Combinado Shuttle-Box Formação com eletrofisiológica Cortex Gravação e Estimulação como Ferramenta para o Estudo de Percepção e Aprendizagem

O objetivo geral do seguinte experimento é avaliar e manipular a atividade neural em massa e as neurodinâmicas durante a aprendizagem. Isso é alcançado primeiramente por meio da implantação de matrizes multieletrodos que permitem estimulação e registro simultâneos, específicos do local, da atividade neuronal no córtex auditivo. Em um segundo passo, os animais implantados são treinados em uma caixa de fuga de dois compartimentos, em um paradigma de ir-não-ir, enquanto se registra a atividade neuronal contínua no córtex auditivo e se utiliza estimulação microestimulação intracortical para condicionamento.

Em seguida, a análise do comportamento de aprendizagem e dos padrões de atividade espaço-temporais relacionados à aprendizagem é realizada com base em cada ensaio individualmente, de forma offline. Os resultados demonstram como a estimulação microcortical específica por local pode ser utilizada para evocar padrões de atividade espaço-temporais que permitem caracterizar estados cognitivos subjetivos internos. Assim, este método estabelece conexões entre padrões de atividade dos circuitos corticais e os estados comportamentais observados de aprendizagem e percepção.

As técnicas aqui descritas demonstram que não apenas é possível relacionar padrões individuais de atividade cortical a estados comportamentais e cognitivos definidos, mas também que é possível evocar, por meio de estimulação elétrica, percepções definidas que podem ser associadas a diferentes comportamentos. A extensão desses achados visa o desenvolvimento de substituição neuroprótese para funções sensoriais perdidas. Este método também pode ser aplicado a outras espécies de roedores, como ratos e camundongos.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois é necessária experiência e padrões bem estabelecidos no manejo e treinamento de animais para obter bons resultados nesses experimentos de aprendizagem. Primeiro, são preparados arrays de eletrodos multicanal estimulatórios e, em seguida, implantados cirurgicamente na córtex auditiva. De acordo com as instruções na parte escrita do protocolo, o restante do procedimento é iniciado somente após os animais terem se recuperado completamente da cirurgia.

As matrizes epidurais de superfície são feitas de fio de aço inoxidável disposto em uma matriz três por seis, com uma distância intereletrodo de aproximadamente 600 micrômetros. Conecte o amplificador da etapa inicial ao cabo de gravação. Utilize um chicote de cabos finos e flexíveis envoltos por uma malha metálica para proteger a conexão contra danos causados pela mordida de animais.

Utilize um pré-amplificador na caixa blindada para aumentar a relação sinal-ruído e a passagem de banda. Filtre o sinal na faixa de frequência desejada para gravações de potenciais de campo locais. Amostre os dados com frequência de amostragem superior a um quilohertz e filtro de dois a 300 hertz. Para gravações de potenciais de ação, utilize uma frequência de amostragem de pelo menos 40 quilohertz e um filtro de 300 a 4.000 hertz.

Para iniciar o teste comportamental, utilize uma caixa de passagem em uma câmara isolada acusticamente e contra interferências elétricas. A caixa contém dois compartimentos separados por um obstáculo. Utilize alturas de obstáculo apropriadas para espécies específicas, pois a altura do obstáculo influencia o viés comportamental da resposta.

Após conectar o animal a ser testado ao cabo de gravação e estimulação, coloque cuidadosamente o animal na câmara de treinamento e permita que ele se habitue por três minutos antes do início de uma sessão; registre todas as mudanças de compartimento na fase de habituação. Verifique atentamente a qualidade da gravação antes do início do treinamento. Aplique um filtro online de transformada rápida de Fourier ao sinal para determinar a amplitude do ruído de 50 hertz.

Por fim, verifique cuidadosamente todas as conexões entre o conector da cabeça, os adaptadores, os estágios de cabeça, o chicote de cabos e os amplificadores. Utilize um estimulador multicanal para aplicar estimulação microcortical aos eletrodos de estimulação para a estimulação condicionada. Aplique o estímulo condicionado e, em seguida, aplique o estímulo não condicionado de choque nos pés por meio do piso gradeado, garantindo que a intensidade do choque aplicado seja aversiva, mas não dolorosa.

Como visto aqui. Apresente ensaios em branco sem estímulo incondicionado e estímulo condicionado intercalados entre os ensaios para correção por meio de comportamento sutil. Classifique uma mudança de compartimento após o início do estímulo condicionado dentro de uma janela de tempo crítica de quatro segundos como resposta de acerto.

Se uma reação condicionada não ocorrer em resposta ao estímulo condicionado dentro da janela de tempo crítica, aplique imediatamente um choque leve nos pés por seis a 10 segundos. Como estímulo incondicionado, classifique isso como uma omissão em ensaios com estímulo condicionado negativo; uma mudança de compartimento dentro da janela de tempo crítica é classificada como uma resposta de falso alarme. Aplique o estímulo incondicionado por até 10 segundos imediatamente após essa resposta condicionada inadequada.

Não aplique o estímulo incondicionado de choque nos pés após os ensaios com estímulo condicionado negativo quando o animal permanecer no compartimento durante a janela de tempo crítica. Classifique isso como rejeição correta após a conclusão de todo o experimento. Controle a posição estável do conjunto de eletrodos de estimulação, administrando anestesia cirúrgica e, em seguida, aplicando corrente catártica monopolar por meio de todos os canais de estimulação para obter depósitos de ferro no tecido na posição de implantação. Determine cuidadosamente as latências de fuga em tempo real; aumente o nível de choque nos pés se as latências de fuga forem superiores a dois segundos.

Após as primeiras 20 tentativas para analisar os dados de treinamento, calcule as taxas de reação condicionada para os ensaios com estímulo condicionado positivo e estímulo condicionado negativo, conforme mostrado no gráfico exibido na tela, representando as taxas de reação condicionada em função da sessão ou bloco de tentativas, para avaliar o progresso do treinamento e a dinâmica de aprendizagem. Por fim, realize a análise de priming profundo de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo. Um índice de sensibilidade com o priming profundo superior a um pode ser usado como critério de limite para discriminação bem-sucedida; as latências de resposta durante os ensaios com estímulo condicionado positivo são aqui representadas para tentativas individuais. Ao longo de todas as sessões de treinamento, todas as respostas com latências abaixo de segundos correspondem a respostas de acerto bem-sucedidas.

Os histogramas das latências de resposta são bimodais, correspondendo a respostas HIIT em menos de seis segundos e respostas de fuga entre seis e oito segundos. Este é um exemplo típico de um potencial evocado eletricamente ou EEP de um único animal, média dos ensaios com estímulo condicionado positivo em uma única sessão de treinamento; o EEP é mostrado antes da remoção dos artefatos do estímulo de pulso único em preto e após a remoção dos artefatos em vermelho. O pico negativo acentuado inicial, conhecido como N dois zero, pode ser observado em uma latência de 20 milissegundos.

Esta figura mostra uma análise adicional das distribuições espaciais dos dois zeros de amplitude de N em resposta a um estímulo condicionante positivo no eletrodo de estimulação rostral no painel superior, e a um estímulo condicionante negativo no eletrodo de estimulação caudal. No painel inferior, observa-se a resolução espacial dos estados evocados em toda a córtex auditiva. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o aterramento do piso da grade é essencial para obter gravações eletrofisiológicas de alta qualidade, bem como para uma correta aplicação da estimulação elétrica após este procedimento.

Outros métodos, como manipulações optogenéticas e farmacológicas, podem ser incluídos no protocolo para investigar tipos celulares específicos e sistemas de transmissores na circuitaria cortical durante a percepção e a aprendizagem. Esta técnica abre caminho para que pesquisadores da área avancem de uma descrição meramente correlativa para uma descrição mais causal do papel da dinâmica neuronal nas funções de aprendizagem e memória.