Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o papel da raiz de perfusão na otimização da homogeneidade da descelularização da perfusão hepática de ratos. Isso é conseguido primeiro canulando as veias portais e as artérias hepáticas de fígados de ratos recém-isolados. Como segundo passo, os fígados são conectados a um dispositivo de perfusão para perfusão seletiva das veias portais ou das artérias hepáticas.

Em seguida, as mudanças de pressão oscilante são aplicadas à câmara de perfusão para imitar as mudanças de pressão intra-abdominal que ocorrem durante a respiração. Otimizando a microperfusão hepática, em última análise, os fígados perfundidos através da artéria hepática sob condições de pressão oscilante exibem uma descelularização mais homogênea e rápida, avaliada por observação macroscópica e análise histológica e bioquímica. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a descelularização da perfusão venosa portal, é que a perfusão arterial usando condições de pressão oscilante leva a um resultado de descelularização mais homogêneo.

Em um tempo mais curto, porém, esse método pode fornecer informações sobre técnicas de desaceleração. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como experimentos de solarização de res, configurações de perfusão extraoral e modelos de órgãos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque a colheita e a canulação arterial de fígados vermelhos podem ser complicadas.

Antes de colher o fígado, faça um corte oblíquo até a extremidade de um pedaço de 1,5 centímetro de um cateter venoso G 20 periférico. Conecte o cateter a uma torneira de parada de três vias e use uma seringa de 10 mililitros cheia de solução de campainha para arejar o sistema. Em seguida, corte a agulha de uma cânula borboleta com um comprimento de cinco milímetros e use super cola para fixar um tubo de cinco centímetros na agulha.

Insira um tubo de dois centímetros de comprimento no tubo maior e fixe esse tubo com super cola também. Deslize outro tubo sobre esta construção e cole-o no lugar para criar um pilar. Em seguida, use uma seringa de cinco mililitros cheia de solução de campainha para remover a cânula arterial recém-construída para reparar o fígado para a colheita.

Comece usando curativo de causa úmida para segurar os lobos medial e esquerdo do fígado de um cran de rato adulto anestesiado sob a cúpula do diafragma. Exponha o ligamento duodenal hepato e o lobo superior do fígado também neste momento. Em seguida, use duas micropinças e uma tesoura de mola para dissecar cuidadosamente o ligamento preso ao lobo omental superior até que o lobo seja móvel.

Em seguida, mantendo os lobos medial e esquerdo no lugar. Use cotonetes úmidos para mover o lóbulo sob a compressa do GRE e o estômago para a esquerda do animal. Fixe o estômago com uma pinça e disseque o momento menor.

Em seguida, disseque o lobo inferior ou mentoniano do fígado até que ele seja móvel e mova o lobo de volta para sua cavidade usando uma pinça de backhouse para reter o duodeno, mova o duodeno para a esquerda para expor o ligamento duodenal herpa. Circunscrever o ducto colédoco. Em seguida, disseque o ducto biliar do tecido adiposo e pancreático, cortando o ducto a 1,5 centímetros da bifurcação do ducto biliar.

Disseque a veia sal do tecido adiposo circundante, expondo a veia gastroduodenal. Em seguida, ligue a veia gastroduodenal duas vezes com seis pontos zero e divida a veia entre os dois nós. Disseque o tronco celíaco e a artéria hepática comum do tecido circundante até que todos os ramos arteriais sejam revelados.

Depois que todas as artérias tiverem sido dissecadas, circunscreva a veia cava inferior entre o rim direito e o lobo lateral direito do fígado e disseque a veia do espaço retroperitoneal. Siga o tronco celíaco para expor a aorta. Em seguida, disseque o tecido adiposo retroperitoneal e circunscreva a aorta acima do tronco celíaco.

Agora injete 1000 unidades de heparina em um mililitro de solução salina no espeleólogo da veia inferior. Cubra a incisão com um algodão e espere de um a dois minutos para que a heparina faça efeito. Em seguida, circunscreva a aorta com uma pinça e disseque a aorta e a veia inferior distalmente do rim.

Para colocar a cânula venosa portal, faça uma incisão boca de peixe na veia porta distal e abra a incisão com uma pinça. Em seguida, canule a veia porta e lave o fígado com 20 mililitros de solução de ringer até que o fígado se desumanize Usando seda seis ligaduras zero para fixar a cânula no lugar. Para colocar a cânula arterial, dissecar a aorta acima do tronco celíaco até que o segmento da aorta possa ser liberado do espaço retroperitoneal.

Corte o segmento da aorta longitudinalmente para gerar um remendo aórtico e insira a cânula autoconstruída em um suporte estático. Em seguida, use duas pinças para deslizar o remendo aórtico sobre a cânula e ligue a artéria hepática com uma sutura de seda a seis zero sobre a cânula. Fixação do adesivo no pilar para realizar a descelularização Conecte a torneira de três vias na cânula da veia porta ao acesso do reator relacionado e conecte a cânula arterial ao acesso arterial, tomando cuidado para que nenhum ar entre nos sistemas.

Em seguida, conecte o respirador à câmara de distribuição de pressão e conecte a câmara ao reator. Inicie a aplicação de pressão. Em seguida, para iniciar a descelularização.

Funda o fígado com 1%tritton X 100 a uma taxa de cinco mililitros por minuto. Permita que o efluente residual através do fluxo de saída do dispositivo de perfusão mantenha o nível de fluido dentro da câmara de perfusão constante e acima do fígado perfundido. Após 90 minutos, troque o detergente para fígados 1% SDS perfundidos através da veia de força exibem em elucidação homogênea, indicando descelularização com células remanescentes macroscopicamente visíveis durante e após o processo, enquanto fígados perfundidos através da artéria hepática demonstram um curso de descelularização mais homogêneo com células remanescentes menos visíveis.

Se os fígados foram perfundidos com a aplicação de condições de pressão oscilante, nenhuma célula remanescente foi visível. Independentemente da perfusão. A avaliação histológica radicular das matrizes hepáticas descelularizadas apóia os achados macroscópicos de fato em fígados perfundidos pela artéria hepática.

Não são observadas células remanescentes, sejam elas perfundidas em condições de pressão oscilante ou não, fígados perfundidos através da veia porta, no entanto, exibem zonas de células remanescentes, mesmo que sejam perfundidas em condições de pressão oscilante, embora essas condições reduzam a massa celular remanescente nesses fígados, note-se, a preservação das matrizes extracelulares dos fígados independentemente das condições de descelularização. O conteúdo de DNA por peso seco da matriz hepática também diminuiu em todos os grupos experimentais em comparação com fígados nativos. Embora as diferenças tenham sido estatisticamente significativas apenas na perfusão do grupo sob condições de pressão oscilante.

Além disso, a fundição por corrosão das matrizes hepáticas descelularizadas confirmou a preservação da microanatomia do fígado durante o processo de perfusão. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colher fígados vermelhos canulados e perfundidos para uma desaceleração homogênea reprodutível. Não se esqueça de que trabalhar com Triton X 100 e SDS pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas também devem ser tomadas ao realizar este procedimento.