Observação do movimento ciliar de células epiteliais do plexo coróide Ex Vivo

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar o movimento da célula epitelial do plexo coróide, Celia ex vivo. Isso é conseguido primeiro excisando o cérebro de um embrião de camundongo ou filhote para isolar o tecido do plexo coróide. O movimento mociliar é visualizado por contraste de interferência diferencial, ou microscopia DIC, e então um filme digital das pontas ciliares é adquirido para rastreamento manual das posições das pontas ciliares.

Em última análise, os movimentos da ponta reconstituída da Celia são categorizados e quantificados com base nos padrões de seus movimentos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular, como Como a mortalidade de Celia é controlada durante o desenvolvimento e como o padrão de mobilidade muda ao longo do tempo? A implicação da extensão dessas técnicas foi a análise fisiológica do caminho e o diagnóstico.

A Síria associou doenças como nossos entendimentos fundamentais da Síria cinética ainda são estímulos. Comece colocando um camundongo neonatal lavado com 70% de etanol, cabeça em liebovitz L 15 gelado, médio em um prato estéril de 10 centímetros imediatamente após a decapitação. Em seguida, use uma pinça de relojoeiro para remover o couro cabeludo do crânio.

Em seguida, abra o crânio por seção mediana ao longo da sutura longitudinal para expor o cérebro, seguido pelo corte dos nervos cranianos para colher todo o órgão. Transfira o cérebro isolado para um novo prato cheio de gelo fresco, meio frio, com o aspecto dorsal voltado para cima e coloque o prato sob um microscópio estéreo. Em seguida, oriente o tecido de modo que os bulbos olfativos sejam posicionados às três horas e segure o cérebro suavemente com a pinça do relojoeiro.

Com a outra mão, use uma pinça de dissecção fina para cortar os poons cerebrais que conectam os hemisférios cerebrais ao tronco cerebral. Aperte o Dion Cephalon para separar ainda mais os hemisférios e coloque a superfície de corte voltada para cima, seguido de puxar a lâmina para remover o plexo coróide ventricular lateral preso ao lado lateral do hipocampo. Quando o plexo coróide tiver sido isolado, transfira o tecido para um prato de fundo de vidro de 35 milímetros contendo meio fresco e posicione um peso sobre o tecido para mantê-lo suavemente no lugar dentro de 25 a 60 minutos após a eutanásia, inicie a imagem ao vivo da célula epitelial do plexo coróide Celia, ajustando o foco da lente objetiva a olho nu.

Ajuste o condensador para que o centro e o foco estejam em conformidade com a iluminação Kula. Em seguida, insira os elementos ópticos apropriados no caminho da luz para se adequar à óptica DIC. Mova o prisma DIC para ajustar o contraste das imagens para uma posição em que a estrutura da superfície do tecido seja claramente reconhecida.

Em seguida, mude o caminho da luz para a câmera de vídeo e aumente a potência da luz. Com a remoção dos filtros de densidade neutra, ajuste um campo de observação e foco, ajustando a resolução temporal da câmera de vídeo para 200 hertz e o tempo de exposição para 0,1 milissegundos para o período de imagem desejado. Em seguida, adquira as imagens após a obtenção da pilha de imagens, cada quadro exibirá uma imagem nítida de Celia para rastrear manualmente os padrões de batimento de cada cílio.

Use o ponteiro do mouse para marcar a posição das pontas ciliares em cada quadro. Em seguida, usando o software apropriado, analise os dados da trajetória e classifique as trajetórias em um dos dois modos de movimento para frente e para trás ou rotacional a olho nu. Usando a fórmula, calcule a frequência de batimento ciliar para vários ciclos de batimento ciliar.

Como outras Célias na mesma célula podem interferir no movimento de cada cílio. Em seguida, analisar a uniformidade angular dos eixos de batimento ciliar dentro de uma única célula. Para as trajetórias de ida e volta, ajuste as posições das pontas de Celia em uma linha reta, definindo como o ângulo que a linha faz com o eixo X.

Para as trajetórias rotacionais, ajuste as posições a uma elipse, definindo como o ângulo que o eixo maior da elipse faz com o eixo x. Finalmente, para uma descrição quantitativa de cada trajetória, gire as trajetórias por definindo suas proporções como as proporções entre as larguras de sua distribuição ao longo dos eixos x e y. Neste primeiro clipe, uma visão superior das células epiteliais do plexo coróide com Celia de um filhote de camundongo pós-natal fotografado por microscopia de vídeo de alta velocidade é mostrada a superfície irregular do tecido do plexo coróide o torna visível tanto nos planos em foco quanto fora de foco.

Neste segundo clipe, uma visão ampliada da área encaixotada do filme anterior é mostrada, permitindo uma observação mais próxima dos movimentos rotacionais e de ida e volta exibidos pelo cílio individual. Aqui, as trajetórias dos movimentos representativos da ponta ciliar reconstituídos a partir de registros de filmes ao longo de vários ciclos são apresentadas com os cursos de tempo das coordenadas x e y das posições das pontas plotadas nos gráficos. Para demonstrar uma mudança de fase entre as duas coordenadas nesses gráficos, as coordenadas x e Y foram normalizadas e sobrepostas.

Embora os CLIA móveis sejam prontamente reconhecidos por imagens ao vivo, não é fácil identificar os CLIA não móveis por esse método. Para superar essa dificuldade, a microscopia eletrônica de varredura pode ser indispensável para a obtenção de imagens completas dos clia, independentemente de sua motilidade. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar a dissecção prontamente o suficiente para que o frescor da amostra seja preservado e a motilidade da Síria seja mantida.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras de tecido com cereais virais, bem como monitorar e quantificar a mortalidade do CX vivo.