Name: A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a depleção seletiva de microglia em culturas de células granulares cerebelares utilizando L-leucina éster metílico. Este método permite estudar interações neuronais e processos neuroinflamatórios.

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Esta pesquisa foi apoiada por um Aims2Cure, Reino Unido e um UCL Impact Award Ph.D. bolsa de estudos para JMP e um MRC Capacity Building Ph.D. bolsa de estudos em Demência para JMP.

Todos os experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com o Reino Unido Animais (Scientific Procedures) Act, de 1986. 1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos <ol><li> Prepare duas tesouras de aço inoxidável laboratório de dissecação e duas pinças de laboratório de aço inoxidável. Autoclave todos os instrumentos e lugar em uma capa de cultura O / N sob luz ultravioleta (UV) para a esterilização. </li><li> Adicione 500 ml de meio essencial (MEM), meio mínimo de cultura (10% de Soro Bovino Fetal [FBS], KCl 20 mM, 25 mM de NaHCO 3, 30 mM de D-glicose, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 6 ug / ml de ampicilina) e esterilizar filtro. Armazenar a 4 ° C durante meses. </li><li> Prepare placas de cultura de 24 poços contendo 14 milímetros, número um lamelas de espessura. Autoclave as lamelas e revestimento em 100 mg / L de poli-d-lisina (PDL) como previamente descrito 3. Luz UV esterilizar O / N. </li></ol> 2. Preparação de Soluções CGC Cultura <ol><li> Prepare &#39;Uma solução de&#39; (100 ml) em autoclave, a luz UV tratada, estéril dH 2 O contendo 250 mg de glucose, 300 mg de albumina de soro bovino [BSA], 955 mg de fosfato salino tamponado [PBS] (Ca 2+ e Mg + livre), e 1 ml de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O. </li><li> Prepare a &#39;solução B&#39; (10 ml) contendo 1 ml de 5 mg / ml de tripsina diluída em 9 ml de solução A. </li><li> Prepare a &#39;solução C »(10 ml) contendo 1000 unidades de ADNase, 0,5 mg de inibidor de tripsina de soja, 100 ul de 3,8% MgSO 4 7H 2 O ·, diluída para 10 ml com solução A. </li><li> Prepare a &#39;solução D&#39; (20 ml) contendo 3,2 ml de solução C, diluída para 20 ml com solução A. </li><li> Preparar a solução de BSA / de Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS) contendo EBSS, NaHCO 3 25 mM, 3 mM MgSO 4 · 7H 2 O, e4% de BSA, pH 7,4, conforme anteriormente descrito 3. </li><li> Prepare LME adicionando ácido clorídrico puro LME em 5 ml de meio de cultura MEM para dar uma concentração final de 150 mM de LME, voltar a solução a pH 7,4 usando um medidor de pH de bancada, e filtro de esterilização usando uma sulfona de poliéter 28 milímetros (PES) de 0,2 um seringa filtro. </li></ol> 3. Cultura das CGCs <ol><li> Recolha cerebella 4-7 dias de idade filhotes de ratos, como descrito anteriormente 3. Colocar imediatamente em placa de Petri contendo 5 ml de solução A em gelo. </li><li> Deitar fora o excesso de solução de cerebelo e local de tecido na tampa placa de Petri. </li><li> Pique finamente tecido com uma lâmina de barbear bem-inflamado em pelo menos três direções diferentes. </li><li> Adicionar tecido picado à solução B (enxaguar placa de Petri com solução de assegurar tecido limitada é perdido), e colocados no banho de água a 37 ° C durante 5 min. Agitar suavemente a cada dois minutos. </li><li> Adicionar a solução D (20 ml) para o tubo para neutralizar a tripsina, a vibração e centorifuge a 65 xg durante 5 min. </li><li> Deitar fora o sobrenadante. </li><li> Ressuspender em 4 ml de solução C. Tritura-se bem (aproximadamente 10 vezes cada) com três pipetas de vidro ardido de diâmetro decrescente, até que a suspensão é mais homogénea possível. </li><li> Lentamente e suavemente adição de algumas gotas de este homogeneizado no topo da BSA / EBSS. Se ele começa a afundar através do BSA / EBSS, triturar mais e / ou adicionar um pouco mais de solução C. O homogeneizado deve sentar-se em uma camada em cima da BSA / EBSS. Não agite. Gire a 100 g durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento (mole) em 1 ml de meio MEM. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro e a placa a 800.000 células / lamela em 500 ul de meio MEM. Colocar numa incubadora a 37 ° C com 6% de CO 2. </li><li> Mudar o meio do dia seguinte (24-36 horas após a preparação). Adicione uma solução de meio MEM contendo 10 uM do inibidor do ciclo celular arabinofuranosil citidina (AraC). <ol><li> Para cadalamela, reter 250 ul do meio de idade, em uma nova placa de 24 poços, aspirar o resto, adicione 250 mL de meio MEM normal e aspirar este para lavar as células, em seguida, adicione os 250 mL de meio antigo de volta para as células e top-up com 250 ul de meio contendo AraC. Nota: As células podem ser utilizadas a partir de 6 dias in vitro (DIV). </li></ol></li></ol> 4. seletivamente empobrecem a Microglia (realizada em 6 DIV) <ol><li> Adicionar LME puro para 5 ml de uma alíquota separada de meio MEM para dar uma concentração final de 150 mM LME. </li><li> Retorne a solução para pH 7,4 e filtro de esterilizar utilizando um polietersulfonas 28 milímetros (PES) filtro de seringa de 0,2 um. </li><li> Diluir solução a uma concentração de 50 mM (2 x LME) em meio MEM e colocar num banho de água a 37 ° C durante 10 minutos juntamente com meio normal MEM para culturas de controlo. </li><li> Remover metade (250 ul) a partir de culturas de meio MEM CGC e reter a 37 ° C. </li><li> Tratar célulascom meio MEM contendo 2 x LME (250 ul), isto é, diluída 1: 1, dando assim uma concentração de 25 mM, ou com meio de pré-aquecido MEM sem LME (250 ul) para culturas de controlo. </li><li> Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 6% de CO 2 durante 1 h. </li><li> Lave as células duas vezes em meio de pré-aquecido fresco MEM para remover LME contendo mídia, e, em seguida, substituir o meio de cultura retido e um volume igual de meio de pré-aquecido fresco MEM aos poços correspondentes. </li><li> Culturas e volta para a incubadora (humidificado com 6% de CO2 a 37 ° C) e deixar em repouso durante 24 horas antes de qualquer tratamento adicional. </li></ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable%2C+yet+not+extraordinary%2C+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li>
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<li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase%2C+phosphatidylinositol-3-kinase%2FAkt+and+delta-Notch+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li>
<li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116(2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos mais importantes para garantir a eliminação seletiva de sucesso de microglia do CGC e / ou culturas mistas são: 1) a manutenção de uma cultura CGC estéril e saudável; 2) filtro de esterilização a forma LME contendo e voltando a solução para pH 7,4; 3) manter os meios de comunicação CGC retidos e LME contendo media a 37 ° C para evitar choque térmico; e 4) a trabalhar rapidamente para reduzir o tempo de células são mantidas fora da incubadora. Utilizou-se LME 25 mM a es...

O cérebro humano compreende um número estimado de 85 mil milhões de neurónios e mais 85 mil milhões de células não neuronais, incluindo as células da glia 1. Para a maior parte dos últimos 100 anos os neurocientistas têm focado predominantemente na população de células neuronais, acreditando células gliais ser pouco mais do que as células passivas de apoio que forneceram suporte estrutural para os neurônios - daí a etimologia grega da &quot;glia&quot; traduzido para o Inglês como &quot;cola&quot;. Recentemente, no entanto, tornou-se cada vez mais evidente que as interacções neuronais-glial pode ser muito mais fundamental para aspectos básicos da neurobiologia, neurofisiologia, ea gênese e progressão de várias doenças neurodegenerativas. Células do cerebelo granulares (CTC), a população neuronal homogênea mais abundante no cérebro humano, dominar o cerebelo e tornar-se mais de 90% dos seus constituintes celulares. Por conseguinte, estas células têm sido extensivamente usados ​​in vitro, como um sistema modelo para o tele estudo do desenvolvimento neuronal, função e patologia 2-6. No entanto, as culturas CGC ainda conter outros microglia e as células da glia em proporções significativas, sem dúvida. Como resultado, os dados que indicam CGC putativamente respostas neuronais directos para tratamentos diferentes de células podem, de facto surgir - em parte ou no total, - a partir da resposta secundária indirecta de células gliais vizinho na cultura. Para avaliar isto, eliminada selectivamente da microglia CGC de culturas neuronais, com o auxílio de éster metílico de L-leucina (LME). LME é um agente lysomotropic originalmente usado para destruir selectivamente macrófagos 7, e uma vez que tem sido utilizada para esgotar a microglia também selectivamente a partir neural, astrócitos, e culturas gliais mistas 8,9,10. LME é internalizado pelos macrófagos e microglia, em que ele provoca perturbações lisossômico e apoptose subseqüente 13,14. Macrófagos e microglia são caracteristicamente rica em lisossomos, fazendo com que sejam particularly vulnerável após a exposição ao tratamento LME. Este protocolo fornece uma maneira poderosa, mas simples e fácil de determinar a contribuição de microglia em experimentos que utilizam outros sistemas de cultura neuronal / CGC e gliais.

<table><tbody><tr><td>Fórceps&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>A extremidade curvada facilita a remoção do cerebelo&nbsp;</td></tr><tr><td>Tesoura de micro-dissecação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>Ponta reta e afiada facilita a dissecção de roedores P4-7</td></tr><tr><td>Cloridrato de éster metílico de L-leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>Solução EBSS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>Capa de lamínulas 1 dia antes do uso&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina de soja&nbsp;</td>Anticorpo anti-ED1 para camundongo <td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table>

a depleção seletiva de microglia de cerebelar granule culturas de células utilizando l-leucina éster metílico

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, as células imunocompetentes residentes do SNC, desempenham papéis multifacetados na modulação e controle da função neuronal, bem como na mediação da imunidade inata. Os modelos primários de cultura de células de roedores avançaram muito nossa compreensão das interações neuronal-glial, mas apenas recentemente foram utilizados métodos para eliminar especificamente a microglia de culturas mistas. Uma dessas técnicas – aqui descrita – é o uso de éster metílico de L-leucina, um agente lisomotrópico que é internalizado por macrófagos e micróglia, causando ruptura lisossômica e subsequente apoptose13,14. Experimentos usando éster metílico de L-leucina têm o poder de identificar a contribuição da microglia para o ambiente celular circundante sob diversas condições de cultura. Usando um protocolo otimizado em nosso laboratório, descrevemos como eliminar a microglia da cultura de células granulares cerebelares de roedores P5. Essa abordagem permite avaliar o impacto relativo da microglia nos dados experimentais, bem como determinar se a microglia está desempenhando um papel neuroprotetor ou neurotóxico em modelos de cultura de condições neurológicas, como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer ou Parkinson.

A capacidade desta técnica para eliminar selectivamente a partir CGC microglia e / ou culturas mistas baseia-se na capacidade subsequente do investigador para identificar com precisão e diferenciar microglia das suas células vizinhas. Isto pode ser alcançado utilizando uma máquina de células específicas de microglia, tais como isolectina-B4, tal como ilustrado na Figura 1. Tal como demonstrado na Figura 2, não há alterações observáveis ​​para astrócitos e densidade neuronal e morfologia...

A microglia pode influenciar neurônios e outras glias em cultura por vários mecanismos autônomos não celulares. Aqui, apresentamos um protocolo para esgotar seletivamente a micróglia de culturas neuronais primárias. Este método tem o potencial de elucidar o papel das interações microglial-neuronal, com implicações para condições neurodegenerativas onde a neuroinflamação é uma característica marcante.

A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

O objetivo geral deste procedimento é eliminar seletivamente células microgliais de culturas de células granulares do cerebelo. Isso é realizado primeiramente cultivando uma população de cgc e armazenando-as em uma incubadora a 37 graus Celsius com 6% de dióxido de carbono. O segundo passo é preparar uma solução de LME em meio MEM para obter uma concentração final de 150 milimolar de LME.A próxima metade do meio MEM das culturas de CGC é removida e mantida no incubador, e as culturas de CGC são então substituídas por um volume igual de LME contendo meio MEM e colocadas no incubador a 37 graus Celsius com 6% de dióxido de carbono por uma hora. O passo final é lavar as culturas de CGC duas vezes com meio MEM pré-aquecido fresco.Substitua o meio de cultura retido por um volume igual de meio fresco e, em seguida, retorne as células ao incubador por 24 horas antes de qualquer tratamento adicional. Por fim, a imunoquímica e a microscopia de fluorescência são utilizadas para demonstrar a depleção específica de células microgliais em culturas de células granulares cerebelares. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurobiologia, como quais efeitos as microgl

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra uma técnica para isolar a microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto. Primeiro, o córtex sofre segmentação e homogeneização para remover neurônios e outras células gliais, preservando a microglia. Em seguida, a suspensão celular é exposta a microesferas magnéticas anti-mielina e a um campo magnético, separando efetivamente as células da micróglia e mielóides dos detritos de mielina e células contendo mielina.

Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

Este vídeo demonstra a técnica para isolar e cultivar neurônios granulares cerebelares primários de camundongos. As células são tratadas com um antimetabólito para eliminar as células gliais em proliferação e produzir uma cultura pura de neurônios granulares cerebelares.

Isolamento e cultura de neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

Este vídeo demonstra uma técnica para a remoção seletiva da microglia de uma cultura neuronal primária de rato. Os neurônios do grânulo cerebelar são tratados com um antimetabólito para eliminar as células gliais em proliferação. Além disso, eles são tratados com agentes direcionados ao lisossomo para esgotar a micróglia da cultura.

Remoção seletiva de microglia de uma cultura de neurônios de grânulos cerebelares de rato

Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de células progenitoras neurais cerebelares do cerebelo de um filhote de camundongo. Os progenitores dos neurônios do grânulo cerebelar são isolados e purificados por meio de adesão diferencial, removendo efetivamente os astrócitos. Esses progenitores cultivados subsequentemente se diferenciam em neurônios granulares cerebelares.

Isolando e Cultivando Progenitores de Neurônios Granulares Cerebelares Murinos

Este vídeo demonstra um protocolo para extrair células microgliais de lesões desmielinizantes em cérebros de camundongos usando classificação magnética de células. O protocolo envolve a dissecação do tecido cerebral lesionado contendo células microgliais, o tratamento do tecido com enzimas específicas para obter uma suspensão unicelular e a utilização de esferas magnéticas específicas do receptor microglial para isolar as células microgliais.

Isolando a microglia de lesões desmielinizantes do cérebro de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo

Este vídeo descreve a geração de um modelo de lesão neuronal usando espécies reativas de oxigênio (ROS) em neurônios granulares cerebelares primários de camundongos. Ele detalha o processo de indução do estresse oxidativo adicionando altas concentrações de peróxido de hidrogênio. A exposição a ROS causa quebras de fita de DNA e instabilidade genômica. Além disso, a oxidação das proteínas celulares prejudica suas funções, enquanto a peroxidação lipídica compromete a integridade da membrana. Essa...

Modelagem da morte neuronal induzida por espécies reativas de oxigênio em neurônios de grânulos cerebelares de camundongos

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Este protocolo descreve como medir com precisão a viabilidade neuronal usando fluoresceína diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) dupla coloração em neurônios cultivados cerebrais grânulo, uma cultura primária neuronal utilizado como um modelo in vitro em neurociência e neuropharmacology investigação.

Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar

Este protocolo descreve um método simples para isolar e neurônios de grânulo cerebral principal do rato (CGNs) de filhotes de 6-7 dias de idade, transdução eficiente de CGNs para perda e ganho de estudos de função, de cultivo e modelagem excitotoxicidade neuronal induzida por NMDA, morte celular baixo potássio-induzida, danos ao DNA e estresse oxidativo usando o mesmo modelo de cultura.

Modelagem de morte Neuronal e a degeneração no Mouse grânulo cerebelar primária de neurônios

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e purificar a microglia primária em modelos animais de doenças desmielinizantes, utilizando a triagem celular ativada por colunas magnéticas.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Aprenda a depleção seletiva de microglia em culturas de células granulares cerebelares utilizando L-leucina éster metílico. Este método permite estudar interações neuronais e processos neuroinflamatórios.

A depleção seletiva de Microglia de Cerebelar Granule culturas de células utilizando L-leucina éster metílico

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