Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas In Vitro Modelo da parede das vias aéreas

O objetivo geral deste procedimento é eletrogirar um andaime fásico tridimensional, permitindo a cocultura de células humanas adultas totalmente diferenciadas, a fim de replicar a matriz extracelular natural que essas células encontram em C dois. Isso é feito pela primeira eletrofiação, um andaime de microfibra alinhado aleatoriamente. O segundo passo é formar um andaime bifásico girando eletro uma camada de nanofibra alinhada aleatoriamente diretamente no andaime de microfibra.

Em seguida, um andaime de nanofibra alinhado separado é eletrofiado. A etapa final é semear cada andaime com seu respectivo tipo de célula e co-cultivar os andaimes em um sistema de biorreator profuso como uma única construção. Em última análise, as interações multicelulares podem ser analisadas por meio da medição da liberação de mediadores e imunocoloração.

A construção. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como membranas transformadas em 2D, é que os andaimes elétricos fornecem um ambiente fibroso 3D que pode ser adaptado para fornecer uma morfologia fisiologicamente relevante. É uma estrutura mais porosa e permite a cultura central de vários tipos de células.

Este método fornece uma plataforma estável usando células humanas coorte, doentes ou saudáveis como um modelo in vitro. Isso ajudará a reduzir nossa dependência de modelos animais, que têm uma limitação em sua relevância para doenças humanas e diminuir o número de animais usados em experimentos. Embora esse método possa fornecer informações sobre doenças como asma e DPOC, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como para o estudo de doenças inflamatórias do intestino ou para o desenvolvimento de um modelo de pele para testes químicos.

Para começar, prepare três soluções diferentes de 10 mililitros de PET, dissolvendo 8% 10% e 30% de PET em misturas individuais de clorometano e ácido tricloroacético. Agite as soluções durante a noite em temperatura ambiente para dissolver o PET no dia seguinte. Transfira as soluções PET para seringas e coloque uma agulha de calibre 23 na seringa contendo a mistura de 8% e agulhas de calibre 18 nas outras duas seringas contendo as soluções de PET de 10% e 30%.

Prepare o andaime de microfibra. Primeiro, carregue a seringa contendo a solução de PET a 30% na bomba da seringa com a ponta da agulha na parte inferior. Posicione o manl a 15 centímetros da ponta da agulha e certifique-se de que a agulha esteja apontada para o centro do tambor.

Prenda a linha de alimentação elétrica positiva à ponta da agulha usando um clipe de crocodilo metálico e aterre o manl conectando a linha de aterramento ao soquete banana. Ligue o motor e defina a velocidade de controle para 60 RPMs. Ligue a bomba da seringa para fornecer uma vazão de 2.0 mililitros por hora.

Ao criar os andaimes de microfibra. Deixe a bomba funcionar até que a solução seja extrudada da ponta da agulha para preparar o sistema removendo o ar da agulha. Em seguida, pare a bomba na bomba da seringa.

Defina o volume total da solução a ser expelida para dois mililitros e ligue a bomba. Em seguida, aplique um potencial de 14 quilovolts entre a agulha e a eletrorotação do mandril por uma hora até que dois mililitros da solução de 30% PET tenham sido eletrogirados com o andaime de microfibra ainda no mandril desligue o potencial de tensão. Remova o clipe de crocodilo e substitua a seringa contendo a solução de 30% PET pela seringa contendo a solução de 8% PET.

Em seguida, reconecte o clipe de crocodilo à agulha de calibre 23. Altere a vazão da bomba de seringa para 0,5 mililitros por hora e prepare a agulha executando a bomba de seringa até que a solução flua da ponta. Com o mandril continuando a girar a 60 RPMs, aplique o potencial de 14 quilovolts entre a ponta da agulha e o mandril e defina o volume total a ser extrudado pela bomba de seringa em dois mililitros.

Eletro gire por quatro horas até que dois mililitros da solução 8%PET tenham sido eletrofiados. Quando a fiação elétrica estiver concluída, desligue a fonte de alimentação e o motor girando o mandril. Corte o andaime bifásico com uma lâmina ao longo da largura do mandril para produzir uma folha 2D de andaime do tamanho da área de superfície do mandril.

Para preparar andaimes PET alinhados, carregue a seringa contendo a solução de PET a 10% na bomba da seringa com a ponta da agulha na parte inferior. Em seguida, conecte o clipe de crocodilo à agulha. Defina a vazão para 0,5 mililitros por hora e prepare a agulha com solução PET.

Em seguida, ligue o motor e ajuste a velocidade de rotação do mandril para 2000 RPMs. Em seguida, ligue a bomba de seringa. Defina a tensão de alimentação para 14 quilovolts e ligue a fonte de alimentação eletro spin por quatro horas até que dois mililitros de solução tenham sido eletrogirados.

Quando a fiação elétrica estiver concluída, desligue a fonte de alimentação e o motor. Corte o andaime com uma lâmina ao longo da largura do mandril para produzir uma folha de andaime 2D alinhada. Armazene os andaimes eletrofiados em papel alumínio para reduzir a carga eletrostática.

Use uma caneta de biópsia de 0,8 milímetro de diâmetro para perfurar discos de andaimes bifásicos ou alinhados das folhas de SPU. Em seguida, cole o disco de andaime bifásico a uma junta usando cola de aquário não tóxica. Coloque as juntas e andaimes em uma placa de cultura de tecidos de 12 poços.

Esterilize as juntas e andaimes usando radiação ultravioleta I por 30 minutos em cada lado dos andaimes. Em seguida, mergulhe em uma solução antibiótica antimicótica a 20% durante a noite a quatro graus Celsius no dia seguinte. Lave os andaimes com PP S3 vezes e armazene os andaimes em PBS a quatro graus Celsius até que sejam usados.

Transfira os andaimes bifásicos do PBS para uma nova placa de 12 poços e aqueça-os em meio DMEM suplementado com 10% FCS por uma hora a 37 graus Celsius. Remova o meio suplementado com DMEM e coloque a fase de microfibra dos andaimes para semear 15.000 células de cinco fibroblastos MRC em 30 microlitros de meio suplementado com DMEM em cada andaime para ajudar os fibroblastos a penetrar no andaime. Coloque a placa em um agitador orbital e agite os andaimes a 100 RPMs por duas horas.

Em seguida, adicione dois mililitros de mídia suplementada com DMEM a cada andaime e incube os andaimes durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, remova a mídia dos poços e vire os andaimes para que a fase de nanofibra dos andaimes fique voltada apicalmente. Em seguida, semeie 30.000 células epiteliais de Cali três em 30 microlitros de meio D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% FCS na fase de nanofibra do andaime.

Incube o andaime por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono antes de submergir os andaimes em uma mistura 70 30 de meio suplementado com D-M-E-M-F 12 e DMEM e continuar com incubação estática por mais 12 horas para cultivar as vias aéreas. Em primeiro lugar, as células musculares lisas transferem os andaimes alinhados do PBS para uma placa nova de 12 poços e aquecem-nos e o meio suplementado com DMEM por uma hora a 37 graus Celsius. Remova o meio suplementado com DMEM e adicione 25.000 células musculares lisas das vias aéreas em 30 microlitros de meio suplementado com DMEM a cada andaime e incube-os por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Uma vez conectados, mergulhe os andaimes em meios suplementados com DMEM. Devolva-os à incubadora e deixe-os durante a noite antes de montar uma tricultura no biorreator. No dia seguinte, coloque o andaime de sementes bifásico na câmara do biorreator com a fase epitelial voltada para cima na câmara.

Em seguida, coloque o andaime alinhado embaixo do andaime bifásico de modo que fique adjacente à fase de microfibra do andaime bifásico. Trave as duas câmaras do biorreator juntas. Em seguida, monte dois circuitos de fluxo de perfusão dentro de uma incubadora, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, e bombeie o meio ao redor dos dois circuitos a aproximadamente 0,1 mililitros por minuto usando uma bomba peristáltica após uma semana.

Remova o meio da câmara apical e da cultura. As células epiteliais na interface ar-líquido por mais uma semana antes da análise após duas semanas no biorreator, o andaime de tricultura mostrado aqui foi fixado e seccionado para mostrar os núcleos celulares distribuídos em todas as três camadas dos núcleos das células de construção foram corados com DPI e aparecem em azul onde o material do andaime aparece em cinza. Aqui estão as imagens do microscópio eletrônico de varredura da microfibra de nanofibra fiada eletro e andaimes alinhados que foram preparados para semear células epiteliais, fibroblastos e células musculares lisas, respectivamente.

Todos os três tipos de células mostraram um aumento na viabilidade quando cultivados em seus andaimes individuais durante um período de duas semanas. Cada um deles também continuou a expressar proteínas específicas do tipo de célula após o período de cultivo de duas semanas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pesquisar a matriz extracelular nativa que você está tentando recriar com as fibras elétricas.

As células se comportarão de maneira diferente ao serem anexadas a diferentes topografias 3D. Por exemplo, as células epiteliais só formarão uma barreira funcional quando cultivadas em nanofibras. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir um sistema de co-cultura multicamadas, que pode ser usado para o estudo de interações intercelulares em um ambiente de cultura dinâmica.

Não se esqueça de que é importante adaptar seus parâmetros de eletrofiação, como vazão e tensão, para se adequar ao sistema de polímero e solvente que você pretende usar durante a execução deste procedimento. Isso é crucial para gerar as fibras desejadas. Além disso, lembre-se de optar por girar um exaustor ou armário ventilado para permitir que os solventes sejam extraídos adequadamente.