Name: Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a analisar o movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide ex vivo em camundongos usando microscopia DIC. Este método permite categorizar e quantificar padrões de motilidade ciliar para estudos de biologia celular e desenvolvimento.

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Este trabalho foi apoiado por um Projeto para Universidades Privadas: subsídio de fundo correspondente do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT) do Japão (T.I.) e Grants-in-Aid for Scientific Research (C) do MEXT (S.T. e K.N).

Os protocolos e uso de animais de laboratório foram aprovados pelos cuidados com os animais e uso comitês institucionais da Universidade de Yamanashi e Universidade de Waseda. Cuidados com os animais foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais. 1. Preparação CPEC <ol><li> Preparar os seguintes aparelhos e materiais: um microscópio estéreo, de um modo preferido capaz de transmitir luz a partir do fundo; um par de fórceps Dumont relojoeiro (# 3 ou # 4), esterilizada por chama, tesouras operacionais em linha reta, esterilizada por chama; dois pratos de 10 centímetros de plástico estéreis contendo 20 ml de gelo-frio Leibovitz L-15 de forma; Pratos com fundo de vidro 35 milímetros contendo 2 ml RT Leibovitz meio L-15; Num copo de 100 ml contendo 70% de etanol; filhotes de rato recém-nascidos. </li><li> Resumidamente mergulhe um rato neonatal em 70% de etanol e eutanásia rapidamente por decapitação usando a tesoura operacionais. </li><li> Coloque a cabeça imediatamente em gelo frio Leibovitz L-15, na forma estéril 10 centímetros dish. </li><li> Remover a pele dos calvária usando o par de pinças de relojoeiro, abriu o crânio para expor o cérebro, e depois cortar os nervos cranianos para isolar todo o cérebro. </li><li> Transferir o cérebro para uma nova placa contendo gelada Leibovitz L-15 médio e observar ao microscópio estéreo, certificando-se que o cérebro está completamente imerso no meio. </li><li> Defina o aspecto dorsal do cérebro voltado para cima, e orientar o cérebro para que os bulbos olfatórios residir na posição de três horas (para pessoas destras). Segure o cérebro suavemente com a pinça na mão esquerda. </li><li> Usando a pinça de dissecação fina (Dumont # 3 ou # 4) na mão direita, corte do corpo caloso e debaixo do parênquima conectando os hemisférios cerebrais, ao longo da fissura longitudinal do cérebro. </li><li> Com cuidado, empurre os hemisférios cerebrais longe para os lados laterais e expor a fissura transversa do cérebro. </li><li> Separe os hemisférios por beliscar fora the parênquima entre o hemisfério e tálamo. </li><li> Retire cuidadosamente o plexo coróide ventriculares laterais que é anexado para o lado lateral do hipocampo pelo Affixa lâmina. </li><li> Transferir o plexo coróide isoladas para o prato fundo de vidro 35 milímetros contendo fresco Leibovitz meio L-15, e sobrepor o peso máximo (Lista de Materiais) com cuidado para segurar o tecido no lugar. </li></ol> 2. Imagens ao vivo da CPEC Cilia <ol><li> Confirmar ultravioleta adequada (UV) e filtro (s) inferida (IR) de corte para bloquear luz inferior a 400 nm e acima de 700 nm, e que a densidade neutro (ND) os filtros (25% e 6%), são inseridos no caminho da luz do microscópio invertido. </li><li> Ajuste o foco da lente objetiva aproximadamente por olho, e então ajustar o condensador de modo que o centro e foco para estar de acordo com a iluminação Köhler. Inserir um contraste de interferência diferencial adequado (DIC) prisma, um elemento DIC, bem como elementos do analisador e polarizador na licaminho lutar para estar de acordo com a ótica DIC. </li><li> Ajustar o contraste de vista pela posição do prisma DIC modo que a estrutura da superfície do tecido é mais reconhecível. Se todos os cílios das células alvo são móveis, uma visão clara dos cílios móveis não podem ser obtidos por olho por causa do seu movimento. </li><li> Altere o caminho de luz para a câmera de vídeo e remova os filtros ND para aumentar o poder de luz. </li><li> Use a câmera no modo de focagem para ajustar o campo de visão e foco. Durante focagem, em que as imagens de vídeo são exibidas em tempo real no monitor, uma visão clara dos cílios móveis não está disponível. </li><li> Use a câmera em 200 Hz com um tempo de exposição de 0,1 ms para o período desejado (segundos a minutos). Após a aquisição da pilha de imagens, quadros únicos irá exibir estruturas ciliares claras. Se bordas ciliares são borradas, aumentar a taxa de quadros ou use um tempo de exposição mais curto. </li><li> Grave o movimento de CPEC cílios dentro de 25-60 minutos após a eutanásia em LeibovitzMeio L-15. </li></ol> 3. Análise do Movimento ciliar <ol><li> Controlar manualmente batendo padrões de cada cílio no monitor do computador. Marcar posições de ponta ciliar em cada quadro com o ponteiro do mouse, que são montados para informação trajetória de cada cílio. Ou analisar a informação trajetória utilizando o mesmo software ou exportar para outras aplicações mais gerais para uma análise mais aprofundada. A eficiência deste passo de análise é descrito na discussão. </li><li> Classifique as trajetórias em dois modos de movimento, volta-e-vem de rotação, ou por olho. </li><li> Calcula-se a frequência de batimento ciliar (CBF), utilizando a seguinte fórmula: [CBF = (número de quadros por segundo) / (número médio de imagens para um único batimento)] 14, que pode ser obtido a partir de um diagrama de ponta movimento ciliar (Figura 3 ). Repetir este cálculo para múltiplos ciclos de batimento ciliar, porque outra cílios na mesma célula pode interferir com o movimento de cada cilium, resultando em irregularidade. </li><li> Para analisar a uniformidade angular do batimento ciliar eixos dentro de uma única célula, definem o ângulo θ batida para cada trajectória (Figura 4). Para trajetórias de vai-e-vem, se encaixam as posições da ponta dos cílios para uma linha reta, e definir θ como o ângulo da linha faz com eixo x. Para trajectórias de rotação, encaixam as posições de uma elipse, e definir θ como o ângulo do eixo maior da elipse faz com eixo x. Detalhes da instalação são descritos na secção de resultados representativos. </li><li> Para obter uma descrição quantitativa de cada trajetória, calcular generalizada proporção AR. Resumidamente, rodar a trajectória por - θ e definir AR como a relação entre as larguras da distribuição ao longo - x e y -axes (Figura 4B). Detalhes são mostrados na seção Resultados Representante, ea interpretação, Significado ea limitação do parâmetro são descritos na discussão. </li></ol> 4. Preparação de Amostras para SEM Nota: SEM é um importante método para avaliar o estado dos cílios em CPECs de uma forma abrangente. Para preparar as amostras para SEM, um procedimento padrão reportada anteriormente 15 é empregue com ligeiras modificações. <ol><li> Antes de dissecação do tecido a partir do cérebro, preparar o fixador em um frasco de vidro de 5 ml com uma tampa de polietileno. O fixador é constituído por 2% de paraformaldeído, glutaraldeído a 2,5% (metade da solução de Karnovsky 16) em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4. </li><li> Dissecar o tecido do cérebro, tal como descrito no passo 1. </li><li> Resumidamente enxaguar o tecido isolado com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) numa nova placa e, em seguida, fixar o tecido no fixador no frasco de vidro, durante 1 h à temperatura ambiente. Use pipetas de transferência descartáveis ​​e manipular os espécimes gently. Depois de enxaguar em HBSS, o tecido torna-se pegajosa. <ol><li> Para transferir as amostras para a solução fixadora, lentamente expulsar uma pequena quantidade de solução que continha o tecido a partir da pipeta de transferência como uma gota e adicionar ao fixador. </li></ol></li><li> Após a fixação, descartar o fixador e lavar o tecido com tampão fosfato de três vezes. </li><li> Mergulha-se o tecido numa solução de sacarose a 10% para lavar os aldeídos restantes. Para assegurar a eliminação total de aldeídos, imergir as amostras na solução durante 10 min e, em seguida, repetir duas vezes com sacarose a 10% fresco. Este passo é importante para garantir a boa pós-fixação em etapas subseqüentes. </li><li> Mergulha-se o tecido numa solução de 1% de tetróxido de ósmio em tampão de fosfato durante 30 min e, em seguida, colocar em gelo para pós-fixação. Julgar o grau de osmification pela cor da amostra: quando os aldeídos são completamente removidas, a amostra é preto. </li><li> Lave as amostras pós-fixadas de tecido extensivamente com duplo Distilled água várias vezes. </li><li> Desidratar as amostras por imersão em concentrações graduadas de etanol, geralmente 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, e 100%, durante 10 min cada. Obtenção de etanol anidro, colocando peneiras moleculares em etanol 99,5% de uma garrafa recém-adquirido. Repita desidratação com etanol anidro três vezes. </li><li> Coloque as amostras desidratadas em acetato de isoamilo, um reagente para a substituição ponto crítico de secagem, durante 10 min. Repita esta etapa duas vezes. Este reagente e evapora-se rapidamente a amostra pode tornar-se seca, resultando na destruição pela tensão superficial. Portanto, não secar a amostra completamente. </li><li> Após a última troca de acetato de isoamilo, remover a maior parte do solvente, imediatamente embrulhar o frasco de vidro aberta com uma folha de alumínio e coloque o frasco em gelo seco. Utilizando uma agulha ou uma pinça fina, fazer vários orifícios na folha que cobre a boca do frasco, de modo que o dióxido de carbono líquido flui facilmente para dentro do frasco no secador de ponto crítico. Prossiga para a próxima etapao mais rápido possível. </li><li> Nesta etapa, minimizar a transição de acetato de isoamilo na câmara do secador, mas não deixe que a amostra secar completamente antes de secar ponto crítico. Além disso, não deixe a amostra em gelo seco para um desnecessariamente muito tempo para evitar a formação de geada no frasco. </li><li> Transferir os frascos de vidro envolto com folha de alumínio contendo as amostras de tecido em secador de ponto crítico a que assegura a estrutura da superfície do tecido permanece intacta, enquanto a remoção da água contida no tecido. Informações pormenorizadas sobre a operação do secador de ponto crítico pode ser obtido a partir de instruções do fabricante. </li><li> Lidar com as amostras cuidadosamente usando um palito para minimizar danos mecânicos. As amostras de tecidos secos resultantes são frágeis. Monte as amostras em bases metálicas e revestimento com ouro-paládio usando uma pulverização catódica de íons. </li></ol> 5. Observação por SEM <ol><li> Observe por SEM e gravar imagens com uma câmera digitalequipado com microscópio eletrônico de varredura. </li><li> Transferir os dados de imagem digitais para um PC para análise. </li></ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
<li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li>
<li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+cilia+go+bad%3A+cilia+defects+and+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li>
<li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+vertebrate+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li>
<li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li>
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<li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li>
<li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+vertebrate+cilia%2C+towards+a+new+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li>
<li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li>
<li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+ciliary%2Fflagellar+beating+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li>
<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A%3A+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-%2F-+mice+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este trabalho tem como objetivo relatar metodologia detalhada para observar a motilidade ciliar em tecidos isolados do plexo coróide. Novidades científicas têm sido relatados em estudos anteriores 1,8.

Perspectivas deste método Embora a técnica aqui descrita não proporciona uma análise mais detalhada dos cílios do que os métodos previamente publicados, o significado desta técnica reside na simplicidade do sistema e relação custo-eficácia, que pode ser facilmente aplicado a qualquer tipo de rastreio de motilidade ciliar ex vivo. Em particular, TI Workbench fornece uma interface simples e fácil de usar que permite aos pesquisadores observar e analisar a motilidade ciliar mais facilm...

Os cílios são projeções semelhantes a pêlos na superfície da maioria das células vertebradas, que têm atraído a atenção de pesquisadores médicos por causa de uma classe de doenças denominadas ciliopatias2–4. Apesar da expressão ubíqua da organela, uma ampla variedade de funções ciliares tem sido relatada, incluindo motilidade e biossensoriamento. Por exemplo, cílios móveis na superfície mucoepitelial transportam muco5 e detritos epiteliais para a saída dos tratos, prevenindo doenças ao limpar a superfície do epitélio. Além disso, durante os primeiros períodos de desenvolvimento e estágios embrionários, os cílios regulam a proliferação de células-tronco6 e estão envolvidos na determinação da assimetria esquerda-direita do corpo dos vertebrados7. 
As células epiteliais do plexo coróide (CPECs) são derivadas de células neuroepiteliais que cobrem a superfície do tecido do plexo coróide no cérebro, que desempenham papéis importantes na manutenção da homeostase do ambiente intracraniano pela produção de líquido cefalorraquidiano (LCR). Foi demonstrado anteriormente que os CPECs têm vários cílios imóveis que regulam a produção de LCR por meio de receptores acoplados à proteína G que estão especificamente concentrados nos cílios8. Embora esses cílios tenham sido considerados cílios imóveis quiescentes, descobriu-se que alguns cílios CPEC exibem motilidade transitória durante o período neonatal1. Esse achado foi muito importante porque revelou que os chamados cílios imóveis não são necessariamente imóveis desde o início do desenvolvimento e podem exibir motilidade transitória durante janelas de tempo específicas, possivelmente em resposta a demandas e funções fisiológicas específicas9. Para descrever com precisão a natureza móvel dos cílios CPEC, é necessário desenvolver um sistema de observação ex vivo que englobe a análise dos perfis cinéticos exclusivos dos cílios CPEC. 
Com relação à motilidade, embora vários relatórios técnicos tenham descrito observações dos cílios móveis do epitélio traqueal5,10, flagelos móveis de célula única11, os chamados cílios móveis convencionais12 e cílios nodais13, métodos analíticos detalhados aplicáveis a estruturas relativamente onduladas, como o plexo coróide, não foram bem documentados até o momento. Além disso, é necessária uma alta resolução de tempo para analisar o movimento ciliar dos CPECs, nos quais câmeras caras de alta velocidade são indispensáveis. Para contornar essa necessidade e simplificar o monitoramento da motilidade ciliar de vários tipos de células, uma câmera de baixo custo e alta velocidade foi introduzida, e um método facilmente acessível e conveniente para registrar a motilidade dos cílios móveis, especialmente para descrever a velocidade e o padrão de movimento de cada cílio, foi desenvolvido1. Além disso, o software de análise de imagem original "TI Workbench" foi usado aqui para facilitar a análise detalhada da motilidade. Coletivamente, este método fornece uma nova estratégia concisa para analisar o movimento ciliar em conjunto com a microscopia eletrônica de varredura correlativa (MEV), que pode ser adotada em uma ampla gama de pesquisas sobre cílio.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagentes necessários</td></tr><tr><td colspan="4">para imagens de células vivas</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">para preparação de MEM</td></tr><tr><td>etanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeído&nbsp;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>acetato de isoamila</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>Peneiras Moleculares 4A 1/8&nbsp;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td> para preparação de tampão fosfato <td>de etanol anidro</td></tr><tr><td>salina (PBS)</td><td>Tampão de fosfato Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>, 0.1 M</td><td></td><td></td><td>Para fazer 100 ml, misture 19.0 ml de 0.1&nbsp; M NaH2PO4 e 81,0 ml de 0,1&nbsp; M Na2HPO4</td></tr><tr><td>fosfato monossódico (di-hidratado)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>fosfato dissódico (anidro)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>tetróxido de ósmio</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>gelo</td><td></td><td></td><td></td> seco</tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Ferramentas e materiais para dissecação</td></tr><tr><td colspan="4">para imagens ao vivo e preparação para SEM</td></tr><tr><td>microscópio estéreo</td><td>Toalha</td><td></td> de papel plana Olympus SZX7<td></td></tr>&<tr><td></td>Phi;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Prato</td><td></td><td></td><td></td>de plástico</tr><tr><td>de 10 cm 100 ml copo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tesoura de operação reta</td><td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td>pinça de relojoeiro</td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 ou -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">para imagens de células vivas</forte></td></tr><tr><td>prato de fundo de vidro</td><td>Matsunami Glass</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><forte>para preparação de MEM</</td></tr><tr><td>folha</td><td></td><td></td><td></td></tr> de alumínio>forte <tr><td>frasco de vidro de 5 ml com tampa de polietileno</td><td>Pipeta de transferência Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td><td>para</td></tr><tr><td>palito</td><td></td><td></td> de transferência de amostra para <td></td></tr><tr><td>pulverização catódica de íons de transferência de amostra com ouro-paládio</td><td>Hitachi</td><td>E-1030</td><td></td></tr><tr><td>secador de ponto crítico</td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[cabeçalho]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipamentos e materiais microscópicos</td></tr><tr><td colspan="4">para imagens de células vivas</microscópio forte></td></tr><tr><td>invertido</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Caixa de mercúrio de 100 W e fonte de alimentação</td><td>Olympus</td><td>U-ULH e BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de mercúrio de 100 W</td><td>Condensador Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>DIC, n.a. 0,55</td> Obturador elétrico <td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 e obturador manual VMM-D1</td><td>podem ser usados.</td></tr><tr><td>filtro passa-banda (400-700&nbsp; nm, &Phi; 45&nbsp; mm)</td> <td>Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ND (&Phi; 45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>combinação de filtros ND de 25% e 6% são usados</td></tr><tr><td>lente objetiva (imersão em água) com elemento DIC</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 com câmera de vídeo de alta velocidade IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805; Taxa de quadros de 200 Hz e tempo de exposição de 1 ms</td></tr><tr><td>Software de aquisição / análise de imagem</td><td>Software interno</td><td>TI Workbench</td><td>capaz de aquisição em altas taxas de quadros.</td></tr><tr><td>PC para controle / análise</td><td>de</td> câmera Mesa de isolamento de vibração Apple <td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>peso para tecido</td><td>Warner Instruments</td><td>kits de ancoragem de fatia</td><td>Pode ser feito com malha de nylon colada a um U em forma de U esmagado &Phi; 0,5&nbsp; mm fio de platina.</td></tr><tr><td>vidro de cobertura (peso alternativo para tecido)</td><td>Matsunami</td><td>feito sob encomenda</td><td>Um vidro de cobertura pode ser usado como peso de tecido.</td></tr><tr><td colspan="4">para SEM</td></tr><tr><td>inverted microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>microscópio eletrônico de varredura</td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; ex vivo</em

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

O plexo coróide está localizado na parede ventricular do cérebro, cuja principal função é a produção de líquido cefalorraquidiano. As células epiteliais do plexo coróide (CPECs) que cobrem a superfície do tecido do plexo coróide abrigam vários cílios únicos, mas a maioria das funções desses cílios ainda precisa ser investigada. Para descobrir a função dos cílios CPEC com referência particular à sua motilidade, um sistema de observação ex vivo foi desenvolvido para monitorar a motilidade ciliar durante os períodos embrionário, perinatal e pós-natal. O plexo coróide foi dissecado do ventrículo cerebral e observado em microscópio de contraste aprimorado por vídeo, equipado com óptica de contraste de interferência diferencial. Sob esta condição, um método simples e quantitativo foi desenvolvido para analisar os perfis móveis dos cílios CPEC por várias horas ex vivo. Em seguida, as alterações morfológicas dos cílios durante o desenvolvimento foram observadas por microscopia eletrônica de varredura para elucidar a relação entre a maturidade morfológica dos cílios e a motilidade. Curiosamente, este método pode delinear mudanças no número e comprimento dos cílios, que atingiram o pico no dia pós-natal (P) 2, enquanto a frequência de batimentos atingiu um máximo em P10, seguido por cessação abrupta em P14. Essas técnicas permitirão a elucidação das funções dos cílios em vários tecidos. Embora técnicas relacionadas tenham sido publicadas em um relatório anterior1, o presente estudo se concentra em técnicas detalhadas para observar a motilidade e morfologia dos cílios CPEC ex vivo.

Uma visão geral do fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1, incluindo imagens dos dispositivos. Observações de movimento ao vivo de CPECs Filme 1 mostra um filme de CPECs isoladas de um rato perinatal, e Filme 2 mostra uma visão expandida das imagens em filme 1. Deve-se notar que as pontas ciliares individuais são menos claras nas imagens fixas comparados com os dos filmes. A Figura 2</s...

Neste estudo, uma técnica microscópica de luz detalhada foi otimizada para observação e análise em tempo real do movimento dos cílios CPEC ex vivo, juntamente com um método de microscopia eletrônica para análise ultraestrutural.

Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar o movimento dos cílios das células epiteliais do plexo coroide, ex vivo. Isso é alcançado primeiramente pela remoção do cérebro de um embrião ou filhote de camundongo para isolar o tecido do plexo coroide. O movimento ciliar é visualizado por contraste de interferência diferencial, ou microscopia DIC, e então um filme digital das pontas dos cílios é adquirido para o rastreamento manual das posições das pontas ciliares.No final, os movimentos das pontas reconstruídos dos cílios são categorizados e quantificados com base nos padrões de seus movimentos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na biologia celular, como: Como a mortalidade dos cílios é controlada durante o desenvolvimento e como o padrão de mobilidade muda ao longo do tempo? A implicação dessas técnicas se estende à análise e diagnóstico patofisiológicos.Doenças associadas à Síria, pois nossos conhecimentos fundamentais sobre a cinética da Síria ainda são incipientes. Comece colocando um camundongo neonatal lavado com etanol 70%, com a cabeça em meio Liebovitz L-15 gelado, em um recipiente estéril de 10 centímetros imediatamente após a decapitação. Em seguida, use um par de pinças de relojoeiro para remover o couro cabeludo do crânio.Em seguida, abra o crânio por meio de secção mediana ao longo da sutura longitudinal para expor o cérebro, seguido pelo corte dos nervos cranianos para coletar o órgão inteiro. Transfira o cérebro isolado para um novo recipiente contendo meio fresco e gelado, com a face dorsal voltada para cima, e coloque o recipiente sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, oriente o tecido de modo que os bulbos olfativos fiquem posicionados às três horas e segure o cérebro suavemente com uma pinça de relojoeiro.Com a outra mão, use pin&ccedil;as de disseca&ccedil;&atilde;o finas para cortar os ped&uacute;nculos cerebrais que conectam os hemisf&eacute;rios cerebrais ao tronco cerebral. Puxe o cefal&oacute;nio dion para separar ainda mais os hemisf&eacute;rios e posicione a superf&iacute;cie cortada voltada para cima, seguido pelo pux&atilde;o na l&acirc;mina &aacute;fia para remover o plexo cor&oacute;ide ventricular lateral preso ao lado lateral do hipocampo. Quando o plexo cor&oacute;ide for isolado, transfira o tecido para um recipiente de vidro com fundo de 35 mil&iacute;metros contendo meio fresco e posicione um peso sobre o tecido para segur&aacute;-lo suavemente no lugar. Dentro de 25 a 60 minutos ap&oacute;s a eutan&aacute;sia, inicie a imagem em tempo real das c&eacute;lias epiteliais do plexo cor&oacute;ide, ajustando o foco da lente objetiva visualmente.Ajuste o condensador para que o centro e o foco estejam de acordo com a iluminação K&ouml;hler. Em seguida, insira os elementos ópticos apropriados no trajeto da luz para adequ&aacute;-los &agrave;s &oacute;pticas de contraste de interfer&ecirc;ncia diferencial (DIC). Mova o prisma DIC para ajustar o contraste das imagens a uma posi&ccedil;&atilde;o na qual a estrutura da superf&iacute;cie do tecido possa ser claramente reconhecida.Em seguida, mude o trajeto da luz para a câmera de vídeo e aumente a potência da luz. Com a remoção dos filtros neutros, ajuste um campo de observação e o foco, configurando a resolução temporal da câmera de vídeo para 200 hertz e o tempo de exposição para 0,1 milissegundo durante o período de imageamento desejado. Em seguida, adquira as imagens; após a obtenção da pilha de imagens, cada quadro individual exibirá uma imagem nítida dos cílios para rastrear manualmente os padrões de batimento de cada cílio.Use o ponteiro do mouse para marcar a posição das pontas dos cílios em cada quadro. Em seguida, com o software apropriado, analise os dados da trajetória e classifique as trajetórias em um dos dois modos de movimento: de vai e vem ou rotacional, a olho nu. Utilizando a fórmula, calcule a frequência de batimento ciliar para múltiplos ciclos de batimento ciliar.Como outros cílios na mesma célula podem interferir no movimento de cada cílio. Em seguida, analisar a uniformidade angular dos eixos de batimento ciliar dentro de uma única célula. Para as trajetórias de ida e volta, ajuste as posições das extremidades dos cílios a uma linha reta, definindo theta como o ângulo que a linha forma com o eixo X.Para as trajetórias rotacionais, ajuste as posições a uma elipse, definindo teta como o ângulo que o eixo maior da elipse forma com o eixo x. Por fim, para uma descrição quantitativa de cada trajetória, rotacione as trajetórias por teta, definindo suas razões de aspecto como as razões entre as larguras de sua distribuição ao longo dos eixos x e y. Neste primeiro clipe, é mostrada uma visão superior de células epiteliais do plexo corióideo com cílios de um filhote de camundongo de dois dias pós-natal, obtida por microscopia de vídeo de alta velocidade; a superfície irregular do tecido do plexo corióideo torna-a visível tanto nos planos em foco quanto fora de foco.Neste segundo clipe, é mostrada uma visão ampliada da área delimitada no filme anterior, permitindo uma observação mais detalhada dos movimentos rotacionais e de ida e volta exibidos pelo cílio individual. Aqui, as trajetórias dos movimentos representativos da extremidade ciliar, reconstruídas a partir dos registros do filme ao longo de múltiplos ciclos, são apresentadas com os cursos temporais das coordenadas x e y das posições da extremidade plotados nos gráficos. Para demonstrar um deslocamento de fase entre as duas coordenadas nesses gráficos, as coordenadas x e y foram normalizadas e sobrepostas.Embora os clias móveis sejam facilmente reconhecidos por meio de imagem em tempo real, não é fácil identificar os clias não móveis por este método. Para superar essa dificuldade, a microscopia eletrônica de varredura pode ser indispensável para obter imagens completas dos clias, independentemente de sua motilidade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de realizar a dissecação com rapidez suficiente para que a frescura da amostra seja preservada e a motilidade de Syria seja mantida.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras de tecido com cérebro viral, bem como de como monitorar e quantificar a mortalidade do CX in vivo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o desenvolvimento de um modelo ex vivo de brotamento coroidal para estudar a angiogênese microvascular ocular. O ensaio envolve a cultura de explantes oculares de camundongos contendo o tecido coróide ligado à esclera e ao epitélio pigmentar da retina sob condições específicas que promovem o brotamento microvascular da coroide.

Ensaio de brotamento de coróide para estudar a proliferação microvascular ocular ex vivo

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento de células imunes dos plexos coróides de camundongos. Este procedimento é usado na pesquisa de neuroimunologia para entender como as células imunes nos plexos coróides afetam a saúde do cérebro e várias doenças neurológicas.

Isolando células imunes de plexos coróides de camundongos

Fonte: Al Omran, A. J., et al. Imagem ao vivo dos cílios ependimários nos ventrículos laterais do cérebro do camundongo. J. Vis. Exp. (2015).  Este vídeo demonstra uma técnica de imagem ao vivo usando microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) para observar o batimento dos cílios ependimários em seções cerebrais sagitais de camundongos. Os cílios ependimários impulsionam o líquido cefalorraquidiano (LCR) e sua atividade é registrada em seções cerebrais mantidas em um meio rico...

Imagem ao vivo da atividade ciliar de células ependimárias em uma seção do cérebro de camundongo

Fonte: Van Wonterghem, E., et al. Microdissecção e visualização de microscopia eletrônica de varredura de montagem inteira do plexo coróide de camundongo. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra a preparação e imagem do tecido do plexo coróide de um cérebro de camundongo usando microscopia eletrônica de varredura (MEV). O processo inclui fixação de tecido, desidratação e revestimento com uma camada condutora de platina para estabilizar e preparar a amostra para imagem. O SEM captura imagens...

Visualização do plexo coróide de um cérebro de camundongo usando microscopia eletrônica de varredura

Usando contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia de alta resolução, uma observação ex vivo do espancamento de cílios ependymal móveis localizados dentro dos ventrículos do cérebro do rato é demonstrado pelo live-imagiologia. A técnica permite que uma gravação da frequência de batimento ciliar ângulo único e batendo bem como as suas propriedades de estimulação do cálcio intracelular oscilação.

Imagens ao vivo da ependimária Cilia nas laterais ventrículos do cérebro do rato

As células epiteliais do plexo coróide (PC) formam a barreira do líquido cefalorraquidiano (BCSFB). Um modelo in vitro do BCSFB emprega células do papiloma do plexo coróide humano (HIBCPP). Este artigo descreve a cultura e a infecção basolateral de células HIBCPP usando um sistema de inserção de filtro de cultura de células.

Um modelo baseado em células epiteliais do plexo coróide da Barreira Fluid Human Blood-cefalorraquidiano para o Estudo de infecção bacteriana do lado basolateral

O objetivo do presente protocolo é demonstrar que o cultivo de pigmento retinal (RPE) as células epiteliais na membrana envelhecido e/ou doentes humanos de Bruch. Este método é adequado para estudar o comportamento de células RPE em uma matriz extracelular comprometido.

Cultivo de células epiteliais de pigmento Retinal em um modelo Ex Vivo da membrana de Bruch humano envelhecido

O objetivo deste protocolo é caracterizar um novo modelo de neurodegeneração glaucomatosa baseado na cauterização térmica 360° do plexo vascular limbal, induzindo hipertensão ocular subaguda.

Cauterização em círculo completo do plexo vascular limbal no glaucoma induzido cirurgicamente em roedores

Este estudo utiliza citometria de fluxo e duas estratégias diferentes de gating em camundongos isolados com plexos cerebrais coroides; este protocolo identifica os principais subconjuntos de células imunes que povoam essa estrutura cerebral.

Isolamento e Caracterização das Células Imunes de Plexos Choroides de Camundongos Micro-dissecados

O plexo coroide (PC), um tecido pouco estudado em neurociência, desempenha um papel fundamental na saúde e doença do sistema nervoso central. Este protocolo descreve uma técnica de microdissecção para isolamento do CP e o uso de microscopia eletrônica de varredura para obter uma visão global de sua estrutura celular.

Microdissecção e Visualização por Microscopia Eletrônica de Varredura de Montagem Completa do Plexo Coroide de Camundongos

Aprenda a analisar o movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide ex vivo em camundongos usando microscopia DIC. Este método permite categorizar e quantificar padrões de motilidade ciliar para estudos de biologia celular e desenvolvimento.

Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide

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