Name: Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda microinjeção cerebral em roedores acordados para investigar substratos moleculares do comportamento motivado e transtornos psiquiátricos. Este método detalha a fabricação de cânulas e microinjetores com precisão essencial.

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</ol>

Nenhum dos autores tem interesses conflitantes ou conflitantes.

O procedimento apresentado aqui é um meio eficiente para a fabricação de cânulas microinjeção e microinjetores que irão auxiliar na elucidação dos substratos moleculares do comportamento motivado. Este método oferece várias vantagens. Em primeiro lugar, pela fabricação dos próprios implantes e microinjetores, novos parâmetros experimentais podem ser rapidamente otimizado, ou seja, a pessoa não precisa esperar por componentes personalizados feitos para chegar. Em segundo lugar, devido ao pequeno diâmetro da cânula, mais cânulas pode ser implantado em simultâneo. Isto encurta o tempo necessário cirúrgico, o que pode melhorar a capacidade de sobrevivência, e também permite que múltiplos implantes por animal. Em terceiro lugar, o software utilizado para controlar as câmaras operantes acomoda prontamente horários razão progressiva desde um paradigma proporção fixa pode ser rapidamente convertido em uma proporção paradigma progressiva, simplesmente aplicando uma lista de parâmetros do evento de transição que contém o esquema de reforço desejado. Seramplamente útil, um processo de microinjecção genérico que foi apresentada deve ser amplamente aplicáveis ​​para a microinjecção de quase qualquer reagente que está disponível. Conseqüentemente, prevemos que esta técnica vai continuar a ser de utilidade alta semelhante no futuro, com pequenas modificações. Por mudando apenas algumas variáveis, esta abordagem pode ser aplicada a uma grande número de reagentes. Os parâmetros que normalmente seriam manipuladas incluem a extensão a que se projecta a partir de microinjector da cânula, o volume de injecção, e taxa de injecção. Por exemplo, pode-se desejar que o injector ainda mais a projectar-se a partir da ponta da cânula para evitar cicatriz glial que tipicamente se forma em torno implantes crónicas. Além disso, pode-se desejar injectar um volume maior. Para microinjections vírus do estriado, num volume de 1 mL é tipicamente utilizado e este volume é tipicamente injectado ao longo de um período mais longo de tempo (frequência 7 - 10 min + 3 - 10 min de tempo de difusão adicional) em comparação com a utilizaçãod para reagentes farmacológicos (tipicamente 0,3 - 0,5 mL durante 2 - 3 minutos mais 1 - 3 minutos de tempo de difusão adicional). O usuário deve consultar a literatura e / ou empiricamente determinar os parâmetros mais adequados para suas necessidades. Independentemente disso, o sucesso deste procedimento é criticamente dependente de variáveis ​​4: 1) o comprimento da cânula, 2) comprimento microinjetor, 3) a qualidade do padrão de pulverização microinjetor, e 4) a integridade do sistema, antes da injecção. Porque microinjecção localização é dependente da profundidade que o microinjector se projecta a partir da cânula, é imperativo que ambas as cânulas (Passo 1.2.8) e comprimento de microinjector (pós-flexão, Passo 2.2.1) são ambos precisamente conhecida e uniforme entre todos os sujeitos . Isso pode ser facilmente controlado pelo prontamente rejeitando qualquer aplicação que não é o comprimento necessário na final re-medição. Além disso, o local de injecção só pode ser prevista, se ele ocorre imediatamente abaixo da cânula guia. Assim, qualquer que microinjector corças não pulverizar uma corrente longa, muito bem em testes (Passos 2.4.6) deve ser rejeitado. Uma injecção de qualidade também está relacionada com a integridade do sistema, antes da injecção. Se depois de dispensar toda a água do injector (antes do enchimento com o reagente) múltiplos pontos são observados em laboratório-limpe, em seguida, um vazamento precisa ser remediado (Nota sobre Passo 2.4.8). Além disso, se a bolha (Passo 2.4.9) que separa o fármaco a partir da água na tubagem PE20 não é uma, única bolha (depois de encher o microinjector com reagente), em seguida, o injector está parcialmente obstruído. Esta obstrução pode prevenir ou desviar a injeção. Isso também pode ser facilmente remediado (Nota sobre a etapa 2.4.8). Se um deseja microinject enquanto o animal está no quadro estereotáxico há três alternativas. Em primeiro lugar, pode-se aumentar o comprimento do colar microinjetor tal que pode ser segurado firmemente pelo manipulador estereotáxico e também estender o suficiente para permitir a ligação ao tubo de PE20. Em segundo lugar, sobreE pode temporalmente implantar uma cânula e usar o microinjector padrão aqui apresentada. Em terceiro lugar, pode-se usar pipetas de vidro polido e desenhado 16,17. Uma limitação significativa do procedimento apresentado aqui é que ele é melhor realizado em ratos bem tratadas que estão familiarizados com o procedimento. Os ratos utilizados para os dados descritos na seção de resultados necessário nenhum procedimento de manuseio especial porque o mesmo investigador manipulados os ratos diariamente por mais de 2 meses. Isto incluiu a observação diária e manipulação do implante cirúrgico durante pelo menos 2 semanas. No entanto, os ratos podem ser rapidamente habituam por um número de técnicas que são usadas para antes do ensaio de inibição de pré-pulso, que pode ser afectada pelo stress. Estas técnicas especiais de habituação foram bem detalhados anteriormente. 43 Em adição a estes procedimentos, é aconselhável que os ratos se habituam ao procedimento microinjecção onde microinjetores encurtadas são utilizados duanel injeções &#39;falsos&#39;. Durante estas injecções simuladas, é crítico que o microinjector não sobressair para o tecido, a fim de limitar os danos de tecidos. Em outras palavras, o microinjector deve ser não mais do que 14 mm dobrado. Assim, a habituação completa necessária para uma aplicação óptima desta técnica pode ser visto como uma limitação. Embora existam vários paradigmas comportamentais para medir a motivação, o rácio progressiva é comumente usado para quantificar o esforço que o assunto está disposta a exercer para obter um reforçador. A proporção paradigma progressiva produz uma medida conhecida como ponto de interrupção, o que é muitas vezes definida como o número máximo de pressões da alavanca na última relação concluída;.. Isto é, 21 máxima de responder que gerado um reforçador A razão progressiva é sensível à reforçador magnitude. Por exemplo, superior a cocaína (ou sacarose) doses produzir um ponto de interrupção superior e inferior cocaína (ou sacarose) doses produzir um breakp menoroint. 21,22 Assim, breakpoint é um proxy usado rotineiramente para a motivação e / ou reforçar a eficácia. 21,23-26 Porque a intenção de o ponto de interrupção é determinar quando o animal pára de responder, um parâmetro importante do paradigma razão progressiva é duração da sessão. Comprimentos sessão finitos pode colocar uma falsa cap em valores de ponto de interrupção e isso pode ser exacerbado pela pré-tratamentos que diminuem de forma anormal a taxa de auto-administração ou que a pausa aumento de pós-reforço. Este confundem pode ser superada por qualquer número de abordagens;.. Por exemplo, as sessões que terminam quando o animal tenha retido responder por algum múltiplo do intervalo médio inter-infusão 44 Uma variante mais comumente aplicado dessa abordagem é para encerrar sessões uma vez de responder tem foi retido por algum valor determinado empiricamente que se mantém constante entre os indivíduos. Nós fornecemos o método a aplicar esta abordagem no Passo 4.4.9.11.

Roedores e humanos respondem de maneiras notavelmente semelhantes a estímulos comportamentalmente relevantes1-3. Isso sugere que os roedores são sujeitos apropriados para elucidar os substratos moleculares do comportamento e condições psiquiátricas complexas4. Compreender os substratos moleculares de processos comportamentais complexos, como a motivação, freqüentemente requer microinjeção cerebral. Tanto a técnica de microinjeção cerebral quanto um ensaio de motivação primária serão apresentados aqui. Ratos serão usados como cobaias, mas esses procedimentos podem ser prontamente adaptados a camundongos bem manuseados. Estão incluídos aqui os procedimentos para a fabricação das cânulas, obturadores (cânulas ou estiletes fictícios) e microinjetores necessários. O método apresentado é significativamente mais flexível e mais econômico do que os implementos pré-fabricados. Essa flexibilidade será valiosa ao otimizar as condições. É importante ressaltar porque o procedimento de microinjeção pode ser usado para testar uma infinidade de hipóteses; As técnicas aqui apresentadas devem ser amplamente aplicáveis. Por exemplo, ligantes de receptores podem ser microinjetados para entender a neuroquímica3,5,6; peptídeos permeáveis a células e pequenas moléculas podem ser microinjetados para entender as vias de sinalização intracelular7-10; toxinas, bloqueadores de canais iônicos ou coquetéis antagonistas podem ser microinjetados para entender os circuitos1,11,12.
Embora o protocolo genérico apresentado aqui possa ser prontamente adaptado pelo usuário para suas necessidades específicas, o procedimento é particularmente adequado para ensaios comportamentais, uma vez que a microinjeção ocorre em roedores acordados que estão apenas sob leve restrição das mãos. Nenhuma anestesia ou restrições especiais são necessárias. Isso é possível porque o próprio cérebro não tem sensação de dor. No entanto, se a anestesia não for usada, a microinjeção deve ocorrer através de cânulas previamente implantadas estereotaxicamente. Isso ocorre porque os nociceptores estão presentes no couro cabeludo, as meninges,13 que são as membranas que envolvem o cérebro, e o periósteo,14 que é a membrana que cobre o crânio. Deve-se notar que a microinjeção sob anestesia às vezes é desejável. Um exemplo é quando o vírus está sendo injetado, e pode-se querer injetar o vírus diretamente através de agulhas de aço inoxidável15 ou pipetas de vidro, porque isso pode reduzir o dano tecidual e melhorar a eficiência da transdução. 16,17 Os microinjetores descritos abaixo podem ser modificados para esse fim e sugestões sobre como fazer isso podem ser encontradas na Discussão. Como outros artigos do JoVE demonstraram implante de cânula cerebral estereotáxica,18-20 esses procedimentos não serão abordados aqui.
Apresentamos esses procedimentos de microinjeção juntamente com um ensaio que quantifica a motivação. Vários modelos de comportamento motivado de roedores estão atualmente em uso, como a caixa da pista e a escalada de barreira. Aqui, descrevemos como usar um esquema de reforço de razão progressiva operante para quantificar a motivação onde a resposta operante está sendo mantida por um reforçador. Responder na proporção progressiva responde à magnitude do reforçador. 21,22 Assim, este ensaio é rotineiramente usado como um proxy para motivação e/ou reforço da eficácia. 21,23-30 Como várias revisões excelentes cobriram esse tópico em detalhes,21,24 vamos nos concentrar principalmente em questões práticas.

<table><tbody><tr><td>Tubo de cânula</td><td>Amazon Supply / Peças pequenas</td><td>HTXX-26T-60</td><td>26 G, Hipotubo S / S 316-TW 26GA</td></tr><tr><td>Obturador</td><td>Amazon Supply / Peças pequenas</td><td>GWXX-0080-30-05</td><td>33 gauge, Fio S / S 316LVM 0,008 IN</td></tr><tr><td>Microinjetor Fio</td><td>MicroGroup</td><td>33RW 304</td><td>33 gauge</td></tr><tr><td>Super Cola</td><td>Loctite</td><td>3924AC</td><td>Líquido, Não-gel, pode ser autoclavado</td></tr><tr><td>Tubo de plástico microinjetor</td><td>Becton Dickson</td><td>427406</td><td>PE20</td></tr><tr><td>Hemostáticos de peso médio</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241-G</td><td></td></tr><tr><td>Régua</td><td>Fisher</td><td>09-016</td><td>150 mm</td></tr> <tr><td># 7 Armazenamento de fórceps</td><td></td><td>52100-77</td><td>Dumont, Dumostar</td></tr><tr><td>Ferramenta Rotativa</td><td>Dremmel</td><td>285</td> Disco de corte <td>de duas velocidades</td></tr><tr><td></td><td>McMaster Bomba de Microinjeção Carr</td><td>3602</td><td>15/16" x 0.025"</td></tr> <tr><td></td><td>Harvard Apparatus</td><td>PhD 2000</td><td></td></tr><tr><td>1 ul Seringa de Vidro</td><td>Hamilton</td><td>7001KH</td><td>Estilo da Agulha: 25s/2.75"/3</td></tr><tr><td>Aplicador com Ponta de Algodão</td><td>Toalhetes de Laboratório Fisher</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimwipes</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Software Operante</td><td>Coulbourn</td><td>Câmaras</td> Operante do Estado <td></td>Gráfico</tr><tr><td></td><td>Coulborun</td><td>Habitest</td><td></td></tr></tbody></table>

roedor cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

A microinjeção cerebral pode ajudar na elucidação dos substratos moleculares de comportamentos complexos, como a motivação. Para esse fim, os roedores podem servir como modelos apropriados, em parte porque a resposta a estímulos comportamentalmente relevantes e os resultados de estímulo-ação de análise de circuitos são surpreendentemente semelhantes entre humanos e roedores. Ao estudar substratos moleculares de comportamentos complexos, a microinjeção de reagentes que modificam, aumentam ou silenciam sistemas específicos é uma técnica inestimável. No entanto, é crucial que o local da microinjeção seja direcionado com precisão para auxiliar na interpretação dos resultados. Apresentamos um método para a fabricação de implementos cirúrgicos e agulhas de microinjeção que permite microinjeção precisa e personalização ilimitada com custo mínimo. É importante ressaltar que essa técnica pode ser concluída com sucesso em roedores acordados se conduzida em conjunto com outros artigos JoVE que cobriram os procedimentos cirúrgicos necessários. Além disso, existem muitos paradigmas comportamentais que são adequados para medir a motivação. A razão progressiva é um método comumente usado que quantifica a eficácia de um reforçador para manter a resposta, apesar de uma necessidade de trabalho (muitas vezes exponencialmente) crescente. Este ensaio é sensível à magnitude do reforçador e às manipulações farmacológicas, o que permite determinar a eficácia e/ou motivação do reforço. Também apresentamos uma abordagem direta para programar o software operante para acomodar um cronograma de reforço de proporção progressiva.

Aqui, ilustramos exemplos de resultados que podem ser obtidos com o processo acima descrito. É mostrada uma primeira área que é típico transfectadas por vectores virais (Figura 3). Em geral, um volume de ~ 1 transfectadas mm 3 é obtido em tecido estriado. O volume da região transfectadas pode ser quantificada através de secções em série e utilizando o método de Cavalieri 32 importante notar que o volume de transfectada depende de muitos factores tais como o tipo de tecido a ser transfectada.; serotipo viral; promotor; taxa e volume injetado; número de partículas injetados; injectado pH; e se os reagentes hiperosmolar, tais como manitol, foram usadas. 33,34 Tipicamente, nós microinject 10 12 partículas / ml, 1 ml / min ao longo de 10 laterais, e permitir que 7 minutos adicionais antes de substituir os obturadores. Além disso, o produto de injecção é geralmente cerca de pH 8. Em seguida, mostra-se que a motivação pode ser manipulada por qualquer expressão do transgene (Figura 4)ou microinjecção reagente farmacológico (Figura 5). Na Figura 4, que expressa um receptor Designer Exclusivamente ativado por Designer Drugs (DREADDs). A região codificadora do receptor DREADD foi seguido por um local de entrada de ribossoma interno e uma cassete mCitrine. O mCitrine permite a visualização conveniente de células transfectadas. O DREADD foi acoplado à proteína G heterotrimérica Gαq. A activação do DREADD Gαq acoplado pode estimular astrócitos, 28,35 e o próprio DREADD pode ser activado pela administração sistémica de clozapina-N-óxido (CNO, 3 mg / kg, ip). Os ratos foram treinados 14,22,36 para alavanca de responder para reforço de etanol, onde 3 prensas alavanca rendeu uma chance de beber durante o dia 1 sessões de RH mais de 60 dias contíguos. Em seguida, os ratos foram forçados a abstinência, e DREADDs Gαq acoplados foram expressos em astrócitos núcleo accumbens do núcleo. Após três semanas de abstinência, a motivação para a auto-admi<html> Nister etanol foi medida por ponto de interrupção. 21,27-30 A activação de astrócitos do núcleo accumbens do núcleo, pela administração sistémica CNO, diminuiu a motivação para recomeçar os ratos de etanol auto-administração após a abstinência em relação ao veículo. É importante ressaltar que a CNO não teve nenhum efeito em uma coorte igualmente treinados que estava expressando Proteína Fluorescente Verde em vez do DREADD. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" /> Figura 3. Representante região do estriado ventral transfectada pelo vírus microinjectados. Esta imagem ilustra a região de núcleo accumbens astrócitos que foram transfectadas, seguindo o método acima. Os dados são reproduzidos a partir de Bull et al. 13 com a permissão do detentor dos direitos autorais. Detalhes podem ser encontrados na publicação e que o material complementar de acompanhamento.blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" /> Figura 4. A motivação dos ratos para auto-administrar o etanol foi reduzido por activação de um transgene que era sobre-expresso no núcleo accumbens astrócitos do núcleo. O vírus foi microinjectado motivação e medido através de um ponto de interrupção após permitindo semana para o vírus para expressar. O transgene foi expresso um Designer Receptor Exclusivamente ativado por Designer Drugs (DREADDs). Uma ANOVA one-way (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), seguido de um teste post-hoc de Scheffé revelou que a activação do DREADD por administração sistémica de clozapina-N-óxido (CNO, 3 mg / kg, ip ) reduziu significativamente a motivação dos ratos para auto-administrar etanol após a abstinência em relação ao veículo CNO não teve qualquer efeito na formação de uma coorte que foi igualmente que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) em vez do DREADD. Os dados são reproduzidos a partir de Bull et al. 13 com a permissão do detentor dos direitos autorais. Detalhes podem ser encontrados na publicação e que o material complementar de acompanhamento. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" /> Figura 5. A microinjecção de bloqueadores de junções de hiato aumentou a motivação dos ratos para auto-administrar etanol após a abstinência dois bloqueadores de junções de hiato foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a motivação (medido através do ponto de interrupção) de ratos para auto-administrar etanol:. Mefloquina e 18- ácido (18-α) -a-glicirretínico. A two-way ANOVA revelou que a microinjeção de bloqueadores de gap-junction no núcleo accumbens do núcleo aumentou a motivação dos ratos para auto-administrar etanol após a abstinência (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Os dados são reproduzidos a partir de Bull et al. 13 com a permissão do detentor dos direitos autorais. Detalhes podem ser encontrados na publicação e queo material suplementar que acompanha.

Roedores são um modelo apropriado para investigar os substratos moleculares do comportamento e transtornos psiquiátricos complexos. A microinjeção cerebral em roedores acordados pode ser usada para elucidar substratos de doenças. Um método de microinjeção cerebral eficiente e personalizável, bem como a execução de um paradigma operante que quantifica a motivação, é apresentado.

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar com precisão uma cânula e microinjetores, bem como realizar adequadamente a microinjeção. Isso é realizado primeiramente fabricando uma cânula com o comprimento apropriado. O segundo passo é cortar e montar os microinjetores.Em seguida, prepare microinjetores, tubos e uma bomba para microinjeção. O passo final é concluir a microinjeção e aguardar um período de difusão. Em última análise, a microinjeção é utilizada para injetar com precisão reagentes na região cerebral desejada, demonstrando a manipulação adequada.Durante a microinjeção, estará presente Ryan Poland, um estudante do meu laboratório. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois é necessário ter cuidado especial e toda etapa exige grande atenção para garantir o posicionamento adequado da cânula e o local correto da microinjeção. Para preparar a cânula primeiramente, desenhe uma linha de referência de 15 milímetros na fita usando uma caneta de ponta fina.Em seguida, utilize-o como guia para marcar sequencialmente as seções de 15 milímetros no tubo com uma caneta permanente de ponta fina. Depois, faça entalhes no tubo da cânula tocando-o no disco de corte girando lentamente da ferramenta rotativa. Nos pontos marcados, gire a cânula 180 graus e faça um entalhe no lado oposto do tubo.Não corte o tubo completamente, pois isso pode levar à oclusão. Em seguida, dobre o tubo bruscamente para quebrá-lo em seções de 15 milímetros. Depois segure cada extremidade da cânula perpendicular ao disco de corte entre o polegar e o indicador.Gire o tubo da cânula enquanto toca sua extremidade na superfície do disco cortado para gerar uma ponta romba. Posteriormente, alargue ambas as extremidades da cânula com uma agulha biselada de calibre 26 para garantir que todas as rebarbas tenham sido removidas e que a cânula esteja desobstruída. Para preparar o obturador, fixe uma cânula aproximadamente na metade do comprimento com hemostatos retos de peso médio, e coloque o hemostato travado sobre a bancada de modo que a cânula fique perpendicular à bancada.Em seguida, introduza uma extremidade do fio de ator na cânula até que atinja a bancada. Dobre o fio pressionando com os dedos até obter um ângulo de 30 graus, mantendo o contato entre o obturador e a bancada. Depois disso, remova o fio da cânula e corte a parte excedente a 2,5 milímetros da dobra com alicate de corte diagonal pequeno.Neste procedimento, segure uma extremidade do tubo do microinjetor perpendicularmente com um hemostato reto travado. Gire o hemostato mantendo tensão no tubo e enrole-o firmemente ao redor do hemostato pelo menos uma vez. Em seguida, meça 32 milímetros a partir da outra extremidade solta do tubo do microinjetor e segure esse ponto perpendicularmente com um segundo hemostato.Dobre o tubo para frente e para trás, mantendo a tensão até que ele quebre. Em seguida, inspecione o tubo do microinjetor para garantir que ambas as extremidades estejam retas e que o diâmetro interno não esteja obstruído. Desenhe uma linha de referência de cinco milímetros na fita métrica e marque seções de cinco milímetros do tubo da cânula sequencialmente usando uma caneta permanente.Em seguida, encoste o tubo da cânula no disco cortador em rotação lenta nos pontos marcados para fazer entalhes no tubo. Depois, dobre bruscamente o tubo do colar do microinjetor para quebrá-lo em seções de cinco milímetros. Deslize um colar para cada tubo do microinjetor a cerca de dois centímetros da extremidade.Aplique uma pequena quantidade de cola super forte no tubo do microinjetor a cinco milímetros de uma extremidade. Em seguida, deslize o colar sobre o filete de cola super forte de modo que fique a um milímetro da extremidade do tubo de microinjeção. Depois disso, cubra ambas as extremidades do colar com cola.Em seguida, acople uma agulha de calibre 26 à seringa de um mililitro preenchida com água estéril. Deslize o pedaço de oito centímetros de tubo plástico do microinjetor sobre a agulha, tomando cuidado para não perfurar o tubo; depois, deslize a outra extremidade do tubo plástico sobre a extremidade do colarinho do microinjetor seco. Pressione o êmbolo da seringa cheia de água para testar a patência. Nesta etapa, dobre o microinjetor montado a 15 milímetros da extremidade oposta ao colarinho em um ângulo de 95 graus.Em seguida, corte o tubo plástico em 70 centímetros e deslize-o sobre o colar do microinjetor. Para preparar a bomba para microinjeção, defina o diâmetro da agulha de microinjeção, a taxa de infusão desejada e o volume de injeção alvo no tubo. Em seguida, configure o modo da bomba para volume, de modo que um volume preciso seja entregue automaticamente.Em seguida, ajuste o batente da bomba para permitir que a seringa seja preenchida até o volume de injeção mais 0,2 microlitros adicionais. Coloque agora a ponta da seringa hermética no interior da água estéril contida em um pequeno recipiente e movimente suavemente o êmbolo para lubrificar uniformemente o fio interno. Puxe o êmbolo até o batente na bomba para encher a agulha de microinjeção com água.Próximo slide. O tubo PE 20 que está conectado ao microinjetor em uma agulha de calibre 26 acoplada a uma seringa estéril de um mililitro cheia de água estéril. Pulverize água estéril através do microinjetor e inspecione o padrão e a distância da pulverização.Em seguida, coloque um microinjetor esterilizado sobre um campo estéril. Deslize o tubo para fora da agulha, corte o tubo abaixo da área danificada pela agulha, mantendo-o na posição vertical para evitar que a água escorra. A seguir, empurre levemente o êmbolo da seringa do microinjetor para frente, formando uma gota na ponta da agulha, e deslize o tubo PE 20 cheio de água para dentro da agulha.Depois disso, empurre completamente o êmbolo para a frente para preparar a carga da amostra e garantir que nenhum resíduo de etanol permaneça no microinjetor. Verifique a presença de vazamentos tocando com um lenço de laboratório limpo algumas vezes a gota de água que se forma na ponta do microinjetor. Em seguida, puxe o êmbolo da seringa 0,2 microlitros para trás para criar uma bolha entre a água estéril e o tubo PE 20 e a solução a ser injetada.Em seguida, coloque o microinjetor no reagente a ser injetado e puxe lentamente o êmbolo da seringa até o batente. Para preparar o animal para a injeção, segure o tórax do rato contra o tórax do experimentador. Limpe a área ao redor da cânula com um aplicador de algodão embebido em Betadine.Limpe a tampa da cabeça três vezes com Betadine e depois limpe com etanol duas vezes. Em seguida, coloque o microinjetor cheio na cânula. Pressione iniciar na bomba de microinjeção e monitore o movimento da bolha.Após a conclusão da injeção, remova o microinjetor da cânula e substitua-o pelo obturador. Esta figura mostra a transfeção da região dos astrócitos do núcleo accumbens por meio de vírus microinjetado, e esta figura mostra a redução da motivação dos ratos para autominicistrar etanol mediante a ativação de um transgene superexpresso no núcleo accumbens. A ativação dos sítios de astrócitos do núcleo accumbens por administração sistêmica de CNO reduziu significativamente a motivação dos ratos para autominicistrar etanol após abstinência, em comparação com o veículo CNO, que não teve efeito em uma coorte igualmente treinada que expressava GFP em vez do dread. Uma vez dominado.Essa técnica pode permitir a personalização de dispositivos para microinjeção cerebral e maior flexibilidade nos procedimentos experimentais. Ao realizar esse procedimento, é importante lembrar que a localização precisa da microinjeção é fundamental para obter o efeito desejado.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

O acompanhamento dos níveis de neurotransmissores extracelular em regiões distintas do cérebro de animais que circulam livremente oferece insights sobre a relação entre a liberação do neurotransmissor e comportamento. Em microdiálise in vivo juntamente com detecção eletroquímica fornece anatômicas excelentes e resolução de química; e informações sobre como a neurotransmissão basal é alterada por manipulações farmacológicas ou fisiológicas.

Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores

Fonte: Poland, R. et al. Microinjeção de cérebro de roedores para estudar substratos moleculares do comportamento motivado. J. Vis. Exp. (2015)Neste vídeo, uma configuração de microinjeção cheia de água que consiste em uma seringa e um tubo de microinjetor é usada para a administração precisa do medicamento. Um rato com uma cânula guia pré-implantada é submetido a microinjeção cerebral direcionada, permitindo a administração precisa de agentes terapêuticos em animais acordados com danos mínimos...

Entrega baseada em microinjeção de um agente terapêutico em um cérebro de roedor acordado

Este protocolo descreve a montagem e o uso de um injetor para administração precisa de medicamentos em regiões cerebrais específicas de um rato anestesiado, seguido pelo monitoramento da atividade neuronal por meio de sinais elétricos registrados.

Microinjeção de Drogas com Registro Eletrofisiológico em Cérebro de Rato

Fonte: Paolone, G., et al. Agulhas personalizadas para microinjeções no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra uma injeção de microagulha de cérebro de roedor usando uma microagulha de quartzo com orifícios. A microagulha é conectada a uma seringa e microbomba para controlar a taxa de entrega. A agulha com a solução injetável é inserida no cérebro com a velocidade de entrega definida como baixa. Uma vez posicionado, a velocidade de entrega é aumentada. A agulha é retirada...

Microinjeção de cérebro de roedor usando uma microagulha de quartzo

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar...

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

Este artigo descreve como microinject vetores virais em cérebro de camundongos e teste em um paradigma de preferência local condicionado, que inclui uma fase de aquisição, extinção e reintegração.

Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Aqui, criamos uma pipeta de vidro com funções duplas: inibição de estruturas cerebrais profundas por microinjeções de drogas e monitoramento em tempo real de seus efeitos por meio de registros eletrofisiológicos simultâneos.

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Injecção estereotáxica de lentivírus expressando cDNAs ou shRNAs pode modular a expressão de genes em áreas específicas do cérebro de ratos. Aqui, apresentamos um protocolo para combinar injeções estereotáxica com tarefas comportamentais, como o campo aberto Test (OFT) eo Teste de Natação Forçada (FST).

Aplicando a técnica de injecção estereotáxica para estudar os efeitos genéticos sobre os comportamentos animais

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

Descrito aqui é um procedimento estereotático que pode atingir regiões cerebrais desafiadoras e de difícil acesso (devido a limitações espaciais) usando uma abordagem coronal angular. Este protocolo é adaptável tanto aos modelos de camundongos quanto a ratos e pode ser aplicado a diversas aplicações neurocientíficas, incluindo implantação de cânulas e microinjeções de construções virais.

Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência

Aprenda microinjeção cerebral em roedores acordados para investigar substratos moleculares do comportamento motivado e transtornos psiquiátricos. Este método detalha a fabricação de cânulas e microinjetores com precisão essencial.

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

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