono, indicando mais oxidação por meio do TC. Um ciclo de inibidores da cadeia respiratória diminuirá a oxidação como um todo quando medido. Para compostos de atividade lipo, que aumentam a oxidação de ácidos graxos, como FCCP ou diminuem a síntese de TP, como oligomicina, reduzirão a atividade lipo em hepatócitos cultivados quando comparados com controles de veículo. Ao tentar este procedimento, é importante garantir que a profusão ocorra completamente e em tempo hábil após o sacrifício do animal.

Além disso, durante o ensaio de oxidação de ácidos graxos, o congelamento completo do meio é crítico para medições reprodutíveis de gás dióxido de carbono. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar hepatócitos primários, bem como usar essas células para analisar a oxidação de ácidos graxos e a lipogênese in vitro.