Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin In Vitro Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

O objetivo geral do procedimento a seguir é determinar a concentração inibitória mínima de dalbavancina. Usando o método de microdiluição em caldo com foco nas principais etapas exclusivas da Dalbavancina para fazer isso. A diluição estoque e intermediária de dalbavancina é feita em DMSO e a diluição final é feita em cátion em caldo Mueller Hinton ajustado suplementado com polissorbato.

A diluição é dispensada em uma placa de 96 poços e inoculada com uma suspensão padronizada de bactérias. A placa é então incubada durante 16 a 24 horas e examinada para determinar a quantidade mínima de dalbavancina necessária para inibir o crescimento bacteriano. A adesão a este método padronizado garantirá resultados consistentes com ambos os isolados clínicos e, como mostrado aqui, os isolados de controle de qualidade A Dalbavancina é um agente antimicrobiano lipoglicopeptídico semissintético que foi aprovado em maio de 2014 pelo FDA para o tratamento de infecções bacterianas agudas da pele e da estrutura da pele causadas por organismos gram-positivos.

Este método descreve o caldo padronizado, método de suscetibilidade de microdiluição para dassina, que inclui o uso de DMSO para preparar soluções de estoque em polissorbato 80 para aliviar a aderência do agente ao plástico A demonstração visual deste método é útil. Como as etapas de preparação da solução de estoque e placa MIC não são típicas em comparação com a maioria dos agentes antimicrobianos. Essas etapas são exclusivas dos agentes lipoglicopeptídicos e são importantes a serem seguidas para obter resultados de CIM reprodutíveis e precisos.

Demonstrando o procedimento estará Gina Fisher, uma cientista pesquisadora do meu laboratório. Observe que as precauções de segurança apropriadas consistentes com o nível de biossegurança dois devem ser utilizadas ao realizar o procedimento a seguir. Comece pesando a quantidade apropriada de dalbavancina para preparar uma solução de estoque de 800 microgramas por mililitro.

Adicione a quantidade apropriada de NEAT DMSO a um tubo de vidro ou plástico estéril, transfira o pó para o tubo e faça um vórtice. Próximo. Utilizando a solução-mãe de DALBAVANCIN de 800 microgramas por mililitro, preparar 100 x concentrações finais de CIM em placa, conforme indicado nas colunas de um a quatro. Estas são chamadas de concentrações intermediárias.

O volume total preparado dependerá do número de painéis MIC. Finalmente, dilua as concentrações intermediárias em um a 100 em caldo Mueller Hinten não ajustado de cátions, também conhecido como C-A-M-H-B, suplementado com 0,004%P 80. A concentração de trabalho resultante de DALBAVANCIN e P 80 é o dobro da concentração final.

Uma vez que a adição de inóculo resultará numa diluição de uma a duas utilizando uma pipeta multicanal com pontas estéreis, dispensar 50 microlitros de cada diluição de dalbavancina nos poços apropriados do painel de microdiluição estéril de 96 poços. O formato da placa MIC permite que oito inóculos sejam testados por placa. Se os painéis não forem usados imediatamente, aplique filme plástico para selá-los, coloque-os em sacos plásticos e guarde-os em um freezer sem descongelamento a pelo menos 60 graus Celsius negativos até que sejam necessários.

Nesta demonstração, uma placa recém-preparada será inoculada. Para preparar o inóculo, selecione várias colônias bem isoladas de uma broca de sangue de 18 a 24 horas ou outra placa de trado não seletiva. Aqui, são utilizadas cepas calosas aria e EPHI de controle de qualidade.

Toque o topo de cada colônia com um cotonete estéril e transfira um pouco para um tubo contendo de um a cinco mililitros de C-A-M-H-B ou solução salina. Continue transferindo até que a turbidez corresponda a um padrão de McFarland de 0,5 dentro de 15 a 30 minutos após a preparação, dilua o inóculo de um a 100 em C-A-M-H-B para chegar a uma concentração final de cinco vezes 10 elevado ao quinto UFC por mililitro. O intervalo aceitável é de duas a oito vezes 10 elevado à quinta UFC por mililitro.

Imediatamente usando uma pipeta multicanal com pontas estéreis, transfira 50 microlitros do inóculo final para cada poço apropriado da placa do painel MIC aqui. Inoculam-se quatro linhas com cada um dos dois isolados, num total de quatro repetições por isolado. Em seguida, para realizar uma verificação de pureza, use uma pipeta para transferir de um a 10 microlitros da solução no controle positivo de crescimento para um ágar não seletivo, como o ágar soja try decay com 5% de sangue de ovelha.

Use um laço estéril para espalhar a solução sobre a superfície da placa. Gire a placa 90 graus e risque novamente para garantir que o inóculo seja distribuído uniformemente. Cubra o prato e reserve.

Em preparação para uma contagem de colônias, use uma pipeta de canal único para transferir 10 microlitros da solução no poço de controle de crescimento para 10 mililitros de mistura salina e, em seguida, transfira 100 microlitros para um meio agrícola não seletivo adequado, como ágar de soja com 5% de sangue de ovelha usando um laço estéril, espalhe a solução por toda a superfície agrícola. Repita este processo duas vezes em direções diferentes para garantir uma distribuição uniforme do inóculo. Em seguida, empilhe até quatro painéis MIC em um recipiente de plástico, garantindo que o painel superior esteja hermeticamente fechado com uma tampa.

Em seguida, coloque uma toalha de papel úmida dentro do recipiente de plástico e feche-o firmemente com a tampa dentro de 30 minutos após a inoculação. Incube os painéis MIC, a placa de contagem de colônias e a placa de verificação de pureza em uma incubadora de ar ambiente a 35 graus Celsius para mais ou para menos por 16 a 20 horas. No dia seguinte, leia a concentração inibitória mínima como a concentração mais baixa que inibe completamente o crescimento bacteriano nos poços, conforme detectado a olho nu.

Determine o número de colônias na placa de contagem de colônias. Multiplique o número contado pelo fator de diluição. Por exemplo, 50 colônias vezes um fator de diluição de 10.000 é igual a cinco vezes 10 elevado à quinta UFC por mililitro.

Um intervalo aceitável é de 20 a 80 colônias, o que equivale a duas a oito vezes 10 elevado à quinta colônia formando unidades por ml. A concentração do inóculo é uma variável importante para controlar o teste de suscetibilidade, a fim de obter resultados precisos. Por fim, verifique a placa de pureza.

Se todas as colônias forem semelhantes às colônias usadas como inóculo, então ele pode ser considerado puro. Se houver outras colônias presentes, há potencial para a presença de um contaminante no painel MIC e o teste deve ser repetido. Os resultados de DAL bevans, MIC foram comparados com os obtidos usando o método de diluição agrícola, conforme mostrado aqui.

Os resultados do Agri MIC para Dal bevans são tipicamente duas a oito vezes maiores do que o caldo. Microdiluição, resultados MIC. Isso contrasta com os resultados da vancomicina, que são por caldo e métodos agrícolas.

Por conseguinte, a diluição agrícola não é recomendada para o ensaio de caldo de dalbavancina dalbavancina. Microdiluição MIC, os resultados para controle de qualidade devem estar dentro dos intervalos esperados, conforme mostrado aqui. O organismo de controle de qualidade SS, A TCC 2 9 2 1 3 com um MIC modal muito claro de 0,06 microgramas por mililitro, tem sido um bom indicador da variação do método.

Se os resultados obtidos estiverem fora dos intervalos esperados para os organismos de controlo de qualidade ou tenderem para o limite inferior ou superior do intervalo, justifica-se uma validação adicional do método. Além de validar o método usando organismos de controle de qualidade, os dados de dalbavancina e MIC de programas regionais de vigilância antimicrobiana podem fornecer uma base para os resultados de MIC esperados no ambiente de laboratório clínico, conforme mostrado aqui, Dal b Anson MIC, os resultados para isolados coletados na Europa e nos EUA em 2011 a 2013 foram inferiores a 0,25 microgramas por mililitro para 99,9% dos SIUs e 100% dos estreptococos. Com base nesses dados de vigilância, é evidente que os resultados da CIM da dalbavancina para estafilococos e estreptococos superiores a 0,12 microgramas por mililitro são raros.

Se forem observados números mais elevados, o teste deve ser repetido e/ou enviado a um laboratório de referência para validação. A preparação da diluição do estoque em DMSO e a adição de P 80 à diluição do caldo a uma concentração de 0,002% no poço final da CIM são as etapas críticas para obter resultados precisos e reprodutíveis da CIM da dalbavancina Como sempre, mas especialmente nesta área de desenvolvimento de resistência bacteriana, resultados precisos de suscetibilidade antimicrobiana são críticos para a escolha da terapia apropriada pelo médico.