Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas

O objetivo geral deste procedimento é eletrofioar uma estrutura tridimensional de fases, permitindo o cultivo conjunto de células humanas adultas totalmente diferenciadas, a fim de replicar a matriz extracelular natural que essas células encontram em C dois. Isso é realizado primeiramente por meio da eletrofiação de uma estrutura de microfibras com alinhamento aleatório. O segundo passo consiste em formar uma estrutura bifásica ao eletrofiar diretamente sobre a estrutura de microfibras uma camada de nanofibras com alinhamento aleatório.

Em seguida, um suporte distinto de nanofibras alinhadas é eletrofiado. O passo final consiste em semear cada suporte com seu respectivo tipo celular e co-cultivar os suportes em um sistema de biorreator perfundido como um único constructo. Por fim, as interações multicelulares podem ser analisadas por meio da medição da liberação de mediadores e imunomarcação.

O construto. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como membranas transformadas 2D, é que os esqueletos elétricos fornecem um ambiente fibroso tridimensional que pode ser adaptado para oferecer uma morfologia fisiologicamente relevante. É uma estrutura mais porosa e permite o cultivo central de múltiplos tipos celulares.

Este método fornece uma plataforma estável utilizando células humanas saudáveis ou doentes, agrupadas ou não, como um modelo in vitro. Isso ajudará a reduzir nossa dependência de modelos animais, que possuem limitações quanto à relevância para doenças humanas, além de diminuir o número de animais utilizados em experimentos. Embora este método possa fornecer informações sobre doenças como asma e DPOC, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como no estudo de doenças inflamatórias do intestino ou no desenvolvimento de um modelo de pele para testes químicos.

Para começar, prepare três soluções diferentes de PET com 10 mililitros, dissolvendo 8%, 10% e 30% de PET em misturas um para um de clorometano e ácido tricloroacético. Agite as soluções durante a noite à temperatura ambiente para dissolver o PET no dia seguinte. Transfira as soluções de PET para seringas e fixe uma agulha de calibre 23 na seringa contendo a mistura de 8% e agulhas de calibre 18 nas outras duas seringas contendo as soluções de 10% e 30% de PET.

Prepare a estrutura de microfibra. Primeiro, carregue a seringa contendo a solução de PET 30% na bomba de infusão com a ponta da agulha voltada para baixo. Posicione o tambor a 15 centímetros da ponta da agulha e certifique-se de que a agulha esteja apontando para o centro do tambor.

Conecte a linha de alimentação elétrica positiva à ponta da agulha usando um clipe metálico tipo jacaré e aterre o coletor conectando a linha de terra ao soquete banana. Ligue o motor e ajuste a velocidade do coletor para 60 RPM. Ligue a bomba de seringa para fornecer uma vazão de 2,0 mililitros por hora.

Ao criar os andaimes de microfibras, deixe a bomba funcionar até que a solução seja extrudida pela ponta da agulha, a fim de escorvar o sistema removendo qualquer ar presente na agulha. Em seguida, pare a bomba na bomba de seringa.

Defina o volume total da solução a ser expulsa em dois mililitros e inicie a bomba. Em seguida, aplique um potencial de 14 quilovolts entre a agulha e o mandril para eletrofiação por uma hora, até que dois mililitros da solução de PET 30% tenham sido eletrofiados, com o andamio de microfibras ainda sobre o mandril. Desligue o potencial elétrico. Remova o clipe de crocodilo e substitua a seringa contendo a solução de PET 30% pela seringa contendo a solução de PET 8%.

Em seguida, reconecte o clipe de jacaré à agulha de calibre 23. Altere a taxa de fluxo da bomba de seringa para 0,5 mililitros por hora e purgue a agulha acionando a bomba de seringa até que a solução escoe pela ponta. Com o mandril continuando a girar a 60 RPM, aplique o potencial de 14 quilovolts entre a ponta da agulha e o mandril e defina o volume total a ser extrudado pela bomba de seringa como dois mililitros.

Eletrorratear por quatro horas até que dois mililitros da solução de PET 8% tenham sido eletrofiados. Quando a eletrofiação estiver concluída, desligue a fonte de alimentação e o motor que gira o mandril. Corte o suporte bifásico com uma lâmina ao longo da largura do mandril para produzir uma folha bidimensional de suporte com o tamanho da área superficial do mandril.

Para preparar os scaffolds de PET alinhados, carregue a seringa contendo a solução de PET a 10% na bomba de infusão com a ponta da agulha voltada para baixo. Em seguida, conecte o grampo de jacaré à agulha. Ajuste a vazão para 0,5 mililitros por hora e prepare a agulha com a solução de PET.

Em seguida, ligue o motor e ajuste a velocidade de rotação do mandril para 2000 RPM. Depois, ligue a bomba de seringa. Ajuste a fonte de tensão para 14 quilovolts e ligue a fonte de alimentação do eletrofiação por quatro horas, até que dois mililitros da solução tenham sido eletrofiados.

Quando a eletrofiação estiver concluída, desligue a fonte de alimentação e o motor. Corte o suporte com uma lâmina ao longo da largura do mandril para produzir uma folha bidimensional de suporte alinhado. Armazene os suportes eletrofiados em folha de alumínio para reduzir a carga eletrostática.

Utilize uma caneta de biópsia com diâmetro de 0,8 milímetros para recortar discos de scaffolds bifásicos ou alinhados das folhas de SPU. Em seguida, cole o disco do scaffold bifásico a uma junta usando cola não tóxica para aquário. Coloque as juntas e os scaffolds em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.

Esterilize as juntas e estruturas utilizando radiação ultravioleta I por 30 minutos em cada lado das estruturas. Em seguida, mergulhe em uma solução antibiótica antimicótica a 20% durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave as estruturas com PP S3 vezes e armazene as estruturas em PBS a quatro graus Celsius até o momento de utilização.

Transfira as estruturas bifásicas do PBS para uma nova placa de 12 poços e aqueça-as em meio DMEM suplementado com 10% de FCS por uma hora a 37 graus Celsius. Remova o meio DMEM suplementado e posicione a fase de microfibras das estruturas; aplique 15.000 células fibroblásticas MRC cinco em 30 microlitros de meio DMEM suplementado sobre cada estrutura para auxiliar a penetração dos fibroblastos na estrutura. Coloque a placa sobre um agitador orbital e agite as estruturas a 100 RPM por duas horas.

Em seguida, adicione dois mililitros de meio DMEM suplementado a cada suporte e incube os suportes durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova o meio dos poços e vire os suportes de modo que a fase de nanofibras dos suportes fique voltada para cima. Em seguida, plaque 30.000 células epiteliais Cali três em 30 microlitros de meio D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de FCS sobre a fase de nanofibras do suporte.

Incube a matriz por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes de submergir as matrizes em uma mistura 70 30 de D-M-E-M-F 12 e meio suplementado com DMEM e continue com a incubação estática por mais 12 horas para cultivar as células musculares lisas da via aérea. Primeiramente, transfira as matrizes alinhadas do PBS para uma placa de 12 poços nova e aqueça-as junto com o meio suplementado com DMEM por uma hora a 37 graus Celsius. Remova o meio suplementado com DMEM e adicione 25.000 células musculares lisas da via aérea em 30 microlitros de meio suplementado com DMEM a cada matriz e incube-as por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Uma vez fixados, submergir os suportes em meio suplementado com DMEM. Retorná-los ao incubador e deixá-los durante a noite antes de montar um cultivo tricelular no biorreator. No dia seguinte, colocar o suporte biphasico com sementes no compartimento do biorreator, com a fase epitelial voltada para cima, em direção à câmara.

Em seguida, posicione o suporte alinhado sob o suporte bifásico de modo que fique adjacente à fase de microfibras do suporte bifásico. Fixe as duas câmaras do biorreator juntas. Em seguida, monte dois circuitos de fluxo por perfusão dentro de uma incubadora conforme descrito no protocolo textual complementar e bombeie o meio ao redor dos dois circuitos a aproximadamente 0,1 mililitros por minuto usando uma bomba peristáltica após uma semana.

Remova o meio da câmara apical e mantenha o cultivo. As células epiteliais no interface ar-líquido por uma semana adicional antes da análise, após duas semanas no biorreator, o esqueleto de tricultura mostrado aqui foi fixado e seccionado para mostrar os núcleos celulares distribuídos por todas as três camadas da estrutura. Os núcleos celulares foram corados com DPI e aparecem azuis, enquanto o material do esqueleto aparece cinza. Abaixo há imagens de microscopia eletrônica de varredura dos esqueletos de nanofibras e microfibras eletrofiadas e alinhadas, preparados para o cultivo de células epiteliais, fibroblastos e células musculares lisas, respectivamente.

Os três tipos celulares mostraram um aumento na viabilidade quando cultivados em suas estruturas individuais ao longo de um período de duas semanas. Cada um também continuou a expressar proteínas específicas do tipo celular após o período de cultivo de duas semanas. Ao tentar realizar este procedimento, é importante lembrar-se de pesquisar a matriz extracelular nativa que você está tentando recriar com as fibras eletrofiadas.

As células se comportarão de maneira diferente ao se aderirem a diferentes topografias 3D. Por exemplo, as células epiteliais formarão uma barreira funcional apenas quando cultivadas em nanofibras. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um sistema de co-cultivo multicamadas, que pode ser usado para o estudo de interações intercelulares em um ambiente de cultivo dinâmico.

Não se esqueça de que é importante ajustar os parâmetros de eletrofiação, como taxa de fluxo e voltagem, de acordo com o polímero e o sistema de solvente que você pretende utilizar durante este procedimento. Isso é crucial para gerar as fibras desejadas. Além disso, lembre-se de realizar a eletrofiação em uma capela ou armário ventilado para permitir a extração adequada dos solventes.