Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar e purificar o copo de camundongo para células em grande número para estudar a toxicidade das nanopartículas. Isso é conseguido perfundindo fígados de camundongos com uma solução H-B-S-S-E-G-T-A e um colágeno, uma solução para digerir suavemente o tecido hepático. Em seguida, as células do fígado são purificadas por densidade, centrifugação e adesão seletiva para obter uma cultura de copo purificado para as células.

Em seguida, a análise de citometria de fluxo é realizada para confirmar a pureza e as propriedades ácidas F do copo para as células. São obtidos resultados que mostram que a toxicidade do nanotubo de carbono funcionalizado pode ser medida em copo para células. Com base no suporte LDHSA modificado, este modelo pode ser aplicado a testes de toxicidade de nanopartículas.

O método que pretendemos mostrar hoje pode ajudar a responder a questões-chave no campo da nanotoxicologia, como avaliar a toxicidade de transportadores de medicamentos desenvolvidos recentemente, isso é muito importante, pois a maioria das linhagens celulares imortalizadas usadas mostram propriedades significativamente diferentes dos tecidos dos quais foram derivados. Uma demonstração visual desse método é crucial. Se o método for realizado com sucesso, resultará na obtenção de um alto rendimento e pureza de células ke, que podem ser usadas como modelo para rastrear uma variedade de nanopartículas para essa toxicidade.

Depois de preparar recentemente todos os reagentes listados na tabela de materiais e reagentes encontrados com o protocolo de texto que acompanha, aqueça a solução E-G-T-A-H-B-S-S e a solução de colagenase a 40 graus Celsius por 30 minutos, use etanol 70% para enxaguar a tubulação flexível da bomba. Em seguida, despeje 40 mililitros de solução E-G-T-A-H-B-S-S em um tubo de centrífuga imerso no banho-maria e use o E-G-T-A-H-B-S-S pré-aquecido para enxaguar o tubo flexível da bomba. Depois de sacrificar um camundongo CD um, de acordo com o protocolo de texto, raspe os pelos abdominais e use etanol a 70% para desinfetar a superfície abdominal.

Confirme a anestesia beliscando o dedo do pé. Corte a cavidade abdominal e exponha a veia porta e a veia cava inferior movendo o intestino lateralmente para a esquerda do abdômen. Ligue a bomba a uma velocidade de um a três mililitros por minuto com solução E-G-T-A-H-B-S-S e com uma agulha borboleta de calibre 23 canule a veia porta, prenda a seção canulada da veia porta e, em seguida, vire a pinça senoidal na superfície do abdômen do camundongo aberto.

O fígado deve ficar pálido nos primeiros 30 segundos de perfusão, incisar rapidamente a parte inferior da veia cava inferior para evitar o acúmulo de pressão excessiva no fígado e aumentar a taxa de fluxo gradualmente para sete mililitros por minuto durante o primeiro minuto de perfusão. Quando menos de cinco mililitros de solução E-G-T-A-H-B-S-S permanecem no tubo da centrífuga. Adicione 40 a 50 mililitros de colágeno por solução e, em seguida, aumente a taxa de fluxo gradualmente para 10 mililitros por minuto em 30 segundos.

Faça o fígado inchar usando uma pinça para aplicar pressão periodicamente na veia cava inferior por intervalos de 10 a 32. Isso melhorará a dissociação celular e reduzirá o tempo de perfusão com colagenase. Quando menos de 10 mililitros de solução de colagenase permanecerem dentro do tubo da centrífuga, adicione mais 40 a 50 mililitros de solução de colagenase pré-quente ao tubo.

Então, uma vez que 70 a 80 mililitros tenham sido perfundidos, use uma pinça para aplicar uma leve pressão na superfície. Uma marca de depressão indica que as células do fígado estão dissociadas. Remova o fígado da cavidade abdominal como uma peça e coloque-o em um tubo de centrífuga contendo 20 a 30 mililitros de copo para isolamento celular. Média.

Mantenha as células do fígado no gelo por até três horas e agrupe até três fígados para purificação para purificar as células. Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 mililitros de copo para isolamento celular, médio com tesoura ou pinça. Rompa a cápsula brilhante e libere todas as células do fígado no meio.

Filtrar a solução através de um filtro de células de 100 micrómetros para um tubo de centrifugação. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 50 GS a quatro graus Celsius por dois minutos. As células parenquimatosas estarão no pellet e as células não parenquimatosas estarão no sobrenadante.

Recolher o sobrenadante num tubo de centrifugação limpo e centrifugar a 50 gs durante dois minutos. Repita para um total de quatro transferências e rodadas. Próxima centrífuga.

O supernat a 1.350 GS por 15 minutos. Para pellet as células não parenquimatosas, descartar o supernat e ressuspender o pellet em 10 mililitros de copo para meio de isolamento celular, adicionar a solução de células não parenquimatosas ao gradiente isotônico descontínuo de 25 a 50% previamente preparado de acordo com o protocolo de texto e centrifugar a 850 GS por 15 minutos sem aceleração ou quebra. Usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, aspire cerca de 12 mililitros do copo enriquecido para a fração celular que parece turva dentro da fração 25% SIP próxima à interface 25 50% SIP.

Transfira as células para um tubo de centrífuga contendo 35 a 40 mililitros de copo para isolamento celular, médio e misture suavemente, em seguida, centrifugue a 1.350 GS e quatro graus Celsius para pellet as células, descarte o super nomeado e use cinco a 10 mililitros de meio pré-aquecido para ressuspender as células com um hemocitômetro. Conte as células e use a coloração azul trian para medir a placa de viabilidade. As células não parenquimatosas purificadas em placas de 24 poços a uma densidade de cinco vezes 10 elevado ao quinto de células por poço.

Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, remova suavemente o meio. Use HBSS pré-aquecido para lavar as células e substituí-lo por 500 microlitros por poço de copo pré-aquecido fresco para meio de cultura de células.

Retorne as células a 37 graus Celsius por pelo menos quatro horas para permitir que as células adiram antes do tratamento com partículas de nanopartículas. Após caracterizar a pureza e a atividade fagocítica do C para células e incubação com nanotubos de carbono funcionalizados ou fcts conforme descrito no protocolo de texto, descarte o sobrenadante e adicione 200 microlitros por poço de tampão de lise. Incube a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos, faça uma pipetagem vigorosa e colete o copo lido para células em tubos de microcentrífuga.

Em seguida, centrifugue a 20.000 GS por 10 minutos para retirar os fectos que foram absorvidos pelas células nos detritos celulares. Colete o sobrenadante em tubos de microcentrífuga e armazene-o a 20 graus Celsius negativos. Como alternativa, transfira 50 microlitros para uma placa de 96 poços e adicione um volume igual de solução de mistura de substrato do kit lactato desidrogenase.

Inclua triplicados de poços em branco contendo 50 microlitros de tampão de lise e 50 microlitros de solução de mistura de substrato. Em seguida, cubra a placa e incube em temperatura ambiente por 15 minutos antes de adicionar 50 microlitros de solução stop. Finalmente, leia a absorbância a 490 nanômetros em um leitor de microplacas e use a seguinte fórmula para calcular a porcentagem de viabilidade celular.

Esta figura ilustra que o número de células não parenquimatosas purificadas varia entre oito e 14 vezes 10 a seis células por camundongo e trian. A coloração azul demonstrou aproximadamente 95% de viabilidade celular. O copo aderente para células adotou uma forma redonda dentro de 30 minutos após a incubação e, após quatro horas, as células se espalharam e os aglomerados começaram a se formar, como visto aqui.

As células foram coradas com anticorpo F quatro 80 para demonstrar a pureza do copo para a célula, que foi medida acima de 95% por citometria de fluxo. Além disso, após 12 horas em cultura, a análise de baixa citometria mostrou que 85% das células eram capazes de atividade ácida de PHA por sua capacidade de absorver esferas fluorescentes de um micrômetro. No entanto, esse número caiu em 72 horas em cultura, quando apenas 40% das células eram fagocíticas mostradas aqui.

O copo para células incubadas com nanotubos de carbono funcionalizados por 24 e 72 horas apresentou morfologias semelhantes em comparação com células virgens. Em contraste, o copo para células incubadas com 10% de DMSO usado como controle positivo exibiu uma morfologia necrótica, após a análise do copo de ensaio LDH modificado para células tratadas com 10% de DMSO por 24 e 72 horas mostrou alta toxicidade em comparação, os FCTS induziram uma redução leve, mas significativa, na viabilidade celular apenas quando as células foram expostas a 50 microgramas por mililitro por 72 horas. Seguindo este método, outras SC baseadas em células e todos os tipos de nanopartículas podem ser testados usando células ke isoladas.

Isso permite que dados confiáveis sejam coletados, minimizando o uso de animais. Esperamos que esta técnica possa ajudar a abrir caminho para os pesquisadores no campo da psicologia da nanotecnologia rastrearem a segurança dos muitos transportadores nano promissores que estão sendo desenvolvidos cada vez mais.