Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

O objetivo geral deste procedimento é fabricar com precisão uma cânula e microinjetores, bem como realizar adequadamente a microinjeção. Isso é feito primeiro fabricando uma cânula com um comprimento apropriado. O segundo passo é cortar e montar microinjetores.

Em seguida, prepare microinjetores, tubos e uma bomba para microinjeção. A etapa final é completar a microinjeção e permitir que um período de difusão passe. Em última análise, a microinjeção é usada para injetar reagentes com precisão na região cerebral desejada, demonstrando o manuseio adequado.

Durante a microinjeção estará Ryan Poland, um aluno do meu laboratório. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque cuidados especiais devem ser tomados e todas as etapas requerem grande atenção para garantir a colocação adequada da cânula e o local da microinjeção. Para preparar a cânula primeiro, desenhe uma linha de referência de 15 milímetros na fita usando uma caneta de ponta fina.

Em seguida, use-o como guia para marcar as seções de 15 milímetros sequencialmente no tubo com um marcador permanente afiado. Em seguida, entalhe o tubo da cânula tocando-o no disco de corte de rotação lenta da ferramenta rotativa. Nos pontos marcados, gire a cânula 180 graus e entalhe o lado oposto do tubo.

Não corte completamente a tubulação, pois isso pode levar à oclusão. Depois, dobre bruscamente o tubo para quebrá-lo em seções de 15 milímetros. Em seguida, segure cada extremidade da cânula perpendicularmente ao disco de corte entre o polegar e o indicador.

Gire o tubo da cânula enquanto toca sua ponta na superfície do disco de corte para gerar uma ponta romba. Em seguida, alargar ambas as extremidades da cânula com uma agulha chanfrada de calibre 26 para garantir que todas as rebarbas foram removidas e que a cânula está desobstruída. Para preparar o obturador, clampeie uma cânula com aproximadamente metade do comprimento com hemostáticos retos de peso médio, coloque o hemostático travado na bancada de modo que a cânula fique perpendicular à bancada.

Em seguida, alimente uma extremidade do fio do ator na cânula até chegar à bancada. Dobre o fio beliscando com os dedos até obter um ângulo de 30 graus, mantendo o contato entre o obturador e a bancada. Depois disso, remova o fio da cânula e corte o excesso a 2,5 milímetros da dobra com pequenos cortadores diagonais.

Neste procedimento, segure uma extremidade do tubo do microinjetor perpendicularmente com um hemostático reto travado. Torça um hemostático enquanto mantém a tensão no tubo e enrole-o firmemente ao redor do hemostático pelo menos uma vez. Em seguida, meça 32 milímetros da extremidade solta oposta do tubo do microinjetor e segure esse ponto perpendicularmente com um segundo hemostático.

Dobre o tubo para frente e para trás, mantendo a tensão até que ele se quebre. Em seguida, inspecione a tubulação do microinjetor para garantir que ambas as extremidades estejam retas e que o diâmetro interno esteja desobstruído. Desenhe uma linha de referência de cinco milímetros na fita métrica e marque seções de cinco milímetros do tubo da cânula sequencialmente usando um marcador permanente.

Em seguida, toque o tubo da cânula no disco de corte de rotação lenta em pontos marcados para entalhar o tubo. Em seguida, dobre bruscamente o tubo do colar do microinjetor para quebrá-lo em seções de cinco milímetros. Deslize um colar em cada tubo microinjetor a cerca de dois centímetros da extremidade.

Aplique uma pequena quantidade de super cola no tubo microinjetor a cinco milímetros de uma extremidade. Em seguida, deslize o colar sobre o cordão de super cola de modo que fique a um milímetro da extremidade do tubo de microinjeção. Depois disso, cubra as duas extremidades da gola com cola.

Em seguida, conecte uma agulha de calibre 26 à seringa de um mililitro cheia de água estéril. E deslize o pedaço de oito centímetros de tubo de plástico micro injetor na agulha, certificando-se de não perfurar o tubo, depois deslize a outra extremidade do tubo de plástico sobre a extremidade do colar do micro injetor seco. Empurre o êmbolo da seringa cheio de água para testar a patente C.In esta etapa, dobre o microinjetor completo a 15 milímetros da extremidade oposta ao colar em 95 graus.

Em seguida, corte o tubo de plástico em 70 centímetros e deslize-o sobre o colar do microinjetor. Para preparar a bomba para microinjeção, defina o diâmetro da taxa de infusão desejada da agulha de microinjeção e o volume de injeção alvo no tubo. Em seguida, defina o modo de bomba para o volume para que um volume preciso seja fornecido automaticamente.

Em seguida, ajuste o batente traseiro da bomba para permitir que a seringa seja preenchida até o volume de injeção mais 0,2 microlitros adicionais. Agora coloque a ponta da seringa estanque na água estéril contida em um pequeno barco de soro de leite e agite suavemente o êmbolo para lubrificar o fio interno uniformemente. Puxe o êmbolo para o batente traseiro da bomba para encher a agulha de microinjeção com água.

Próximo slide. O tubo PE 20 que é conectado ao microinjetor em uma agulha de calibre 26 conectada a uma seringa cheia de água estéril de um mililitro. Pulverize água estéril através do microinjetor e inspecione o padrão e a distância do spray.

Em seguida, coloque um microinjetor esterilizado em um campo estéril. Deslize o tubo para fora da agulha, corte o tubo abaixo da área danificada pela agulha, mantendo-o na posição vertical para evitar que a água escorra. Em seguida, empurre o êmbolo da seringa do microinjetor ligeiramente para a frente para criar uma gota na extremidade da agulha e deslize o tubo PE 20 cheio de água na agulha.

Depois disso, empurre o êmbolo completamente para frente para se preparar para o carregamento da amostra e certifique-se de que nenhum traço de etanol permaneça no microinjetor. Verifique a configuração de vazamentos tocando na gota de água que se forma na ponta do microinjetor com um pano limpo de laboratório algumas vezes. Em seguida, puxe o êmbolo da seringa para trás 0,2 microlitros para criar uma bolha entre a água estéril e o tubo de PE 20 e a solução a ser injetada.

Depois disso, coloque o microinjetor no reagente a ser injetado e puxe lentamente o êmbolo da seringa para o batente traseiro. Para preparar o animal para a injeção, segure o peito do rato contra o peito do experimentador. Limpe a área ao redor da cânula com um aplicador de algodão embebido em Betadine.

Limpe a tampa da cabeça três vezes com Betadine e depois esfregue com etanol duas vezes. Em seguida, coloque o microinjetor cheio na cânula. Pressione start na bomba de microinjeção e monitore o movimento da bolha.

Quando a injeção estiver concluída, remova o microinjetor da cânula e substitua por obturador. Esta figura mostra a transfecção da região dos astrócitos do núcleo accumbens pelo vírus microinjetado, e esta figura mostra a redução da motivação dos ratos para auto-administrar etanol pela ativação de um transgene que foi superexpresso no núcleo accumbens. Os principais astrócitos ativam a ativação do pavor pela administração sistêmica de CNO reduziu significativamente a motivação dos ratos para auto-administrar etanol após a abstinência em comparação com o veículo CNO, que não teve efeito em uma coorte igualmente treinada que estava expressando GFP em vez do medo que uma vez dominado.

Essa técnica pode permitir implementos personalizados de microinjeção cerebral e maior flexibilidade de procedimentos experimentais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a localização precisa da microinjeção é imperativa para obter o efeito desejado.