Name: Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin In Vitro Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Aprenda o método de microdiluição em caldo para determinar a concentração inibitória mínima de dalbavancin em bactérias Gram-positivas. Este protocolo padronizado garante resultados reprodutíveis e precisos.

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Trabalhos anteriores com relação ao teste de suscetibilidade da dalbavancina foram valiosos no desenvolvimento de métodos padronizados e o reconhecimento por este trabalho é dado aos Laboratórios JMI, Robert Rennie e Beth Goldstein.

Nota: Consulte a documentação do CLSI M7-A10 e M100-S25 e / ou ISO / FDIS 20776-1 Para maiores detalhes sobre o método de referência de microdiluição para susceptibilidade aos antimicrobianos 2, 3, 4 Os métodos de referência para permitir opções em alguns dos arquivos. Procedimentos específicos para a preparação do inóculo e painel MIC produção para alcançar o mesmo resultado final. O método descrito aqui refere-se a um agente antimicrobiano, dalbavancin, e alguns dos passos representam uma das várias maneiras potencialmente o procedimento de referência pode ser feito. Precauções de segurança apropriado (consistentes com o nível de biossegurança 2) deve ser utilizado 10. O formato do painel de MIC usado para os fins da presente publicação de vídeo é mostrado na Tabela 1. 1. Loja Dalbavancin Pó <ol><li> Após o recebimento do diagnóstico pó dalbavancin grau, armazenar a -20 ° C em um ambiente desidratado num congelador non-descongelamento. Antes da utilização, o pó deve equilibrar aRT chegar antes da abertura. </li></ol> 2. Preparar diluições do painel MIC <ol><li> Prepara-se uma solução de reserva não maior do que 1.600 ug / mL de dalbavancin em DMSO puro (puro) em vidro ou plástico tubos estéreis, e utilizar no mesmo dia da preparação ou armazenar a -20 a -60 ° C ou abaixo para utilização futura em um freezer não-descongelamento. Leve em consideração a potência de dalbavancin conforme previsto na documentação recebida com o pó, quando pesando o pó (ver Equação 1, por exemplo, 800 mg / ml de preparação de estoque). </li><li> Dilui-se a diluição da similar ao esquema como se mostra na coluna 1 (&quot;Concentração Fonte&quot;) na Tabela 2 com DMSO puro em vidro ou plástico tubos estéreis. Use uma pipeta para medir diluente e outra pipeta para adicionar o estoque inicial dalbavancin ao primeiro tubo. Para cada concentração estoque dalbavancin posterior usar uma pipeta nova. </li><li> Prepare 100X última concent painel MICdiluições de racionamento (concentrações intermediárias) com DMSO puro. Como é mostrado nas colunas 2-4 da Tabela 2, combinar volumes apropriados de fonte e DMSO para atingir a concentração desejada (intermediário volumes a serem utilizados dependerá do número de painéis de MIC a ser efectuada). </li><li> Prepare a 0,004% P80: Prepara-se uma solução fresca de estoque de trabalho de 2% P80 por adição de 0,1 ml de P80 a 4,9 ml de dH 2 O. Esterilizar por passagem através de uma solução de filtro de 0,22 micron e a utilização, no mesmo dia da preparação. Prepare a 0,004% P80 diluente, fazendo uma diluição 1: 500 de 2% P80 (por exemplo, 0,3 ml de 2% P80 para 149,7 mL de CAMHB). </li><li> Diluir as concentrações intermédias preparado no passo 2.2 a 1: 100 em catião ajustado caldo de Mueller Hinton (CAMHB), suplementado com 0,004% (v / v) de polisorbato-80 (-80 P) P-80 e / ou LHB (para estreptococos) adicionou com o dobro da concentração final por causa da adição de inoculo (passo 4.3) vai resultar em uma diluição de 1: 2. Ver colunas 6 e 7 do quadro 2 </strong&gt;. </li></ol> 3. Prepare Painéis MIC <ol><li> Dispensar 50 ul de cada solução dalbavancin preparado no passo 2.3 em poços apropriados de painel de MIC e incluem meios de num único poço (controlo de crescimento bem). Uma pipeta de multi-canal com pontas estéreis podem ser utilizadas para este passo. </li><li> Use painéis imediatamente ou selo com filme plástico, coloque em sacos de plástico e colocar imediatamente em um freezer não-descongelação à ≤-20 ° C (de preferência a ≤-60 o C) até que seja necessário. Se forem utilizados painéis congelados, remover os selos e colocar painéis individuais em bancada de laboratório durante 15-30 minutos (até que o conteúdo bem são descongelados), antes de prosseguir para o painel inoculação. </li></ol> 4. Inocular Painéis MIC, Execute Pureza e Colony Setup Contagem <ol><li> Seleccione várias colónias bem isoladas a partir de um agar de sangue de 18-24 h ou outra placa de agar não selectivas. Toque no topo de cada colônia com uma ansa estéril ou cotonete e transferência para 1-5 ml CAMHB ou sAline até turvação é equivalente a um padrão McFarland 0,5. Avaliar turbidez por comparação visual ao 0,5 McFarland ou com um dispositivo de medição fotométrica. </li><li> Dentro de 15-30 minutos de preparação, dilui-se o inoculo de 1: 100 em CAMHB (100 ul para 10 ml CAMHB). Para a maioria das bactérias testadas contra dalbavancin, com excepção de S. pneumoniae, esta diluição irá proporcionar uma concentração final do poço de 5 x 10 5 CFU / mL (intervalo aceitável é de 2-8 x 10 5 CFU / mL). Para S. pneumoniae, concentração bacteriana com base na comparação de turbidez McFarland 0.5 para um é tipicamente consideravelmente menor, por conseguinte, diluir a 1:25 inoculo (400 ul em 10 ml de CAMHB + 10% + LHB). </li><li> Dentro de 15 minutos após a preparação do inóculo, transferir 50 ul do inoculo final a cada poço (com excepção do controlo de esterilidade bem) do painel MIC preparado no passo 3. Uma pipeta multi-canais usando pontas estéreis podem ser utilizadas para este passo. </li><li> Executar uma verificação de purezapor transferência e espalhamento de uma alíquota de 1-10 ul de controlo positivo de crescimento bem utilizando uma ansa estéril para um meio de ágar não selectivo (por exemplo, ágar de tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha). </li><li> Configuração do número de colónias, removendo 10 ul do controlo de crescimento bem com uma única ponta de pipeta estéril e canal e transferência para 10 ml de solução salina (1: 1000 de diluição). Misturar e transferir 100 ul com uma única pipeta de canal e ponta estéril para um meio adequado, não selectivo de agar (por exemplo, agar de tripticase de soja com 5% de sangue de ovelha) e distribuídos por toda a superfície do agar com um lacete estéril, repetindo duas vezes em direcções diferentes para assegurar uma distribuição uniforme do inoculo (diluição 1:10). </li></ol> 5. Painéis Incubar MIC, Contagem Colony e Pureza Plates <ol><li> Selar cada painel MIC ou pilha de não mais de 4 painéis em um saco plástico, com uma fita de plástico ou com uma capa de plástico apertada antes da incubação. Alternativamente, coloque o painel MIC vazio na top da pilha de não mais de 4 painéis de CIM, coloque uma toalha de papel úmido em um recipiente de plástico, painéis de CIM lugar no recipiente de plástico e perto recipiente com tampa de forma segura. </li><li> Incubar painéis MIC em uma incubadora de ar ambiente a 35 ° C ± 2 ° C durante 16-20 hr (estafilococos e enterococos) e 20-24 h (estreptococos) dentro de 30 min de inoculação. Incubar a contagem de colónias e placas de pureza nas mesmas condições excepto estreptococos Incubar em 5% de CO2. </li></ol> 6. Leia o MIC e Colony Contagem placas; Verifique Pureza Placa <ol><li> Leia a MIC como a concentração mais baixa que inibe completamente o crescimento bacteriano nas cavidades como detectadas pelo olho nu. </li><li> Contagem das colónias na placa de contagem de colônias. Multiplicar cada colónia pelo factor de diluição (1: 10.000) (por exemplo, 50 colónias é equivalente a 5 x 10 5 CFU / mL). Um intervalo aceitável é de 20-80 colónias (2-8 x 10 5 CFU / ml) e é usado como um aproorientação ximate. </li><li> Verifique placa de pureza. Se todas as colónias são semelhantes para as colónias usados ​​no passo 4.1, em seguida, o inoculo pode ser considerado puro. Se existem quaisquer outras colónias presentes, então há potencial para um contaminante para estar presente no painel de MIC e o ensaio deverá ser repetido. </li></ol> 7. Verifique Resultados controle de qualidade. <ol><li> Consulte a Tabela 3 para intervalos esperados de cepas de controle de qualidade CLSI. Apenas relatar resultados de teste isolados, se os resultados de CIM dalbavancin para organismo (s) de controle de qualidade estão dentro do intervalo esperado. </li><li> Se uma MIC de ≥0.25 ug / ml é obtida por qualquer S. clínica aureus isolado, repetir os testes MIC dalbavancin e / ou enviar para um laboratório de referência para a verificação. </li></ol>

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</ol>

Sandra McCurdy é um empregado de DURATA Therapeutics; Especialistas de Laboratório, Inc., empregador de Laura Koeth e Jeanna Fisher, foi contratada pela DURATA Therapeutics para preparar o manuscrito. Taxas de publicação do presente artigo foram pagos pela Especialistas de Laboratório, Inc.

Os seguintes detalhes do método são apresentados para considerações adicionais quando se preparava para testes dalbavancin MIC. O design do painel de MIC dependerá do número de agentes antimicrobianos para ser testado (isto é., Dalbavancin sozinho ou vários agentes) e as espécies de bactérias a ser testado. As concentrações dalbavancin deve englobar os pontos de quebra de interpretação para todas as espécies bacterianas a serem testados e toda a gama de diluições esperada para pelo menos uma estirpe de CQ. A série de diluição antimicrobiana podem ser organizados em linhas ou colunas, dependendo do número de agentes anti-microbianos e / ou isolados / placa e método de inoculação. O volume de dalbavancin pó e caldo deve ser calculado para assegurar que quantidades ideais são produzidos e dos resíduos é mínima. Para o exemplo utilizado na presente publicação, os volumes são baseados na preparação de dois painéis de MIC. Cátion ajustado caldo Mueller Hinton deve ser preparado e autoclavado de acordo com homeminstruções e esterilidade dos meios de comunicação de ufacturer verificada. MIC painéis pode ser feito e utilizado na preparação do mesmo dia, ou podem ser testadas com os organismos de controlo de qualidade adequados e os painéis validados armazenado congelado para uso futuro. É importante a utilização de técnicas de esterilidade durante todo o procedimento. Não há critérios estritos para a verificação da concentração de inóculo com contagem de colônias. Contagens de colónias pode ser verificado inicialmente para cada espécie testada e / ou periodicamente para validar o passo de diluição realizada no passo 4.2. É importante que a validade do padrão 0,5 de McFarland também é verificado rotineiramente com E. coli ATCC 25922, utilizando um procedimento semelhante ao passo 4.5. Se os resultados não são equivalentes a 1-2 x 10 8 CFU / ml, um novo padrão de 0,5 McFarland deve ser obtida. Se as contagens de colónias a partir de poços de CIM estão fora da gama aceitável (2-8 x 10 5 resultados UFC / mL e de MIC para o isolado clínico (s) pode variar de the esperado distribuição normal (ex. 0,03-0,12 ug / ml para S. aureus) e / ou resultados de MIC para o isolado de controle de qualidade (s) estão fora dos limites esperados, o teste de validação é necessário e modificação método pode ser garantido. Sugere-se que um padrão McFarland 0,5 validado é utilizada para repetir a contagem (s) de colónias e se os resultados são mais uma vez fora dos resultados esperados, a diluição do inoculo, realizada no passo 4.2 deve ser ajustado em conformidade e a MIC repetido. Note-se que uma verificação de pureza é necessário, mesmo se um número de colónias é realizada porque o procedimento de contagem de colónia utiliza um volume diluídos que podem não ser necessariamente detectar concentrações mais baixas de organismos contaminantes. Para um teste MIC seja considerado válido, o crescimento aceitável deve ocorrer no controle do crescimento bem. Para a maioria das bactérias que irá ser testados contra dalbavancin (isto é., Os estafilococos, estreptococos e enterococos, o crescimento irá ser visto como um botão (tipicamente&gt; 2 mm) e menos frequently, o crescimento pode aparecer como turbidez no poço. Ao contrário de alguns agentes antimicrobianos que podem apresentar fuga efeito que as concentrações de aumentar, endpoints dalbavancin são tipicamente bem definido. Existem vários dispositivos de visualização, destinadas a facilitar a leitura testes de microdiluição, que podem ser usados ​​para ler dalbavancin placas contendo desde que não há nenhum compromisso na capacidade de discernir o crescimento nos poços. Os passos críticos dentro do protocolo estão relacionadas com as partes do procedimento que estão relacionados com a solubilidade do dalbavancin e adição de P80. É importante que a concentração máxima de dalbavancin utilizada não é maior do que 1.600 ug / ml, que o DMSO é utilizado como um solvente e que as concentrações intermédias são preparadas em DMSO, antes de fazer as diluições de caldo de modo a que a concentração final de DMSO no MIC painel poços não é maior do que 1%. DMSO é higroscópico e, por conseguinte, a utilização de garrafas mais velhos de DMSO foi de um consideratíon que diz respeito à dalbavancin solubilidade. No entanto, não enquanto um estudo BMD pequeno com cepas de controle de qualidade tem mostrado que isso seja uma variável importante (ver secção Resultados), é uma boa prática para usar garrafas novos ou recentemente abertos de DMSO. É também importante que P80 é adicionado ao caldo no passo final da preparação de diluição da droga e é a uma concentração final de 0,002% na MIC bem. O processo da DMO incluído aqui utiliza preparação de painéis de MIC utilizando 50 ul / poço em dalbavancin e P-80 concentrações, duas vezes a concentração final e da adição de inoculo com 50 ul / poço de modo a que o volume final / poço é 100 ul. Este método permite a um formato de painel MIC a ser produzida para o ensaio de ambos S. aureus e S. pneumoniae, porque o sangue de cavalo lisado pode ser adicionado ao inoculo. Métodos alternativos para a preparação de painéis de MIC utilizando 100 uL / ​​poço com a adição de até 10 ul / poço são descritos naCLSI e ISO procedimentos. O ponto de interrupção suscetível dalbavancin para S. aureus é ≤0.12 ug / ml (FDA folheto informativo). Como é mostrado na vigilância recente, a maioria dos isolados são inibidos por dalbavancin em níveis de 0,06 ug / ml 15. Com um ponto de interrupção suscetível perto do MIC modal, qualquer variação de MIC como resultado de diferenças de método pode afetar as taxas de susceptibilidade. Porque o procedimento de BMD para dalbavancin inclui alguns passos únicos (especificamente, o uso de DMSO na preparação de estoque e diluições do fármaco intermédios e 0,002% de P80 na MIC bem, é imperioso que o método é seguido exactamente. O organismo S. aureus QC (ATCC 29213), com uma muito clara MIC dalbavancin modal de 0,06 mg / ml, tem sido um bom indicador de variação método e deve ser usado rotineiramente para validar o método de BMD. Se os resultados MIC estão com o intervalo esperado de 0,03-,12 ug / ml, mas são tendências, quer ao baixo ou high lado desta gama, é garantido uma validação adicional do método. A adição de 0,002% de P80 é recomendada para todos os organismos relevantes Gram-positivo (staphylococcci, enterococos e estreptococos.) No entanto, é de notar que foi demonstrado que lisadas sangue de cavalo age semelhante a P-80 relativamente ao seu anti-obrigatório capacidade e que a adição de P-80 de CAMHB + LHB não tem qualquer efeito suplementar sobre os resultados de MIC dalbavancin estreptococos. Não há atualmente nenhum método de difusão em disco para testes dalbavancin e por causa da fraca correlação da DMO e os resultados AD, testes de susceptibilidade de dalbavancin usando o método AD não é recomendada 12, 14. O método de BMD devem ser utilizados para a avaliação futura do dalbavancin susceptibilidade e como um padrão-ouro para o desenvolvimento de testes comerciais de susceptibilidade aos antimicrobianos.

Dalbavancin é um lipoglycopeptide semi-sintético que foi aprovado pela FDA em Maio de 2014 no tratamento da pele e da estrutura da pele infecções bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos 1. O principal objetivo de detalhar esse método em um formato de vídeo é fornecer uma orientação clara para os cientistas de laboratório e de pesquisa clínica para testes e relatórios de resultados precisos e reprodutíveis dalbavancin suscetibilidade. A determinação de um agente antimicrobiano MIC por métodos comerciais é realizada rotineiramente em laboratórios clínicos para a avaliação da atividade in vitro de um agente contra bactérias patogênicas. O método descrito aqui é o método de microdiluição do caldo como recomendado pelo CLSI e ISO 2,3,4. Desde dalbavancin métodos de suscetibilidade comerciais não estão disponíveis no momento (no momento desta publicação) e de difusão de disco e métodos de diluição de agar não são atualmente recomendadas fou dalbavancin, métodos de diluição de caldo de referência são as atuais opções disponíveis 12,14. Como este método de referência não é um comercial e FDA apuradas in vitro método de diagnóstico, laboratórios de análises clínicas nos EUA que usar este procedimento para testes paciente deve respeitar os requisitos regulamentares para um teste de laboratório desenvolvido (LDT). Prevê-se que como a utilização dalbavancin aumenta, mais laboratórios terá uma necessidade de testar este composto. Vancomicina teste como um substituto para a determinação da susceptibilidade de S. dalbavancin aureus foi validado 5. No entanto, dalbavancin podem ser activos contra vancomicina S. intermediário aureus (VISA) e, portanto, os médicos podem solicitar resultados dalbavancin MIC. Além disso, pode ser requerida resultados de MIC para as outras espécies bacterianas. O ponto de interrupção suscetível FDA para dalbavancin contra S. aureus foi estabelecida em ≤0.12 ug / ml. FDA atribuído apenas uma suscepticategoria ble por causa da falta de dados sobre os isolados resistentes. A distribuição normal de MIC entre tipo selvagem S. aureus é entre 0,03-0,12 ug / ml, com uma MIC modal clara de 0,06 ug / ml. Uma ligeira variação nos resultados de MIC, devido ao método de diferença, para além da variação de DMO inerente de ± uma diluição, poderia potencialmente ter um impacto significativo sobre as taxas de susceptibilidade. 6 À semelhança de outros agentes lipoglycopeptide, testes de susceptibilidade dalbavancin pode ser um desafio, como resultado de solubilidade e a dimensão relativamente grande da molécula e as suas propriedades de ligação 7,8,9. O método DMO referência aqui descrito inclui dois passos específicos que são únicas para agentes insolúveis e / ou agentes lipoglycopeptide: (1) a utilização de DMSO, para preparação de soluções de reserva e (2) adição de 0,002% de P-80 no painel MIC definitiva diluições. O objetivo desta publicação de vídeo é fornecer clareza para o método BMD dalbavancin e specifically focar essas etapas-chave, para garantir resultados precisos e reprodutíveis MIC.

<table><tbody><tr><td>Dalbavancin</td><td>Metrics, Inc.</td><td>Greenville, NC</td><td>BI-397</td></tr><tr><td>Vancomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>St. Louis, MO</td><td>C5793</td></tr><tr><td>Caldo Mueller Hinton Ajustado por Cátions</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td>212322</td></tr><tr><td>Sangue de cavalo lisado</td><td>Cleveland</td><td>Scientific Bath, OH</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica Dose-it</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (Viaflo II)</td><td>Integra</td><td>Hudson, NH</td><td>4164</td></tr><tr><td>pipeta de 12 canais (Matriz)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de canal único (Ovation 10 &micro; l - 100 &micro; l)</td> <td>VistaLab</td><td>Brewster, NY</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 96 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>Monroe, NC</td><td>650161</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de fundo cônico de tampa plana de 50 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de vidro descartáveis de 16x125 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de pressão de 12x17 mm, tubos de poliestireno</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 16 ml</td><td>BioExpress</td><td>Kaysville, UT</td><td>C-3394-2</td></tr><tr><td>Reservatórios de reagentes</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td>4312</td></tr><tr><td>Esterilização descartável Loops (1 &micro; l & 10 &micro; l)</td> <td>Biologix</td><td>Lenexa, KA</td><td>65-0001,65-0010</td></tr><tr><td>Ágar de soja tríptico + 5% de sangue de ovelha</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora (ambiente)</td> <td>Incubadora Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(5% CO2)</td> <td>Balança analítica Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Luvas ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>52817</td></tr><tr><td>Jalecos</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um método de microdiluição em caldo de referência para dalbavancin<em&gt; in vitro</em&gt; teste à susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Teste de susceptibilidade antimicrobiana (AST) é realizada para avaliar a actividade in vitro dos agentes antimicrobianos contra várias bactérias. Os resultados da AST, que são expressos em concentrações inibitórias mínimas (MICs) são usados ​​em pesquisas para desenvolvimento antimicrobiana e acompanhamento do desenvolvimento de resistência e no contexto clínico para orientação terapêutica antimicrobiana. Dalbavancin é um lipoglycopeptide semi-sintético agente antimicrobiano que foi aprovado em Maio de 2014 pela Food and Drug Administration (FDA) para o tratamento da pele e da estrutura da pele infecções bacterianas agudas causadas por organismos Gram-positivos. A vantagem de dalbavancin sobre terapias anti-estafilococos actuais é a sua longa meia-vida, o que permite uma dosagem de uma vez por semana. Dalbavancin tem atividade contra Staphylococcus aureus (incluindo tanto sensível à meticilina S. aureus [MSSA] e resistente à meticilina S. aureus [MRSA]), estafilococos coagulase-negativo, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, Streptococcus grupo anginosus, estreptococos β-hemolíticos e os enterococos sensíveis à vancomicina. Tal como outros agentes lipoglycopeptide recentes, a optimização de métodos de ensaio e de caldo de susceptibilidade do CLSI ISO inclui o uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente quando se preparam soluções de reserva e de polissorbato 80 (P80) para aliviar a adesão do agente de plástico. Antes dos estudos clínicos e durante o desenvolvimento inicial de dalbavancin, estudos de susceptibilidade não foram realizados com a utilização de P-80 e os resultados de MIC tendiam a ser 2-4 vezes mais elevada e da mesma forma superior MIC resultados foram obtidos com o método de diluição em ágar susceptibilidade. Dalbavancin foi incluída pela primeira vez no CLSI tabelas metodologia caldo de microdiluição em 2005 e alterada em 2006 para esclarecer o uso de DMSO e P-80. O procedimento de microdiluição de caldo (DMO) mostrado aqui é específico para dalbavancin e está de acordo com os métodos do CLSI e ISO, com detalhe passo-a-passo e foc-nos sobre os passos críticos para maior clareza.

Métodos MIC padronizados são necessários a fim de acompanhar o desenvolvimento de resistência, um objetivo importante de vários programas de vigilância antimicrobianos. Dalbavancin resultados de MIC para isolados recolhidos na Europa e EUA em 2011-2013 eram &lt;0,25 ug / ml para 99,9% de S. aureus e 100% de estreptococos (Tabela 4). Para avaliar a importância do uso de fresco (selado) DMSO, testes triplicado de MICs BMD dalbavancin para QC estirpes S. aureus ATCC 29213, e E. faecalis ATCC 29212 e duplicação de ensaios para S. pneumoniae ATCC 49619 foi realizada utilizando (1) de DMSO a partir de ampolas selados, (2) de DMSO a partir de um frasco de 1 L que estava dentro da data de expiração e que tinha sido utilizado anteriormente para 2 anos e (3) uma alíquota de DMSO a partir do mesmo de 1 L garrafa (amostra 2) que foi deixada em repouso num copo aberto durante 72 h antes da utilização. Dalbavancin resultados MIC usando painéis feitos com todas as três amostras de DMSO foram semelhantes e Within as gamas aceitáveis ​​QC (Tabela 5). A perda de actividade dalbavancin após a exposição da solução de estoque de plástico e sem a adição de P-80 tem sido bem documentada 7. Em 2 estudos adicionais, a adição de P-80 para as soluções iniciais e intermédios banco (Tabela 6) e a utilização de tubos de vidro ou de plástico para a preparação das soluções stock iniciais e intermédios (Tabela 7) não tem um efeito sobre os resultados dalbavancin microfone. Também não houve efeito no resultado do MIC dalbavancin quando polipropileno e poliestireno placas de três fabricantes foram utilizados (Tabela 7). A presença de sangue de cavalo lisado nos meios de caldo para testes de estreptococos foi demonstrado que possuem uma actividade surfactante semelhante, comparável à P-80 7, 8. O método de referência dalbavancin para Streptococcus não incluem o cavalo de sangue P-80 e lisadas ,No entanto, ao contrário de estafilococos e enterococos, dalbavancin resultados de MIC para estreptococos são semelhantes (dentro de +/- 1 de diluição) com e sem a adição de P-80. Tal como foi apresentado anteriormente e mostrado na Figura 1, diluição de agar dalbavancin (AD) MICs são tipicamente 2-8 vezes mais elevada em comparação com a corrente de referência DMO 12, 13, 14. Ao contrário de BMD, a adição de 0,002% de P-80 não faz AD afetam dalbavancin MIC resulta 12. <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028eq1.jpg" /> Equação 1: Exemplo de Dalbavancin solução Stock Preparação etapas de preparação para 25 ml de 800 mg / ml solução dalbavancin.. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53028/53028fig1.jpg" /> Figura 1. Comparação de Dalbavancin e Vancomicina BMD para AD. Os resultados do estudo que comparou dalbavaNCIN e vancomicina BMD e AD MIC resultados para selecionar isolados bacterianos Gram-positivas. Médio (A) Dalbavancin e (B) Vancomicina de microdiluição em caldo e ágar de diluição MIC resulta em ug / ml para 15 Staphylococcus aureus, 8 coagulase negativa estafilococos (SNC), 5 Enterococcus faecalis e 14 Streptococci (Grupos A, B, e C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53028/53028fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> UMA </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL; 0.06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> B </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> C </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> D </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> E </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td&gt; <td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> F </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> G </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0.5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td> H </td><td> DAL 0,002 </td><td> DAL 0,004 </td><td> DAL 0,008 </td><td> DAL 0,015 </td><td> Dal 0,03 </td><td> DAL 0,06 </td><td> DAL 0,12 </td><td> DAL 0,25 </td><td> DAL 0,5 </td><td> DAL 1 </td><td> DAL 2 </td><td> Pos Ctrl. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> DAL </td><td colspan="2"> Dalbavancin </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td&gt; </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="12"> As concentrações são expressas em ug / ml depois de 50 ul / poço a inoculação </td></tr></tbody></table> Tabela 1. MIC Formato de placa. O formato de placa de 96 mostrando a localização de diluições dalbavancin e poços de controlo positivo utilizado como um exemplo na presente publicação vídeo <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Fonte Conc. (ug / ml) </td><td> Fonte Volume (ml) </td><td> DMSO Volume (ml) </td><td> Conc intermediário. em DMSO (ug / ml) </td><td> Volume Intermediário Conc. (ml) </td><td> Volume CAMHB + 0,004% P80 * (ml) </td><td> 2X Conc. Depois de diluição 1: 100 em CAMHB (ug / ml) </td><td> Final Conc Panel. Após a inoculação (ug / ml) </td></tr><tr><td> 800 </td><td> 1.0 </td><td>1.0 </td><td> 400 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 4 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 200 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td><td> 100 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 400 </td><td> 0,5 </td><td> 3,5 </td><td> 50 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,5 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 25 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,25 </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td><td> 12,5 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,125 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 0,5 </td><td> 3,5 </td><td> 6.25 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 &lt;/ td&gt; <td> 0,5 </td><td> 3.13 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td><td> 1,5 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 6.25 </td><td> 0,5 </td><td> 3,5 </td><td> 0,8 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,008 </td><td> 0,004 </td></tr><tr><td> 0,8 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td><td> 0,02 </td><td> 1.98 </td><td> 0,004 </td><td> 0,002 </td></tr><tr><td colspan="5"> Este quadro foi modificado a partir do CLSI M100-S25, Tabela 8B 3 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2. Esquema de Preparação de diluições de Agentes Antimicrobianos insolúvel em água para ser usado em Caldo diluições Suscetibilidade Testing. Os volumes de soluções de trabalho dalbavancin e diluentes para a preparação do MIC definitivasoluções dalbavancin de 0,002-2 ug / ml. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Estirpe de controlo de qualidade </td><td> Esperado Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0,03-0,12 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,008-0,03 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Resultados Esperados Dalbavancin MIC para controle de qualidade Estirpes 3, 11. CLSI resultados de controlo de qualidade para as estirpes sugeridas a ser testado juntamente com isolados clínicos, a fim de verificar a metodologia adequada <img alt="Tabela 4" src="/files/ftp_upload/53028/53028table4.jpg" /> Tabela 4. Distribuição de Dalbavancin Resultados MIC (Número de cada MIC) dos EUA e Europeia 2011-2013 Surveillance Study 15. Dalbavancin resultados de MIC de um estudo publicado de isolados clínicos recentes como um indicador de corrente dalbavancin actividade in vitro. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup></colgroup><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolar # </td><td colspan="3"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DMSO 1 </td><td> DMSO 2 </td><td> DMSO 3 </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 0,12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0,12 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td rowspan="2"><em&gt; S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 1 = chama Unopened selado ampolas de 10 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO 2 = 1L garrafa aberta Frequentes </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> DMSO 3 = 1L garrafa aberta frequentes - sentou-se no banco no copo descoberto durante 72 horas </td></tr></tbody></table> Tabela 5. Resultados Dalbavancin CIM (ug / ml) utilizando DMSO e da Intermediate diluições Preparação com DMSO a partir de 3 Sources. Os resultados de um estudo que comparou MIC dalbavancin efeito do uso de diferentes solventes DMSO na preparação do estoque dalbavancin e diluições intermediárias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Isolar Número </td><td rowspan="2"> Número replicar </td><td colspan="2"> Dalbavancin MIC (ug / ml) </td></tr><tr><td> DALB w / P80 em DMSO </td><td> DALB w / o P80 em DMSO </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. aureus DP80-002SA clínica </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. aureus ATCC 700699 </td><td> 1 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td rowspan="4"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td>S. pyogenes clínicos: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-004PY </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-005PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-006PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> DP80-007PY </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-008PY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> S. agalactiae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-009AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,12 </td></tr><tr><td> DP80-010AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-011AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-012AG </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> S. dysgalactiae clinical DP80-013DY </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> S. pneumoniae clínica: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DP80-014SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> DP80-015SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-016SP </td><td> 1 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> DP80-017SP </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Resultados Dalbavancin MIC utilizando DMSO e da Intermediate diluições Preparação com e sem 0,002% P-80. Resultados de um estudo que comparou MIC dalbavancin efeito da adição de 0,002% P-80 para dalbavancin estoque e diluições intermediárias. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="3"> Isolar </td><td rowspan="3"> Número replicar </td&gt; <td colspan="4" rowspan="2"> Diluição da Tubes </td><td colspan="4"> Microplaca (Tipo de plástico) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Poli-propileno, Greiner </td><td colspan="3"> Poliestireno </td></tr><tr><td> Vidro </td><td> Plástico </td><td> 1hr plástico </td><td> 1hr plástico / 1hr Intermediate </td><td> Greiner </td><td> Corning </td><td> Nunc </td></tr><tr><td rowspan="3"> S. aureus ATCC 29213 </td><td> 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="3"> E. faecalis ATCC 29212 </td><td&gt; 1 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td><td> 0,03 </td><td> 0.06 </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td rowspan="2"> S. pneumoniae ATCC 49619 </td><td> 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,015 </td><td> 0,008 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td colspan="10"> Vidro = estoque inicial feita em garrafa de vidro, usado imediatamente para tornar a concentração intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer diluições caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> Estoque de plástico = inicial feita em tubo de centrífuga de plástico, usado imediatamente para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer diluições caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> 1 hr = estoque inicial de plástico feito em tubo de centrífuga de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, utilizados imediatamente para fazer concentrações em caldo. </td></tr><tr><td colspan="10"> 1 hr Intermediário 1 hr = estoque de plástico / inicial feita em tubo de centrífuga de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer concentrações intermediárias em tubos de plástico, vamos sentar no banco durante 1 hora, em seguida, usado para fazer as concentrações em caldo. </td></tr></tbody></table> Tabela 7. Resultados Dalbavancin MIC utilizando diluições da preparação em plástico e vidro Tubos e MIC tipos de chapas de plástico. Resultados ofa dalbavancin estudo MIC que, em comparação efeito do uso de tubos de plástico ou de vidro na preparação das soluções de reserva e também efeito da utilização de diferentes fontes e tipos de plástico para placas de microtitulação.

Aqui, apresentamos um protocolo para determinação da suscetibilidade à dalbavancina de bactérias Gram-positivas clinicamente relevantes usando uma metodologia de referência de microdiluição em caldo.

Um método de microdiluição em caldo de referência para Dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Teste à Susceptibilidade de bactérias que crescem aeròbia

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é determinar a concentração inibitória mínima para a dalbavancina. Para isso, utiliza-se o método de microdiluição em caldo, com foco nas etapas principais que são exclusivas da dalbavancina. As diluições estoque e intermediária da dalbavancina são preparadas em DMSO, e a diluição final é feita em caldo Mueller Hinton ajustado em cátions, suplementado com polissorbato.As diluições são distribuídas em uma placa de 96 poços e inoculadas com uma suspensão padronizada de bactérias. Em seguida, a placa é incubada por 16 a 24 horas e examinada para determinar a quantidade mínima de dalbavancina necessária para inibir o crescimento bacteriano. A adesão a este método padronizado garantirá resultados consistentes tanto com isolados clínicos quanto, como mostrado aqui, com isolados de controle de qualidade. A dalbavancina é um agente antimicrobiano semissintético do grupo dos lipoglicopeptídeos, aprovado em maio de 2014 pela FDA para o tratamento de infecções bacterianas agudas da pele e estruturas cutâneas causadas por organismos gram-positivos.Este método descreve o método padronizado de suscetibilidade em caldo, microdiluição para dassin, que inclui o uso de DMSO para preparar soluções estoque em polissorbato 80, a fim de reduzir a aderência do agente ao plástico. A demonstração visual deste método é útil, especialmente porque os passos de preparação das soluções estoque e da placa de MIC não são típicos em comparação com a maioria dos agentes antimicrobianos. Esses passos são específicos para agentes lipoglicopeptídicos e são importantes para se seguir a fim de obter resultados de MIC reprodutíveis e precisos.A demonstrar o procedimento será Gina Fisher, cientista pesquisadora do meu laboratório. Observe que precauções de segurança apropriadas, compatíveis com o nível de biossegurança dois, devem ser utilizadas ao realizar o procedimento a seguir. Comece pesando a quantidade apropriada de dalbavancina para preparar uma solução estoque de 800 microgramas por mililitro.Adicione a quantidade apropriada de DMSO NEAT a um tubo de vidro ou plástico estéril, em seguida transfira o pó para o tubo e vortex. A seguir, utilizando a solução estoque de DALBAVANCINA a 800 microgramas por mililitro, prepare concentrações intermediárias a 100 vezes a concentração final da placa de MIC, conforme indicado nas colunas um a quatro. Essas são denominadas concentrações intermediárias.O volume total preparado dependerá do número de placas de MIC. Por fim, dilua as concentrações intermediárias em uma proporção de um para 100 em caldo Mueller Hinton sem ajuste de cátions, também conhecido como C-A-M-H-B, suplementado com 0,004% P 80. A concentração de trabalho resultante de DALBAVANCINA e P 80 é duas vezes a concentração final.Como a adição do inóculo resultará em uma diluição de um para dois, utilize uma pipeta multicanal com ponteiras estéreis para dispensar 50 microlitros de cada diluição de dalbavancina nos poços apropriados da placa de microdiluição estéril de 96 poços. O formato da placa de MIC permite testar oito inóculos por placa. Caso as placas não sejam usadas imediatamente, cubra-as com filme plástico, coloque-as em sacos plásticos e armazene-as em um congelador sem função de descongelamento a, no mínimo, menos 60 graus Celsius até o momento do uso.Nesta demonstração, uma placa recém-preparada será inoculada. Para preparar o inóculo, selecione várias colônias bem isoladas de uma placa de ágar sangue ou outro ágar não seletivo com 18 a 24 horas de crescimento. Aqui, são utilizadas cepas de controle de qualidade de *S. aria* e *EPHI*.Toque a parte superior de cada colônia com um swab estéril e transfira um pouco do material para um tubo contendo um a cinco mililitros de C-A-M-H-B ou solução salina. Continue transferindo até que a turbidez corresponda a um padrão de 0,5 de McFarland dentro de 15 a 30 minutos após a preparação; dilua o inóculo de um para 100 em C-A-M-H-B para obter uma concentração final de cinco vezes 10 à quinta UFC por mililitro. A faixa aceitável é de duas a oito vezes 10 à quinta UFC por mililitro.Imediatamente, utilizando uma pipeta multicanal com ponteiras estéreis, transfira 50 microlitros do inóculo final para cada poço apropriado da placa do painel de MIC aqui. Quatro linhas são inoculadas com cada um dos dois isolados, totalizando quatro repetições por isolado. Em seguida, para realizar uma verificação de pureza, use uma pipeta para transferir de um a 10 microlitros da solução no controle positivo de crescimento para um ágar não seletivo, como ágar soja triptona com 5% de sangue de ovelha.Use um alça estéril para espalhar a solução sobre a superfície da placa. Gire a placa 90 graus e risque novamente para garantir que o inóculo seja distribuído uniformemente. Tampe a placa e coloque-a de lado.Em preparação para uma contagem de colônias, use uma pipeta de canal único para transferir 10 microlitros da solução no poço controle de crescimento para 10 mililitros de solução salina, e então transfira 100 microlitros para um meio ágar não seletivo apropriado, como ágar triptona soja com 5% de sangue de ovelha, utilizando um alça estéril, espalhando a solução por toda a superfície do ágar. Repita este processo duas vezes em direções diferentes para garantir uma distribuição uniforme do inóculo. Em seguida, empilhe até quatro placas de MIC em um recipiente plástico, assegurando que a placa superior esteja bem vedada com uma tampa.Em seguida, coloque uma toalha de papel úmida dentro do recipiente plástico e feche-o firmemente com a tampa no prazo de 30 minutos após a inoculação. Incube as placas de concentração inibitória mínima (CIM), a placa de contagem de colônias e a placa de verificação de pureza em estufa com ar ambiente a 35 mais ou menos dois graus Celsius por 16 a 20 horas. No dia seguinte, leia a concentração inibitória mínima como a menor concentração que inibe completamente o crescimento bacteriano nos poços, conforme detectado a olho nu.Determine o número de colônias no placa de contagem de colônias. Multiplique o número obtido pelo fator de diluição. Por exemplo, 50 colônias vezes um fator de diluição de 10,000 equivale a cinco vezes 10 elevado à quinta UFC por mililitro.Uma faixa aceitável é de 20 a 80 colônias, o que equivale a duas a oito vezes 10 elevado à quinta unidade formadora de colônia por ml. A concentração do inóculo é uma variável importante para controlar o teste de suscetibilidade, a fim de obter resultados precisos. Por fim, verifique a placa de pureza.Se todas as colônias forem semelhantes às colônias utilizadas como inóculo, então pode-se considerar a cultura pura. Se houver quaisquer outras colônias presentes, existe a possibilidade de um contaminante estar presente no painel de MIC, e o teste deve ser repetido. Os resultados de MIC de DAL bevans foram comparados aos obtidos utilizando o método de diluição em ágar, conforme mostrado aqui.Os resultados de MIC em ágar para Dal bevans são tipicamente de duas a oito vezes maiores do que em caldo. Resultados de MIC por microdiluição. Esse contraste ocorre com os resultados de vancomicina, que são obtidos por métodos de caldo e de ágar.Portanto, a diluição em caldo agri não é recomendada para o teste de dalbavancina. Os resultados da MIC por microdiluição para controle de qualidade devem estar dentro dos intervalos esperados, conforme mostrado aqui. O organismo controle de qualidade SS, A TCC 2 9 2 1 3, com uma MIC modal muito clara de 0,06 microgramas por mililitro, tem sido um bom indicador da variação do método.Se os resultados obtidos estiverem fora das faixas esperadas para os organismos de controle de qualidade ou se estiverem se aproximando de uma das extremidades da faixa, é necessário realizar uma validação adicional do método. Além de validar o método utilizando organismos de controle de qualidade, dados de vigilância antimicrobiana regional sobre dalbavancina, como os valores de MIC, podem fornecer uma base para os resultados de MIC esperados em laboratórios clínicos. Como mostrado aqui, os resultados de MIC da dalbavancina para isolados coletados na Europa e nos EUA entre 2011 e 2013 foram inferiores a 0,25 microgramas por mililitro para 99,9% das SIUs e 100% dos estreptococos. Com base nesses dados de vigilância, é evidente que resultados de MIC de dalbavancina para estafilococos e estreptococos superiores a 0,12 microgramas por mililitro são raros.Se forem observados valores mais altos, o teste deve ser repetido e/ou encaminhado a um laboratório de referência para validação. O preparo da diluição estoque em DMSO e a adição de P 80 ao caldo de diluição numa concentração de 0,002% na poça final de MIC são etapas críticas para obter resultados precisos e reprodutíveis de MIC da dalbavancina. Como sempre, mas especialmente nesta área do desenvolvimento de resistência bacteriana, resultados precisos de suscetibilidade antimicrobiana são fundamentais para a escolha do clínico quanto à terapia apropriada.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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