Name: Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda o isolamento de células de Kupffer de camundongos para testes de toxicidade de nanopartículas. Este método utiliza perfusão hepática e centrifugação por densidade para obter alta pureza celular.

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Este trabalho foi apoiado pelo programa RADDEL da Rede Marie-Curie FP7-ITN da UE. MB e KAJ gostariam de agradecer a Joe Varguese e Rui Serra Maia por sua ajuda e sugestões ao longo da otimização do isolamento de células de Kupffer.

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as diretrizes e regulamentos relevantes e agências reguladoras. O protocolo que está sendo demonstrada foi realizada sob a orientação e aprovação do regulamento escritório UK Home 1. Perfusão e Cobrança celular (Figura 1) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> Figura 1:. Perfusão do fígado Após anestesia do rato, o tracto digestivo está deslocado lateralmente para a esquerda do abdómen de modo a tornar a veia porta (VP) acessível. O PV é canulada usando uma taxa de fluxo lento (1-3 mL / min) de solução de EGTA / HBSS e a veia veina inferior (IVC) é rompido imediatamente para evitar qualquer excesso de pressão dentro do fígado. Dentro da primeira hora de perfusão, a taxa de fluxo é aumentada gradualmente até 7 ml / min. A solução de colagenase é então perfundido a 10 ml / min, até que a sua digestão completa seja alcançada. <ol><li> Prepare recém todos os reagentes descritos na tabela de material. </li><li> Aquece-se a EGTA (etileno-glicol Tetra-ácido acético) / HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) de solução (50 ml por ratinho) e a solução de colagenase (100 ml por rato) durante 30 min a 40 ° C. </li><li> Lavar a bomba de tubo flexível primeiro com etanol 70%. Pour 40 ml de EGTA / solução de HBSS para um tubo de centrífuga imerso no banho de água e lavar a tubagem flexível com bomba de pré-aquecida de EGTA / solução de HBSS. </li><li> Realizar anestesia terminal usando um barbitúrico para produzir de forma confiável inconsciência antes que a depressão respiratória e morte. Injectar fenobarbitona a 1 mg / kg, ip num ratinho CD1 macho ou fêmea (35-45 g). Confirme a anestesia por beliscar dedo do pé. </li><li> Raspar os pêlos abdominais e esterilizar a superfície abdominal utilizando uma solução de etanol a 70%. </li><li> Cortar através da cavidade abdominal e expor a veia porta e veia cava inferior, movendo o intestino lateralmente para a esquerda do abdómen. </li><li> Estrelat a bomba a uma velocidade de 1-3 ml / min com solução de EGTA / HBSS e canular a veia portal usando uma agulha de borboleta de 23 g (asas corte). Prender a secção da veia porta canulada com a agulha 23 G e em seguida virar a pinça serrefine na superfície do abdómen aberto rato. O fígado deve rapidamente pálido nos primeiros 30 segundos de EGTA / Solução HBSS perfusão. </li><li> Rapidamente incisar a parte inferior da veia cava inferior para evitar a formação de excesso de pressão no fígado, e em seguida aumentar progressivamente o caudal de 7 ml / min, ao longo do primeiro minuto de perfusão. O animal morre devido a hemorragia secundária à da veia cava punção venosa. </li><li> Quando menos de 5 ml de EGTA / Solução HBSS é remanescente no tubo de centrífuga, encha-o com solução de colagenase (40-50 ml). Aumentar a taxa de fluxo gradualmente para 10 ml / min, ao longo de 30 seg. </li><li> Faça o swell fígado, aplicando pressão para a veia cava inferior, usando uma pinça, por 5-10 intervalos seg. This pode ser feito periodicamente (5-10 vezes durante a digestão). Este passo vai melhorar a dissociação das células do fígado e reduzir o tempo de perfusão com colagenase. </li><li> Quando menos do que 10 ml de solução de colagenase permanece dentro do tubo de centrifugação, derrame 40-50 mL de solução pré-aquecida de colagenase no tubo de centrífuga. </li><li> Após 10-15 min de perfusão e cerca de 70-80 ml de solução de colagenase perfundidos, aplicar uma pequena pressão sobre a superfície do fígado com uma pinça. Uma cópia da pressão indica que as células do fígado são dissociados. </li><li> Remover o fígado a partir da cavidade abdominal como uma só peça e colocá-lo em um tubo de centrífuga contendo 20-30 ml de células de Kupffer de isolamento médio. Mantenha as células do fígado em gelo ou a 4 ° C por um período máximo de 3 horas para evitar que afetam a viabilidade das células do fígado. </li><li> Repetir o procedimento de perfusão em vários animais, se necessário, ao mesmo tempo manter o fígado perfundido em gelo. Piscina 1-3 fígados para purificação e prosseguir com a fase 3. </li></ol> 2. Preparação do por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 2) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> Figura 2:. Preparação do gradiente de densidade Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. O SIP é preparado por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. A 5 ml de SIP são misturados com 15 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 25%. 10 ml de SIP são misturados com 10 ml de PBS para fazer uma solução SIP 20 ml de 50%. Um tubo de centrífuga contendo a solução de 50% de SIP (20 ml) é inclinada e a solução SIP 25% (20 ml) é adicionado lentamente, utilizando uma pipeta serológica 25 ml. <ol><li> Continue com as seguintes etapas (seção 2., 3. e 5.) sob condições estéreis e manter as células em gelo ou a 4 ° C. Prepara-se o SIP (Solução isotónica de partículas de sílica revestidas) por mistura de 15,3 ml de solução de partículas de sílica revestidas com 1,7 mL de 10 x PBS. </li&gt; <li> Para fazer 20 ml de solução SIP 25%, mistura 5 ml de SIP com 15 ml de PBS. Para fazer 20 ml de solução SIP 50%, mistura de 10 ml de SIP com 10 ml de PBS. </li><li> Encher um tubo de centrífuga com 20 ml de solução a 50% de SIP. Inclinar o tubo de centrifugação com um ângulo próximo de 90 ° e adiciona-se lentamente a solução SIP 25% (20 ml) na parede lateral do tubo utilizando uma pipeta de 25 ml serológico, sem tocar na superfície da camada de SIP 50%. Quando a adição da solução SIP 25%, reduzir progressivamente o ângulo do tubo. Manter o gradiente de densidade em gelo até à utilização. </li></ol> 3. Purificação de Kupffer celular (Figura 3) <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> Figura 3:. Purificação de Kupfer células por centrifugação em gradiente de densidade e adesão celular Todos os procedimentos são realizados sob condições estéreis. (A) após a ruptura da cápsula de Glisson, células do fígado são filtrados através de um 100 mm filtro. A suspensão é centrifugada a 50 x g para descartar hepatócitos (granulados) e recolher a fracção de células não-parenquimatosas (sobrenadante). Este passo é repetido três vezes. As células não-parenquimatosas são adicionadas no topo de um gradiente descontínuo isotónica e centrifugado a 800 xg durante 15 min. Células de Kupffer recolhidos a partir da almofada SIP 25% são purificados adicionalmente por selecção de adesão celular. (B) As células foram semeadas em placa de 24 poços e incubou-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 30 min. As células não aderentes são lavadas uma vez com 500 ul de HBSS. Células de Kupffer exibir a sua morfologia aderente 4 h após o plaqueamento, quando -CNTs f pode ser adicionado às células. A barra de escala representa 25 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li> Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 ml de Kupffer isolamento celular Médio. A ruptura da cápsula de Glisson (membrana do fígado), utilizando tesouras e libertar todas as células do fígado para o meio de isolamento de células de Kupffer. Filtrar a solução através de uma filtro de células 100 um a ser coletado em um tubo de centrífuga. Repita o procedimento de perfusão em fígados perfundidos adicionais e reunir as células no mesmo tubo de centrífuga (15 ml de um rato, até 45 ml de três ratos). </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 50 xg durante 2 min a 4 ° C. Células parenquimatosas (hepatócitos) será no sedimento e células não-parenquimatosas (incluindo células de Kupffer) será no sobrenadante. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante num tubo de centrífuga limpo e centrifuga-se a 50 x g durante 2 minutos cada. Repita este passo três vezes mais. </li><li> Centrifugar a 1.350 xg durante 15 min para sedimentar as células não-parenquimatosas. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de isolamento de células de Kupffer Médio. </li><li> Adicionar a solução de células não-parenquimatosas sobre o gradiente descontínuo isotónica 25/50%, tal como descrito em 2.3. Centavorifuge a 850 g durante 15 min sem aceleração ou pausa. </li><li> Localizar a fracção de célula de Kupffer enriquecido turvas na fracção SIP 25% nas proximidades da interface de SIP 25/50% (Figura 3). Utilizando uma pipeta de 10 mL serológico, aspirado de cerca de 12 ml da fracção de células enriquecida de Kupffer. Transferência de células para um tubo de centrífuga contendo 35-40 ml de isolamento de células de Kupffer meio. Misturar suavemente e centrifugar a 1350 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as células. </li><li> Descarte as células sobrenadante e ressuspender em 5-10 ml de pré-aquecido celular Kupffer Meio de Cultura. Contagem de células (hemocitï¿½etro) e medir a viabilidade utilizando a coloração azul de tripano. </li><li> Placa as células não-parenquimatosas purificados em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10 5 células / poço. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 3). Após 30 min, remover suavemente o meio, lava-se com pré-aquecido Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS), em seguida, uma vez substituircom 500 ul de fresco e pré-aqueceu-se Meio de Cultura celular de Kupffer (por poço). </li><li> Deixar as células de Kupffer durante pelo menos 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2 antes do tratamento com nanopartículas, para permitir que eles adquirem a sua morfologia aderente. </li></ol> 4. Caracterização <ol><li> As células Kupffer Pureza <ol><li> Preparar a solução de PBS / BSA fresca utilizada para manter a viabilidade das células de Kupffer. Lave as células uma vez com 500 ul de solução de PBS / BSA. Remover a solução de PBS / BSA e separar as células de Kupffer em 500 uL de solução de PBS / BSA fresco utilizando raspagem suave. Quando as células são plaqueadas em placas de 24 poços, encurtam as extremidades de lâminas de raspagem com uma tesoura para fazer a separação mais fácil de prosseguir. Transferência de células em tubos de citometria de fluxo. </li><li> Contagem de células de Kupffer, utilizando um hemocitómetro e centrifuga-se 1 x 10 5 células a 1350 x g. Ressuspender as células de Kupffer em 30 ul de F4 / 80 anticorpo (puro). Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Manter as células não coradas (não incubadas com o anticorpo) em gelo. </li><li> Adicionar 2 ml de solução de PBS / BSA em células coradas, centrifugar a 1350 g durante 5 min e desprezar o sobrenadante resultante. Ressuspender as células coradas em 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-1 canal. </li><li> Repita o procedimento para as células de Kupffer manchadas mantendo as mesmas configurações utilizadas para a análise de citometria de fluxo de células de Kupffer não coradas. Escolher e quantificar a fluorescência de células coradas para avaliar a pureza de célula de Kupffer. </li></ol></li><li> Kupffer células fagocíticas Atividade <ol><li> Substituir meios com 0,5% (v / v) de partículas fluorescentes de Kupffer em meio de cultura celular e incubar durante 4 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> A fim de remover os grânulos não-internalizados, centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, diScard o sobrenadante e ressuspender as células em 500 ul de PBS / BSA. Repita este passo mais 2 vezes. </li><li> Raspe células de Kupffer em 500 ul de células e de transferência de solução de PBS / BSA para um tubo de citometria de fluxo. </li><li> Centrifugar as células de Kupffer em 1350 xg, descartar as células sobrenadante e ressuspender em 200 ul de PBS / BSA. </li><li> Para análise de citometria de fluxo, porta 10.000 unstained células de Kupffer acordo com seu tamanho (dispersão para a frente) e granularidade (dispersão lateral). Analisar fluorescência de células fechadas na FL-2 canais. </li></ol></li></ol> 5. Incubação de Quimicamente nanotubos de carbono funcionalizados (f -CNTs) <ol><li> Prepara-se uma dispersão de -CNTs f (1 mg / ml) em água por sonicação durante 15 min antes da utilização. -CNTs F são preparados em casa 22. </li><li> Prepare 2x CNTs concentrados f- dispersão em Kupffer meio de cultura celular. CNT f- sonicate dispersos em meio para2 min antes de prosseguir com o passo 5.3). </li><li> Para cada bem, substituir 250 ï¿½ de meio de idade com 250 ul de 2x dispersão -CNTs f. Poços não tratados (250 ul de meio condicionado + 250 ul de células de Kupffer fresco meio de cultura) e os poços tratados com 10% de DMSO são utilizados como controlo negativo e positivo, respectivamente. </li><li> Incubar as células de Kupffer a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 ou 72 h. </li></ol> 6. Avaliação da Toxicidade -CNTs f em células de Kupffer pela lactato desidrogenase (LDH) Ensaio de modificação <ol><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar 200 uL (por poço da placa de 24 poços) de tampão de lise e incubar a 37 ° C durante 30 min-1 h. </li><li> Após a realização de pipetagem vigorosa, recolher lisadas células de Kupffer em tubos de microcentrifugação e centrifugar a 40000 xg durante 10 min para sedimentar -CNTs f que foram absorvidos pelas células e os restos celulares. </li><li> Recolher os sobrenadantes (ƒ-CNT livre) emmicrotubos e armazenar a -20 ° C ou vá para o passo 6.5). </li><li> Transferir 50 ul numa placa de 96 cavidades e adicionar um volume igual da solução de mistura de substrato (kit de LDH) a cada poço. Cobrir a placa e incubar a temperatura ambiente durante 15 min antes da adição de 50 ul da solução de paragem (kit de LDH). Adicionar triplicados de poços em branco, contendo 50 ul de tampão de lise, 50 ul de solução de mistura de substrato e 50 ul de solução de paragem. </li><li> Ler a absorvância a 490 nm num leitor de microplacas e utilizar a seguinte fórmula para calcular a (%) de viabilidade celular. </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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<li>Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver Kupffer cells.</a> Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os passos seguintes são fundamentais para alcançar alta produtividade e alta viabilidade das células de Kupffer. Condições assépticas devem ser usadas para limitar o risco de contaminação bacteriana e fúngica. Todos os instrumentos devem ser esterilizados antes da utilização. Os reagentes devem ser preparadas antes de realizar o procedimento de isolamento. A escolha de colagenase IV, com baixa atividade tríptico, é crucial. Lotes diferentes do mesmo fornecedor tem actividade enzimática difer...

O campo da pesquisa nanotoxicology tem como objetivo caracterizar o efeito biológico das nanopartículas. Estudos toxicológicos in vivo com base em investigações continuam a ser os métodos mais precisos. No entanto, seu uso é limitado pelo seu custo, trabalho e requisitos de tempo um. Como alternativas, em ensaios in vitro têm sido utilizados por causa da sua simplicidade e da possibilidade de desenvolvimento de alto rendimento em plataformas de ensaios in vitro, 2 - estendendo-se assim o número de condições testadas. A maioria dos estudos nanotoxicological são realizados utilizando ensaios in vitro com linhas de células imortalizadas. Contudo, existem preocupações em relação à extrapolação destes resultados experimentais in vivo para efeitos toxicológicos 3. Na verdade, as propriedades das linhas celulares imortalizadas pode ser significativamente diferentes dos tecidos que foram derivados a partir de, por exemplo, transformação genética 4, deterioração das características morfológicas principais5, perda da polaridade celular 6 e alterações funcionais, tais como a regulação de mediadores inflamatórios 7. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e estão em contacto directo com o sangue, forrando a parede de sinusóides do fígado. Como parte do sistema reticulo-endotelial (RES), estes macrófagos são responsáveis ​​para a captura de nanopartículas de circulação e, por conseguinte, constituir um modelo altamente adequado para estudar a toxicidade de nanopartículas. In vivo 8 9 e in vitro estudos de respostas inflamatórias associadas com as células de Kupffer expostos a nanopartículas ter sido publicado anteriormente. Células de Kupffer também foram envolvidos na patogênese de doenças do fígado, como a doença hepática alcoólica 10, 11 fibrose hepática ou hepatite viral 12. Foi relatado que células de Kupffer isolado fornecer indicações úteis para descrever os mecanismos celulares involved em perturbações do fígado 13,14. Vários métodos têm sido relatados para isolar e purificar as células de Kupffer. Isolamento das células pode resultar de dissociação mecânica ou enzimática 15. Digestão de colagenase mostra a vantagem de conservar a integridade funcional das células de Kupffer, enquanto conduzindo a elevada produção de células de Kupffer 16. Muitas abordagens experimentais, que variam em complexidade e custos, foram usados ​​para separar células de Kupffer de outras populações de células de fígado. Por exemplo, células de Kupffer pureza pode ser conseguida por imunoafinidade 17, electroforese de fluxo 18, 16 a adesão selectiva ou por técnicas de centrífugas 16, que seleccionam as células de acordo com o seu tamanho e densidade. Uma combinação destes métodos podem ser escolhidos para aumentar a pureza da população 16. Não há consenso sobre o método ideal para o isolamento de células Kupffer, uma vez que na maior parte depende das aplicações e equipmen disponíveist. No entanto, no caso dos ensaios de toxicidade de nanopartículas, a simplicidade e elevado rendimento da técnica associada com a preservação funcional das células de Kupffer parecia ser mais adequado para esta aplicação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método foi modificado a partir do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et al. 16 concebido para o isolamento de células de fígado de rato. A maioria dos estudos relatados e descrito o isolamento de células de Kupffer do fígado de ratos. Aqui, nós descrevemos um método para isolar as células de Kupffer do fígado de rato, com um rendimento elevado e pureza. A utilização de ratinhos reduz o custo experimento e permite o processamento de vários fígados para obter grandes quantidades de células de Kupffer para testes de toxicidade de nanopartículas. No protocolo seguinte, as células de Kupffer foram incubadas com os nanotubos de carbono funcionalizadas (f </em&gt; -CNTs). As propriedades físico-químicas únicas de nanotubos de carbono - ou seja, alta proporção de comprimento para diâmetro e grande área superficial, fez CNT candidatos interessantes como vectores para fins de terapia e de diagnóstico. No entanto, têm surgido preocupações quanto à toxicidade dos nanotubos de carbono 19, e o desenvolvimento de novos ensaios in vitro destina-se a aumentar a compreensão das CNT efeito biológico. Toxicidade em células de Kupffer é associada com uma falta de integridade estrutural da membrana celular. Isto é medido pela perda da enzima LDH do citoplasma da célula para o sobrenadante. O princípio deste método é, portanto, para remover qualquer LDH libertada e medir o que é deixado nas células 20. Isto é feito, de preferência a medição do LDH libertado no sobrenadante, pois a presença de nanotubos de carbono no sobrenadante interfere com o ensaio de 21. Propomos o uso deste eficaz meto Kupffer isolamento de células simples e de custod para isolar elevado número de células de Kupffer funcionais. Isto permite o rastreio de toxicidade de uma grande variedade de nanopartículas, num modelo relevante macrófagos primários.

<table><tbody><tr><td>Camundongos CD1 euthatal (pentobarbital sódico)</td> <td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Charles River&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>O peso do mouse deve variar de 35 a 45 g. Aconselhamos o uso de camundongos CD1 machos, pois seu peso aumenta rapidamente (por exemplo um camundongo CD1 macho de 7 semanas de idade excede 35 g de peso). Também é aconselhável entrar em contato com o fornecedor de animais com antecedência para providenciar a entrega de animais mais velhos. Alternativamente, os animais podem ser internos para atingir o peso desejado.</td></tr><tr><td>HBSS (Ca2+ e Mg2+ free, com bicarbonato)&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSS deve ser&nbsp; Ca2+ grátis.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sal tetrassódico de ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>E8145&nbsp; &nbsp;</td><td>O EDTA também pode ser usado, mas o EGTA tem a vantagem de quelar Ca2+ seletivamente.</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>15630-056&nbsp;</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV&nbsp;</td><td>Worthington&nbsp;</td><td>CSL-4&nbsp;</td><td>É aconselhável testar diferentes lotes de colagenase ou pelo menos mencionar ao fornecedor que o produto deve ser adequado para isolamento de células hepáticas&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; DMEM de baixa glicose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>D5523&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI (com piruvato de sódio e Glutamax)&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>12633-012</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Penicilina/Steptomicina&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>15140-122</td><td>Soro Fetal Bovino de 100 ml</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Primeiro link&nbsp; &nbsp;</td><td>60-00-850&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8154&nbsp;</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de partículas de sílica revestida (Percoll)</td><td>GE Healtcare&nbsp; &nbsp;</td><td>17-0891-02&nbsp;</td><td>O Percoll&reg; é muito estável e pode ser mantido por vários anos&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>10x Fosfato Tampolado Salino&nbsp; &nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp; &nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>de dimetilsulfóxido&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>D/4120/PB08&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit LDH (CytoTox 96)&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G1781&nbsp;</td><td>Mantenha-se protegido da luz</td></tr><tr><td>DMEM vermelho de fenol livre</td><td>Life Technologies&nbsp; &nbsp;</td><td>31053-028&nbsp;</td><td>500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo F4/80 (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>Não diluir, usado puro para citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Grânulos fluorescentes</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>Grânulos de látex, poliestireno modificado com amina, vermelho fluorescente. 1 ml</td></tr><tr><td>Nome do Material</td><td>Empresa&nbsp;</td><td>Número de catálogo&nbsp;</td><td>Comentários/Descrição&nbsp;</td></tr><tr><td>Conjunto de coleta de sangue de borboleta (tubo de 23 G/305 mm de comprimento)&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>367288</tr><tr><td>Filtros de Seringa (0,22 &mu; m Blue Rim)&nbsp;</td><td>Minisart&nbsp;</td><td>16534-K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga (50 ml Tampa Azul)&nbsp;</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>35 2070&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (90 x 15 mm)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>BSN 101VR20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Filtro de célula M&nbsp; &nbsp;</td><td>BD&nbsp; &nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica&nbsp;</td><td>Watson Marlow&nbsp;</td><td>SciQ 300&nbsp; &nbsp;</td><td>Enxágue o tubo antes e depois de cada uso com PBS estéril e etanol a 70%.</td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Corning&nbsp; &nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>placas de 96 poços&nbsp;</td><td>Corning&nbsp; &nbsp;</td><td>Centrífuga 3595</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine fórceps</td><td>Hammacher GmbH&nbsp;</td><td>Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051</td><td>A pinça serrefine permite pinçar o vaso canulado com a agulha 23 G sem a necessidade de segurar a pinça durante o procedimento de perfusão. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de citometria de fluxo</td><td>BD Biosciences, Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>Corte as extremidades da lâmina com uma tesoura para raspar as células em placas de 24 poços.</td></tr><tr><td>Nome da empresa de reagentes</td><td>&nbsp;</td><td>Número de catálogo&nbsp;</td><td>Comentários/Descrição&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Solução EGTA (Ácido Etilenoglicol Tetracético)/HBSS (Solução Salina Balanceada de Hank)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>HBSS contendo 0,5 mM EGTA e 25 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,4. Prepare 50 ml para cada fígado perfundir.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de colagenase</td><td></td><td></td><td>DMEM baixa glicose contendo colagenase tipo IV a 100 UI/ml, HEPES 15 mM e Penicllin/Estreptamicina a 1% (v/v). Ajuste o pH para 7,4. Prepare 100 ml para cada fígado perfundir. Após a adição da colagenase, é aconselhável aquecer a solução por 30 min antes do uso. Isso permite que a atividade da colagenase seja ótima.</td></tr><tr><td>Meio de Isolamento de Células Kupffer</td><td></td><td></td><td>RPMI contendo, 1% de Aminoácidos Não Essenciais (v/v), 1% de glutamax&reg; (v/v) e 1% de Penicllin/Estreptomicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Meio de Cultura de Células Kupffer</td><td></td><td></td><td>RPMI contendo 10% de Soro Fetal Bovino, 1% de Aminoácidos Não Essenciais (v/v), 1% de Glutamax&reg; (v/v) e 1% de Penicllin/Estreptamicina (v/v). Prepare pelo menos 100 ml para 1-3 fígados.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>SIP (solução de partículas de sílica revestidas isotônicas)</td><td></td><td></td> <td>Misture 1,7 ml de 10x Phosphate Buffered Saline com 15,3 ml de Percoll&reg; para obter 17mL de SIP.</td></tr><tr><td>Solução SIP a 25%</td><td></td><td></td><td>Misture 5 ml de SIP com 15 ml de 1x Solução salina tamponada com fosfato&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Solução SIP a 50%</td><td></td><td></td><td>Misture 10 ml de SIP com 10 ml de 1x Solução salina tamponada com fosfato&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> de Lise <td>DMEM com 0,9% de Solução</td></tr><tr><td></td><td></td> Triton X-100<td>PBS/BSA</td><td>Prepare solução salina tamponada com fosfato fresco pH 7,4 com 1% de albumina de soro bovino.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

kupffer isolamento celular para nanoparticle toxicity testing

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

A grande maioria dos estudos in vitro nanotoxicological usaram linhas celulares imortalizadas para a sua viabilidade. No entanto, os resultados de testes de toxicidade de nanopartículas em linhas de células imortalizadas ou células primárias têm mostrado discrepâncias, destacando a necessidade de estender o uso de pilhas para ensaios in vitro. Este protocolo descreve o isolamento de macrófagos de fígado de rato, células de Kupffer nomeados, e a sua utilização para estudar a toxicidade das nanopartículas. Células de Kupffer são a população de macrófagos mais abundante no corpo e fazem parte do sistema retículo endotelial (RES), responsável pela captura de nanopartículas de circulação. O método de isolamento de células de Kupffer relatado aqui baseia-se num método de perfusão 2-passo, seguido por purificação em gradiente de densidade. O método, baseado na digestão com colagenase e centrifugação de densidade, é uma adaptação do protocolo original desenvolvido por Smedsrød et ai. projetado para rato isolatio células do fígadon e proporciona um rendimento elevado (até 14 x 10 6 culas por ratinho) e de alta pureza (&gt; 95%) das células de Kupffer. Este método de isolamento não requer equipamento sofisticado e caro e, por conseguinte, representa um compromisso ideal entre a complexidade e de rendimento celular. A utilização de ratos mais pesados ​​(35-45 g) melhora o rendimento do método de isolamento, mas também facilita notavelmente o procedimento de canulação da veia porta. A toxicidade de nanotubos de carbono funcionalizadas f -CNTs foi medido neste modelo pelo ensaio de LDH modificado. Este método avalia a viabilidade das células medindo a falta de integridade estrutural da membrana da célula de Kupffer, após incubação com -CNTs f. Toxicidade induzida pelo -CNTs f pode ser medido de forma consistente com este ensaio, destacando que as células de Kupffer isoladas são úteis para testes de toxicidade das nanopartículas. A compreensão global do nanotoxicology poderiam se beneficiar de tais modelos, tornando a seleção de nanopartículas para tradução clínica mais eficient.

O número de células não-parenquimatosas purificadas foi consistente e variou entre 8 e 14 x 10 6 culas por rato (17 isolamentos foram realizadas). Cada isolamento do mouse foi suficiente para a chapa 16-28 poços. A viabilidade das células por coloração com azul de tripano demonstrou a viabilidade das células ~ 95%. Células de Kupffer mostrou uma forma redonda dentro de 30 min de incubação a 37 ° C, relacionada com a sua morfologia aderente incompleta (Figura 4A). Às 4 horas de incubação e, po...

Os macrófagos hepáticos, denominados células de Kupffer, são responsáveis pela captura de nanopartículas circulantes. Descrevemos aqui um método, de alta pureza e rendimento celular, para isolamento de células de Kupffer. O ensaio LDH modificado é usado aqui para medir a toxicidade induzida por nanotubos de carbono em células de Kupffer.

Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

O objetivo geral do experimento a seguir é isolar e purificar células cup para de camundongo em grande número para estudar a toxicidade de nanopartículas. Isso é alcançado pela perfusão dos fígados de camundongo com uma solução H-B-S-S-E-G-T-A e uma solução de colágeno para digerir suavemente o tecido hepático. Em seguida, as células hepáticas são purificadas por centrifugação em gradiente de densidade e adesão seletiva para obter uma cultura de células cup para purificadas.Em seguida, é realizada a análise por citometria de fluxo para confirmar a pureza e as propriedades ácidas F das células cup. São obtidos resultados que mostram que a toxicidade de nanotubos de carbono funcionalizados pode ser medida nas células cup. Com base no L-D-H-S-A modificado, suporta-se que este modelo possa ser aplicado aos testes de toxicidade de nanopartículas.O método que pretendemos mostrar a você hoje pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de nanotoxicologia, como a avaliação da toxicidade de vetores de medicamentos recentemente desenvolvidos; isso é bastante importante, pois a maioria das linhagens celulares imortalizadas utilizadas apresenta propriedades significativamente diferentes dos tecidos dos quais foram derivadas. Uma demonstração visual deste método é essencial. Se o método for realizado com sucesso, resultará na obtenção de um alto rendimento e pureza de células ke, que então poderão ser usadas como modelo para triagem de uma variedade de nanopartículas quanto à sua toxicidade.Após preparar recentemente todos os reagentes listados na tabela de materiais e reagentes encontrada no protocolo textual acompanhante, aqueça a solução E-G-T-A-H-B-S-S e a solução de colagenase a 40 graus Celsius por 30 minutos, use etanol 70% para enxaguar o tubo flexível da bomba. Em seguida, despeje 40 mililitros da solução E-G-T-A-H-B-S-S em um tubo de centrífuga imerso no banho-maria e use a solução E-G-T-A-H-B-S-S pré-aquecida para enxaguar o tubo flexível da bomba. Após eutanasiar um camundongo CD1, de acordo com o protocolo textual, rape os pelos abdominais e use etanol 70% para desinfetar a superfície abdominal.Confirme a anestesia com uma pinça no dedo do pé. Corte através da cavidade abdominal e exponha a veia porta e a veia cava inferior movendo o intestino lateralmente para o lado esquerdo do abdômen. Inicie a bomba em uma velocidade de um a três mililitros por minuto com solução E-G-T-A-H-B-S-S e, com uma agulha tipo borboleta de calibre 23, canule a veia porta, prenda o segmento canulado da veia porta e, em seguida, vire a pinça de força senoidal na superfície do abdômen aberto do camundongo.O fígado deve ficar pálido nos primeiros 30 segundos de perfusão; imediatamente faça um corte na parte inferior da veia cava inferior para evitar o acúmulo excessivo de pressão no fígado e aumente gradualmente a taxa de fluxo para sete mililitros por minuto durante o primeiro minuto de perfusão. Quando restarem menos de cinco mililitros da solução E-G-T-A-H-B-S-S no tubo de centrífuga, adicione 40 a 50 mililitros de solução de colagenase e, em seguida, aumente gradualmente a taxa de fluxo para 10 mililitros por minuto ao longo de 30 segundos.Faça o fígado inchar usando pin&ccedil;as para aplicar periodicamente press&atilde;o &agrave; veia cava inferior em intervalos de 10 a 32 segundos. Isso melhorar&aacute; a dissocia&ccedil;&atilde;o celular e reduzir&aacute; o tempo de perfus&atilde;o com colagenase. Quando restarem menos de 10 mililitros de solu&ccedil;&atilde;o de colagenase no tubo de centr&iacute;fuga, adicione mais 40 a 50 mililitros de solu&ccedil;&atilde;o de colagenase pr&eacute;-aquecida ao tubo.Em seguida, quando 70 a 80 mililitros tiverem sido perfundidos, use uma pinça para aplicar leve pressão sobre a superfície. Uma marca de depressão indica que as células hepáticas estão dissociadas. Remova o fígado da cavidade abdominal em uma única peça e coloque-o em um tubo de centrífuga contendo 20 a 30 mililitros de meio para isolamento de células.Mantenha as células hepáticas em gelo por até três horas e reúna até três fígados para purificação, a fim de obter o meio para células. Coloque um fígado perfundido em uma placa de Petri com 15 mililitros do meio para isolamento de células, utilizando tesoura ou pinça. Rupture a cápsula brilhante e libere todas as células hepáticas no meio.Filtre a solução através de uma peneira celular de 100 micrômetros em um tubo de centrífuga. Em seguida, centrifugue a suspensão celular a 50 G a quatro graus Celsius por dois minutos. As células parenquimatosas estarão no pellet e as células não parenquimatosas estarão no sobrenadante.Colete o sobrenatante em um tubo de centrífuga limpo e centrifugue a 50 ×g por dois minutos. Repita por um total de quatro transferências e centrifugações. Próxima centrifugação.O sobrenadante a 1.350 ×g durante 15 minutos. Para obter o pellet das células não parenquimatosas, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de isolamento de células cup, adicione a solução de células não parenquimatosas ao gradiente isotônico descontínuo 25-50% previamente preparado de acordo com o protocolo descrito no texto e centrifugue a 850 ×g durante 15 minutos sem aceleração ou freio. Usando uma pipeta serológica de 10 mililitros, aspire cerca de 12 mililitros da fração enriquecida de células cup, que aparece turva dentro da fração 25% SIP, próxima à interface 25-50% SIP.Transfira as células para um tubo de centrífuga contendo 35 a 40 mililitros de meio para isolamento celular e misture suavemente. Em seguida, centrifugue a 1.350 ×g e 4 °C para obter o pellet celular. Descarte o sobrenadante e use 5 a 10 mililitros de meio pré-aquecido para ressuspender as células com um hemocitômetro. Conte as células e use coloração com azul de tripano para medir a viabilidade. Plaque as células não parenquimatosas purificadas em placas de 24 poços numa densidade de 5 × 10⁵ células por poço.Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, remova suavemente o meio. Utilize HBSS pré-aquecido para lavar as células e substitua por 500 microlitros por poço de meio de cultura celular fresco, pré-aquecido.Retorne as células a 37 graus Celsius por pelo menos quatro horas para permitir que as células adiram antes do tratamento com partículas de nanopartículas. Após caracterizar a pureza e a atividade fagocítica das células C e o período de incubação com nanotubos de carbono funcionalizados ou FCTs conforme descrito no protocolo do texto, descarte o sobrenadante e adicione 200 microlitros por poço de tampão de lise. Incube a 37 graus Celsius por 30 a 60 minutos, realize pipetagem vigorosa e colete o sobrenadante liseado das células C em tubos de microcentrífuga.Em seguida, centrifugue a 20.000 ×g por 10 minutos para separar as FCNs que foram incorporadas pelas células no resíduo celular. Colete o sobrenadante em tubos de microcentrífuga e armazene a -20 graus Celsius. Alternativamente, transfira 50 microlitros para uma placa de 96 poços e adicione um volume igual de solução de mistura de substrato do kit de lactato desidrogenase.Inclua três replicatas de poços em branco contendo 50 microlitros de tampão de lise e 50 microlitros de solução de substrato. Em seguida, cubra a placa e incube à temperatura ambiente por 15 minutos antes de adicionar 50 microlitros de solução finalizadora. Por fim, leia a absorbância a 490 nanômetros em um leitor de microplacas e utilize a seguinte fórmula para calcular a porcentagem de viabilidade celular.Esta figura ilustra que o número de células não parenquimatosas purificadas varia entre oito e 14 vezes 10 elevado a seis células por camundongo e trian. A coloração azul demonstrou viabilidade celular de aproximadamente 95%. As células aderidas assumiram formato arredondado dentro de 30 minutos de incubação e, após quatro horas, as células se espalharam e começaram a formar aglomerados, como visto aqui.As células foram coradas com anticorpo F four 80 para demonstrar a pureza das células, que foi medida acima de 95% por citometria de fluxo. Além disso, após 12 horas em cultura, a análise por citometria de fluxo mostrou que 85% das células eram capazes de atividade fagocítica ácida por meio da capacidade de internalizar microesferas fluorescentes de um micrômetro. No entanto, esse número caiu após 72 horas em cultura, quando apenas 40% das células eram fagocíticas, conforme mostrado aqui.Cápsula para células incubadas com nanotubos de carbono funcionalizados por 24 e 72 horas apresentou morfologias semelhantes em comparação com células ingênuas. Em contraste, a cápsula para células incubadas com 10% DMSO utilizadas como controle positivo exibiu uma morfologia necrótica após a análise do ensaio modificado de LDH; a cápsula para células tratadas com 10% DMSO por 24 e 72 horas mostrou alta toxicidade em comparação. Os fcts induziram redução leve, mas significativa, na viabilidade celular apenas quando as células foram expostas a 50 microgramas por mililitro por 72 horas. Após este método, outros SC baseados em células e todos os tipos de nanopartículas podem ser testados utilizando células ke isoladas.Isso permite a coleta de dados confiáveis enquanto se minimiza o uso de animais. Esperamos que esta técnica possa ajudar a abrir caminho para pesquisadores na área de psicologia da nanotecnologia no rastreamento da segurança dos muitos nanocarreadores promissores que estão sendo cada vez mais desenvolvidos.

kupffer-cell-isolation-for-nanoparticle-toxicity-testing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um novo método para obter macrófagos de cultura primária de células de fígado de rato é descrito. Este método utiliza a proliferação de macrófagos na cultura, seguido por agitação de frascos de cultura e purificação pelo apego seletivo para pratos de plástico. Esta técnica proporciona eficiente macrófagos do fígado, sem equipamentos complexos e habilidades.

Um método simples e eficiente para isolar Macrófagos de Mixed culturas primárias de células do fígado Adulto

Descrevemos os protocolos para a colheita murinos macrófagos alveolares, que são residentes as células imunes inatas no pulmão, e examinando a sua ativação em resposta a co-cultura com nanopartículas polianidrido.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células de Kupffer ou macrófagos hepáticos do fígado de camundongo. O fígado é perfundido com uma solução de digestão seguida de separação por gradiente de densidade. As células de Kupffer aderentes isoladas podem ser usadas para análises posteriores.

Isolamento e cultura de células de Kupffer de camundongo

Este vídeo demonstra o isolamento de linfócitos, incluindo células natural killer ou células NK, do tecido hepático humano para expansão seletiva. A digestão enzimática e mecânica, seguida de separação por gradiente de densidade, promove o isolamento de linfócitos, incluindo células NK. Os linfócitos coletados podem ser usados para a expansão seletiva das células NK.

Isolamento de células assassinas naturais do tecido hepático para expansão seletiva

Análise da interação de nanopartículas com subpopulações definidas de células do sistema imunológico, por citometria de fluxo.

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

A água de sangria de produção (PBW) foi tratada com nanopartículas de óxido cúprico (CuO-NPs) e a toxicidade celular foi avaliada em células humanas cultivadas. O objetivo deste protocolo foi integrar a amostra ambiental nativa em um formato de cultura de células avaliando as mudanças na toxicidade devido ao tratamento com CuO-NP.

A remoção do Trace Elements por Óxido de Cupric nanopartículas de urânio<em&gt; In Situ</em&gt; Recuperação sangro água e seu efeito na viabilidade celular

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Microglia (células imunes do cérebro), são usadas como um biossensor substituto para determinar como as nanopartículas influenciam a neurotoxicidade. Descrevemos uma série de experimentos projetados para testar a resposta microglial a nanopartículas e a exposição de neurônios hipotalâmicos ao sobrenadante da micróglia ativada para determinar a neurotoxicidade.

Microglia como um Biosensor Surrogate determinar nanopartículas neurotoxicidade

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

Modelos avançados de fígado 3D para testes de genotoxicidade in vitro após exposição nanomaterial de longo prazo

Este artigo tem como objetivo fornecer um protocolo para o isolamento e cultura de fibroblastos primários associados ao câncer a partir de um modelo de murina síngênica de câncer de mama triplo-negativo e sua aplicação para o estudo pré-clínico de novas nanopartículas projetadas para atingir o microambiente tumoral.

Isolamento de fibroblastos associados ao câncer primário de um modelo de murina síndica do câncer de mama para o estudo de nanopartículas-alvo

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Aprenda o isolamento de células de Kupffer de camundongos para testes de toxicidade de nanopartículas. Este método utiliza perfusão hepática e centrifugação por densidade para obter alta pureza celular.

Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

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