Name: Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprenda a decelularização de fígados de rato usando um dispositivo de perfusão com pressão oscilante. Este método otimiza a homogeneidade da decelularização arterial para engenharia de tecidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens e Katharina Struecker por sua ajuda durante este projeto.

Os animais foram mantidos no Centro de Medicina Experimental (FEM, Charité, de Berlim, Alemanha), e todos os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Secretaria de Estado da Saúde e Assuntos Locais (LAGeSo, Berlim, Alemanha; Reg. No. 0365 O / 11). Colheita 1. Fígado <ol><li> Preparação pré-cirúrgica <ol><li> Use uma placa de cortiça para fixação. Coloque uma cortina médico sobre a placa. Usando quatro agulhas, fixar uma máscara de inalação na placa de cortiça para narcose intraoperatória inalação. </li></ol></li><li> Prearrangement do Portal venosa cânula <ol><li> Conecte-se um cateter venoso periférico (G 20) a uma torneira de três vias. O cateter venoso deve ser cortado obliquamente, com um comprimento de aprox. 1,5 cm. </li><li> De-ar do sistema usando uma seringa de 10 ml cheia com solução de Ringer. É muito importante para cuidadosamente-air de embolia gasosa, porque pode afetar negativamente o decellularization perfusão. </li></ol></li><li> Prearrangementda cânula arterial <ol><li> Usar uma cânula borboleta e cortar a agulha com um comprimento de 5 mm. Instale um tubo de 5 centímetros (ID 0,58 milímetros; OD 0,96 milímetros) para a agulha 5 mm e corrigi-lo com supercola. Inserir um tubo 2 cm de comprimento (ID 0,28 milímetros; OD 0,61 milímetros) para dentro do tubo maior e corrigi-lo com supercola. </li><li> Deslizamento outro tubo sobre essa construção como um pilar e corrigi-lo com supercola. De-ar da cânula arterial com uma seringa de 5 ml cheio com solução de Ringer. </li></ol></li><li> Anestesia e Analgesia <ol><li> Induzir narcose do rato na câmara de indução da anestesia de 3,5% de isoflurano em oxigénio a um caudal de 1,5 L / min. </li><li> Para assegurar a analgesia segura durante a operação, metamizol injectar (100 mg / kg de massa corporal) e a cetamina em dose baixa / medetomidina (10 mg / 0,1 mg por kg de massa corporal) por via intraperitoneal. </li><li> Fornecer 1,5% de isoflurano em 1 L / min de oxigênio via máscara de inalação para posterior manutenção da anestesia cirúrgica. </li></ol></li><li> Arranjos pré-operatórios &lt;ol&gt; <li> Raspar o abdômen liberalmente com uma máquina de corte elétrica. Humedecer o local da incisão no abdómen rapado com etanol a 70% para desinfecção. </li><li> Colocar o animal em decúbito dorsal sobre a placa preparado, insira a cabeça para dentro da máscara de inalação e corrigir os membros com fita adesiva médica e pinos. Retire o excesso de etanol e de pele com uma compressa de gaze. </li></ol></li><li> Avaliação anestesia <ol><li> Avaliar a profundidade da anestesia, observando a freqüência respiratória. Quando a anestesia parece suficientemente profundo (40-60 respirações / min), verifique se a analgesia é suficiente, tentando provocar o reflexo toe pitada usando uma pinça cirúrgica para comprimir a pele entre os dedos de ambas as patas traseiras. </li></ol></li><li> Abordagem abdominal <ol><li> Adicione uma incisão mediana na parede abdominal caudal acima da bexiga. Cortar a partir deste ponto para ambos os arcos hipocôndrios de uma maneira em forma de V. Tome cuidado para não cortar o diafragma. Puxe a parede abdominal corte sobre o peito. </li&gt; <li> Fixar o xifóide com uma braçadeira Overholt, puxe-cranial e corrigi-lo com um elástico. Use cotonetes molhados para evacuar o intestino. Enrole intestino em uma atadura de gaze molhada. Além disso, cobrir todas as margens abdominais com compressas húmidas. </li></ol></li><li> Preparação fígado <ol><li> Dissecar o ligamento falciforme. Use uma atadura de gaze molhada para manter os lobos hepáticos medial e cranial esquerda sob a cúpula do diafragma. Expor o ligamento hepatoduodenal eo lóbulo do fígado omental superior. </li><li> Use duas micropinças e tesoura primavera para dissecar cuidadosamente o ligamento anexado ao lobo omental superior até que o lobo é móvel. Mova o lobo usando cotonetes molhados sob a compressa de gaze, segurando os lobos medial e deixados no local. </li><li> Depois de mobilização do lóbulo do fígado omental superior, passar do estômago para a esquerda. Fixar o estômago com uma braçadeira e dissecar o omento menor com micropinças e os tesoura primavera. </li><li> Mobilizar a omentos menorl lóbulo do fígado até que ele é móvel e, posteriormente, mover o lobo de volta em sua cavidade. Usar uma braçadeira Backhaus para reter o duodeno. Mover o duodeno para a esquerda para esticar e expor o ligamento hepatoduodenal. Circunscrever o ducto biliar comum no ligamento hepatoduodenal esticado. </li><li> Dissecar o ducto biliar do tecido adiposo e no pâncreas. Corte o ducto biliar 1,5 cm do bifurcação do ducto biliar. Dissecar a veia porta a partir do tecido adiposo circundante. Expor a veia gastroduodenal. </li><li> Ligadura da veia gastroduodenal duas vezes com seda 6-0 e dividir a veia entre as duas ligaduras. Dissecar o tronco celíaco e da artéria hepática comum do tecido circundante até que todos rami arterial são revelados. </li><li> Libertar a artéria gastroduodenal a partir do tecido circundante. Ate a artéria gastroduodenal duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes um do outro. Dissecção da artéria gastroduodenal entre as duas ligaduras. </li><li> Libere a artéria esplênicaa partir do tecido circundante. Amarre a artéria esplênica duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes uns dos outros. Dissecção da artéria esplênica entre as duas ligaduras. </li><li> Libertar a artéria gástrica esquerda a partir do tecido circundante. Amarre a artéria gástrica esquerda duas vezes com seda 6-0, com os laços distantes uns dos outros. Dissecção da artéria entre as duas ligaduras. </li><li> Circunscrever a veia cava inferior entre o rim direito e no lobo hepático lateral direito. Dissecar a veia do espaço retroperitoneal. Expor a aorta, seguindo o tronco celíaco. </li><li> Dissecar o tecido adiposo retroperitoneal. Injectar 1000 IE de heparina em 1 ml de solução salina na veia cava inferior. Retrair a cânula e fechar a incisão com um algodão. Espera 1-2 min para o efeito sistémico de heparina. </li><li> Circunscrever a aorta com uma pinça. Dissecar a aorta e desangrar o rato. Além disso, dissecar a veia cava inferior distalmente a partir do rim. </li></ol></li><li> Portal venoso Canulação (Use a cânula preparada na secção 1.2) <ol><li> Faça uma incisão na boca peixe na veia portal distal. Abra a incisão com uma pinça e canular a veia porta. Lave o fígado com 20 ml de solução de Ringer até os descolore fígado e fixar a cânula com ligaduras de seda (6-0). </li></ol></li><li> A canulação arterial (Use a cânula preparada no ponto 1.3) <ol><li> Dissecar a aorta acima do tronco celíaco. Libere o segmento de aorta a partir do espaço retroperitoneal. Corte o segmento de aorta longitudinalmente para gerar um remendo aórtico. Insira a cânula auto-construído em um suporte estático. </li><li> Use uma pinça para deslizar 2 a correção da aorta através da cânula. Ligadura da artéria hepática com seda 6-0 sobre a cânula e corrigir o patch no pilar. </li></ol></li><li> Explantation fígado <ol><li> Abra o diafragma, fazer uma incisão circular e dissecar o fígado a partir das estruturas circundantes. </li></ol></li><li> Armazenamento <ol><li> Store o fígado num tanque estéril de 500 ml cheio com 350 ml de solução de Ringer até à sua utilização. </li></ol></li></ol> 2. As soluções de detergentes <ol><li> Solução Triton X-100 estoque 10% <ol><li> Encha uma garrafa de 1000 ml com 900 ml água destilada. e adiciona-se 100 ml de Triton X-100 (99,9%). Usar um agitador para dissolver o Triton X-100. Encha a garrafa com água destilada. até um volume total de 1000 ml foi atingido. </li></ol></li><li> 1% de Triton X-100 <ol><li> Adiciona-se 100 ml da solução de reserva (10%) a um frasco de 1000 ml. Adicionar 900 ml de água destilada. e agitar o frasco duas vezes. Filtra-se a solução a 1% de Triton X-100 através de um filtro estéril. </li></ol></li><li> SDS a 10% da Solução <ol><li> Encha uma garrafa de 1000 ml com 900 ml água destilada. e adicionar 66,99 g de SDS (99,9%, densidade 0,67). Usar um agitador para dissolver o SDS. Encha a garrafa com água destilada. até um volume total de 1000 ml foi atingido. </li></ol></li><li> SDS a 1% <ol><li> Adiciona-se 100 ml da solução de reserva (10%) de um bot de 1000 mlTLE. Adicionar 900 ml de água destilada. e agitar o frasco duas vezes. Filtra-se a solução de SDS a 1%, através de um filtro estéril. </li></ol></li></ol> 3. Decelularização <ol><li> Set-up de Perfusão Dispositivo <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> Figura 1:. Esquema do aparelho de perfusão para a Seletiva Arterial e Venoso Portal Perfusão de quatro fígados de rato sob oscilantes Condições Pressão (. Modificado a partir Struecker et al 14) <ol><li> Vincular o dreno para uma torneira de três vias e uma extensão Heidelberger para regular o nível de preenchimento e preencha o reactor com 500 ml de NaCl 0,9%. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> Figura 2:. Esquema da perfusão set-up Ligar a câmara de perfusão (1,400 centímetros 3) (1) à extremidade distai (4) do borbulhador (5) através do acesso venoso portal (2) ou por meio da ac arterialcesso (3). O borbulhador (5) deve ser equipado com uma obturação (4), na extremidade distai e uma abertura (6). Ligue o borbulhador (5) para uma extensão de Heidelberger (7). Ligar a extensão Heidelberger para o segmento de bomba (8). Além disso, ligar o segmento de bomba (8) para o outro ramal de Heidelberger (9). Inserir a última extensão Heidelberger (9) para dentro do frasco de detergente (10). Ligue o respirador (11) para a câmara de perfusão (ou para o distribuidor de pressão no caso de múltiplas perfusões). Para drenar os fluidos do reator, conecte a saída para o frasco de resíduos (12). <ol><li> Inserir o segmento de bomba para dentro da bomba. Iniciar a bomba para encher o ciclo com PBS, fechar a extremidade distal do borbulhador e abrir o respiradouro. Quando o fundo da bolha está firmemente coberto com PBS (03/02 centímetros), a fechar a abertura e abrir a extremidade distal do borbulhador. </li><li> Instalação de fígado <ol><li> Ligar a torneira de três vias da cânula da veia porta para o reactor de acesso relacionados. CONECTE da cânula arterial para o acesso arterial. Tenha cuidado para garantir que nenhum ar entra nos sistemas. </li></ol></li><li> Aplicação de oscilantes Condições Pressão <ol><li> Use uma máscara com uma frequência de 15 bpm e uma amplitude de 26 mbar (min. 4 mbar, 30 max. Mbar). Ligue o respirador para a câmara de distribuição de pressão e ligar a câmara ao reactor. Iniciar a aplicação de pressão. </li></ol></li><li> Decelularização Protocolo <ol><li> Execute as etapas de perfusão com um caudal de 5 ml / min. Iniciar a descelularização com a perfusão do fígado com 1% de Triton X-100 durante 90 min. Permitir effluence resíduos através do fluxo de saída do dispositivo de perfusão para manter o nível do fluido no interior da câmara de perfusão e constante sobre o fígado perfundido. Após 90 min, alterar o detergente a 1% de SDS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;p&gt; Figura 3: Protocolo de Perfusão para todos os grupos experimentais.

<ol><li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+support+strategies%3A+cutting-edge+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+scaffolds+effectively+support+the+proliferation+and+differentiation+of+mouse+fetal+hepatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors.</a> J Biomed Mater Res A. , (2013).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+decellularization+of+intact+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Method for the decellularization of intact rat liver.</a> Organogenesis. 6, 134-136 (2010).</li>
<li>Bao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+portal+implantable+functional+tissue-engineered+liver+using+perfusion-decellularized+matrix+and+hepatocytes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats.</a> Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).</li>
<li>Baptista, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+whole+organ+decellularization+for+the+generation+of+a+vascularized+liver+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid.</a> Hepatology. 53, 604-617 (2011).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-organ+regenerative+medicine+approach+for+liver+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).</li>
<li>De Kock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+quick+method+for+whole-liver+decellularization%3A+a+novel+in+vitro+three-dimensional+bioengineering+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+toxicology%22%5BJournal%5D)">Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool.</a> Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).</li>
<li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+proceedings%22%5BJournal%5D)">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li>
<li>Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+liver+as+a+practical+scaffold+with+a+vascular+network+template+for+liver+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering.</a> J Biosci Bioeng. , (2012).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions%3A+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Embora a técnica apresentada para a colheita de fígado de rato e descelularização é facilmente reprodutível, existem certos passos críticos a serem considerados: Durante a preparação para a colheita do fígado, é importante para evitar o sangramento grave, porque ele vai activar a coagulação do sangue e podem conduzir à formação de coágulos sanguíneos dentro do fígado. Em nossa opinião, é vantajoso entalhar a aorta abdominal directamente antes da canulação da veia porta, para evitar fluxo de ...

Descelularização e recelularização pode permitir a geração de órgãos funcionais, transplantáveis ​​in vitro 1. Ao remover as células e material antigénico (por exemplo., ADN, epítopos alfa-Gal) de um órgão, a matriz extracelular ou menos não-imunogénico (ECM) pode ser obtido. Esta matriz conserva a microanatomy tridimensional de um órgão e podem servir como a biomatriz ideal para o repovoamento com células de uma origem diferente, possivelmente xenogénico 2. Assim, uma matriz de fígado de rato descelularizado poderia ser repovoada com células de fígado humano. Este micro-fígado humanizado poderia servir como um modelo ex vivo para a pesquisa sobre doenças (por exemplo., Doenças metabólicas, doenças virais inatos ou neoplasias) ou para testes pré-clínicos farmacêutica 3. Vários protocolos diferentes para perfusão de fígado de rato decellularization já foram publicados 4-13. Em todos os protocolos, decellularção foi conseguida por perfusão de detergentes iónicos ou não-iónicos alcalinas através da veia portal canulada. Para o melhor de nosso conhecimento, fomos o primeiro grupo a relatar rato decellularization fígado por perfusão seletiva através da veia portal e / ou o rato artéria hepática 14. Activar a perfusão selectiva dos diferentes sistemas vasculares no fígado pode permitir melhores resultados decelularização e, além disso, podem desempenhar um papel importante no repovoamento celular. No estudo detalhado aqui, fígados foram perfundidos em um dispositivo de perfusão proprietária feitos sob medida, permitindo a perfusão sob condições de pressão oscilantes. Estas condições de pressão imitar a perfusão fisiológica respiratória dependente do fígado: in situ, o fígado paira sob a cópula do diafragma, cujo movimento durante a respiração tem um impacto direto sobre a perfusão hepática. Inspiração conduz especificamente a redução do diafragma e apertando do fígado, optimizandosaída hepato-venoso, enquanto que leva a expiração do fígado elevação e abaixamento da pressão intra-abdominal para optimizar o fluxo venoso portal-15. O nosso objectivo foi avaliar se a condições de pressão oscilante tem um impacto sobre a homogeneidade de fígado de rato descelularização perfusão intra-abdominais, imitando as condições ex vivo. A homogeneidade do processo de descelularização pode ser um fator subestimado na perfusão descelularização. Todos os agentes conhecidos utilizado para a descelularização fígado provocam alterações nas ECM. Células em áreas mal perfundidos permanecer dentro da ECM, ao passo que outras áreas já estão completamente descelularizados. Para se dissolver as células restantes, a duração ou a pressão de perfusão deve ser elevada, fazendo com que mais alterações às áreas bem perfundidos. Assim, detergentes para a descelularização deve ser distribuído de forma homogénea dentro do órgão.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cânula arterial autoconstruída</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubulação de Polietileno Não Estéril Portex</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD&</td></tr><tr><td>nbsp; Tubo de polietileno não estéril Portex</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0,58 mm ID 0,96 mm</td></tr><tr><td>OD Venodrop Cateter borboleta seguro</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">cânula de veia portal</td></tr><tr><td>Cateter Venoso Periférico</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>Torneira de três vias</td><td>smiths medical</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">palitos de algodão para cirurgia</td></tr><tr><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td><td>Almofadas</td> de</tr><tr><td>algodão&nbsp;</td><td>Curativo cirúrgico Shaoxing Zhengde</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>Atadura de gaze</td><td>Hubei Haige&nbsp; Instrumentos Médicos</td><td>14388</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Solução de campainha</td><td>Fresenius Kabi</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 ml Seringa</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td>10 ml / Luer Solo</td></tr><tr><td>5 ml Seringa</td><td>Braun</td><td>4606061V</td><td>5 ml / Luer Solo</td></tr><tr><td>Sutura (Seda 6/0)</td> <td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>campo médico</td><td>Shaoxing Zhengde Curativo cirúrgico</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">surgical porta-agulha para instrumentos</td></tr><tr><td></td><td>Geuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>microfórceps</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>micro-tesoura</td><td>Martin</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>micro-pinça</td><td>S& T&nbsp;</td><td></td><td></td>112314</tr><tr><td>Clamp</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>tesoura</td><td>F S T&nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>pinça cirúrgica</td><td>Aesculap</td><td>BD 557</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Respirador de Descelularização</td></tr><tr><td></td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>Dispositivo de Perfusão</td><td>Charite, laboratório de engenharia médica</td><td>dispositivo personalizado dispositivo de</td><td>descelularização</td></tr><tr><td>bomba peristáltica ismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp;</td><td>de 4 canais</td></tr><tr><td>Extensão Heidelberger 75 cm&nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA segmento de bomba</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&nbsp;</td><td>MS/CA/click'n'go/POM-C</td></tr><tr><td>Tubo de 2 paradas CA</td><td>Armadilha</td> de bolhas <td>BPT NSF-51</td><td></td>Pharmed</tr><tr><td></td><td></td><td>item</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Conector de mangueira Luer Lock</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detergentes</td></tr><tr><td>Pellets SDS</td><td>Carl Roth&nbsp;</td><td>CN30.4&nbsp;</td><td>2,5 kg</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.1&nbsp;</td><td>10 L</td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">coloração</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxilina</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>coloração gomori</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS coloração Morphisto</td><td></td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

procedimento para decelularização de fígados de rato em uma perfusão dispositivo oscilante pressão

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

A descelularização e recelularização de órgãos parenquimatosos podem permitir a geração de órgãos funcionais in vitro, e vários protocolos para descelularização hepática de roedores já foram publicados. Nosso objetivo foi melhorar o processo de descelularização por meio da construção de um dispositivo de perfusão proprietário que permitisse a perfusão seletiva através da veia porta e/ou da artéria hepática. Além disso, procuramos realizar a perfusão sob condições de pressão oscilante circundante para melhorar a homogeneidade da descelularização. A homogeneidade da descelularização da perfusão tem sido um fator subestimado até o momento. Durante a descelularização, as áreas dentro do órgão que são mal perfundidas ainda podem conter células, enquanto a matriz extracelular (MEC) em áreas bem perfundidas já pode ser afetada por detergentes alcalinos. As mudanças de pressão oscilante podem imitar as mudanças de pressão intra-abdominal que ocorrem durante a respiração para otimizar a microperfusão dentro do fígado. No estudo aqui apresentado, matrizes hepáticas de ratos descelularizadas foram analisadas por coloração histológica, análise de conteúdo de DNA e fundição por corrosão. A perfusão pela artéria hepática mostrou resultados mais homogêneos do que a perfusão venosa portal. A aplicação de condições de pressão oscilante melhorou a eficácia da descelularização da perfusão. Os fígados perfundidos através da artéria hepática e sob condições de pressão oscilante apresentaram os melhores resultados. As técnicas apresentadas para colheita, canulação e perfusão hepática usando nosso dispositivo proprietário permitem configurações sofisticadas de perfusão para melhorar os experimentos de descelularização e recelularização em fígados de ratos.

A homogeneidade e, assim, a eficácia de diferentes protocolos de decelularização foram avaliadas por observação macroscópica, análise histológica e análise do conteúdo de ADN permanecendo dentro do fígado descelularizados matrizes. Além disso, a carcaça corrosão foi realizada para visualizar a microanatomia intacta de fígados após a descelularização. Macroscopia Durante decellularization, fígados tornar Lucent, indicando a remoção de conteúdo celular. Fígados per...

As técnicas apresentadas para colheita, canulação e perfusão hepática usando nosso dispositivo proprietário permitem configurações sofisticadas de perfusão para melhorar os experimentos de descelularização e recelularização em fígados de ratos.

Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

O objetivo geral do seguinte experimento é avaliar o papel da raiz de perfusão na otimização da homogeneidade da descelularização por perfusão do fígado de rato. Isso é realizado primeiramente canulando as veias porta e as artérias hepáticas de fígados de rato recém-isolados. Como segundo passo, os fígados são conectados a um dispositivo de perfusão para perfusão seletiva das veias porta ou das artérias hepáticas.Em seguida, são aplicadas alterações de pressão oscilatórias à câmara de perfusão para simular as variações de pressão intra-abdominal que ocorrem durante a respiração. Ao otimizar a microperfusão hepática, fígados perfundidos pela artéria hepática sob condições de pressão oscilatória apresentam uma descelularização mais homogênea e rápida, conforme avaliado por observação macroscópica e análises histológicas e bioquímicas. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a descelularização por perfusão venosa portal, é que a perfusão arterial com condições de pressão oscilatória resulta em uma descelularização mais homogênea.Em um tempo mais curto, no entanto, este método pode fornecer informações sobre técnicas de desaceleração. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como experimentos de ressolarização, configurações de perfusão extracorpórea e modelos de órgãos. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque a colheita e a canulação arterial de fígados vermelhos pode ser complicada.Antes de colher o fígado, faça um corte oblíquo na extremidade de um pedaço de 1,5 centímetro de um cateter venoso periférico G 20. Conecte o cateter a uma torneira de três vias e use uma seringa de 10 mililitros preenchida com solução de Ringer para remover o ar do sistema. Em seguida, corte a agulha de uma cânula tipo borboleta em um comprimento de cinco milímetros e use cola sintética para fixar um tubo de cinco centímetros à agulha.Insira um tubo de dois centímetros de comprimento no tubo maior e fixe este tubo com cola super resistente também. Encaixe outro tubo sobre esta montagem e cole-o no lugar para criar um batente. Em seguida, use uma seringa de cinco mililitros cheia com solução de Ringer para desobstruir a cânula arterial recém-construída para reparar o fígado antes da colheita.Com comece usando um curativo úmido para segurar os lobos hepáticos medial e esquerdo de uma rata adulta anestesiada sob a cúpula do diafragma. Exponha o ligamento hepato duodenal e o lobo hepático superior neste momento também. Em seguida, use duas pinças microcirúrgicas e tesouras de mola para dissecar cuidadosamente o ligamento ligado ao lobo omental superior até que o lobo fique móvel.Em seguida, mantenha os lobos médio e esquerdo no lugar. Use cotonetes umedecidos para mover o lobo sob a compressão do GRE e o estômago para o lado esquerdo do animal. Fixe o estômago com uma pinça e dissecar o pequeno momento.Em seguida, dissecar o lobo hepático inferior ou mental até que fique móvel e reposicionar o lobo em sua cavidade usando uma pinça tipo backhouse para reter o duodeno; mover o duodeno para a esquerda a fim de expor o ligamento hepato-duodenal, circundando o ducto biliar comum. Em seguida, dissecar o ducto biliar do tecido adiposo e pancreático, cortando o ducto a 1,5 centímetro da bifurcação do ducto biliar.Disseque a veia sal da tela adiposa circundante, expondo a veia gastroduodenal. Em seguida, ligue a veia gastroduodenal duas vezes com fios 6-0 e seccione a veia entre os dois nós. Disseque o tronco celíaco e a artéria hepática comum do tecido circundante até que todos os ramos arteriais sejam expostos.Após dissecar todas as artérias, circunscreva a veia cava inferior entre o rim direito e o lobo hepático lateral direito e dissecar a veia do espaço retroperitoneal. Siga o tronco celíaco para expor a aorta. Em seguida, dissecar o tecido adiposo retroperitoneal e circunscreva a aorta acima do tronco celíaco.Agora injete 1000 unidades de heparina em um mililitro de solução salina na veia cava inferior. Cubra a incisão com uma gaze e aguarde um a dois minutos para que a heparina faça efeito. Em seguida, circunscreva a aorta com uma pinça e dissecção a aorta e a veia cava inferior distalmente em relação ao rim.Para posicionar o cateter venoso portal, faça uma incisão em forma de boca de peixe na veia porta distal e abra a incisão com pinça. Em seguida, canule a veia porta e lave o fígado com 20 mililitros de solução de Ringer até que o fígado se descore. Utilize ligaduras de seda seis zero para fixar o cateter no lugar. Para posicionar o cateter arterial, dissecção da aorta acima do tronco celíaco até que o segmento da aorta possa ser liberado do espaço retroperitoneal.Corte o segmento da aorta longitudinalmente para gerar um retalho aórtico e insira a cânula autoconstruída em um suporte estático. Em seguida, use duas pinças para deslizar o retalho aórtico sobre a cânula e ligue a artéria hepática com um fio de seda seis zero sobre a cânula. Fixe o retalho no encaixe para realizar a descelularização. Conecte a torneira de três vias da cânula da veia porta à entrada correspondente do reator e conecte a cânula arterial à entrada arterial, tomando cuidado para que nenhum ar entre no sistema.Em seguida, conecte o respirador à câmara de distribuição de pressão e conecte a câmara ao reator. Inicie a aplicação de pressão. Depois, inicie a descelularização.Fusione o fígado com 1% Triton X-100 a uma taxa de cinco mililitros por minuto. Permita a saída do efluente residual através do fluxo de saída do dispositivo de perfusão para manter o nível de fluido dentro da câmara de perfusão constante e acima do fígado perfundido. Após 90 minutos, mude o detergente para 1% SDS. Fígados perfundidos via veia porta apresentam elucidação heterogênea, indicando descelularização com células remanescentes visíveis macroscopicamente durante e após o processo, enquanto fígados perfundidos via artéria hepática demonstram um curso de descelularização mais homogêneo, com menos células remanescentes visíveis.Se os fígados foram perfundidos com a aplicação de condições de pressão oscilante, nenhuma célula remanescente era visível. Independentemente da perfusão. A avaliação histológica das matrizes de fígado descelularizadas confirma, de fato, os achados macroscópicos nos fígados perfundidos pela artéria hepática.Nenhum restante de células, independentemente de terem sido perfundidos sob condições de pressão oscilante ou não, é observado em fígados perfundidos pela veia porta; no entanto, exibem zonas com restante de células, mesmo quando perfundidos sob condições de pressão oscilante, embora essas condições reduzam a massa celular remanescente nesses fígados. Observe a preservação das matrizes extracelulares dos fígados, independentemente das condições de descelularização. O teor de DNA por peso seco da matriz hepática também diminuiu em todos os grupos experimentais em comparação com fígados nativos. Embora as diferenças tenham sido estatisticamente significativas apenas nos grupos perfundidos sob condições de pressão oscilante.Além disso, a moldagem por corrosão das matrizes hepáticas descelularizadas confirmou a preservação da microanatomia do fígado durante o processo de perfusão. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como colher, canular e perfundir fígados vermelhos para uma descelularização homogênea e reprodutível. Não se esqueça de que o trabalho com Triton X-100 e SDS pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, também devem ser tomadas ao realizar este procedimento.

procedure-for-decellularization-rat-livers-an-oscillating-pressure

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Decelularização perfusão é uma nova técnica para produzir scaffolds fígado inteiro que mantém a composição do órgão matriz extracelular e microarquitetura. Aqui, o método de preparação de andaimes órgão inteiro usando decelularização perfusão e repovoamento posterior com hepatócitos é descrito. Enxertos de fígado para transplante funcional e pode ser gerado usando esta técnica.

Decelularização e Recellularization de Fígados inteiros

Uma técnica para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato é descrito. Os fígados são perfundidos e...

Isolamento de fibroblastos de rato por Portal<em&gt; In situ</em&gt; Perfusão de fígado

Hepatócitos primários proporcionar uma ferramenta valiosa para avaliar as funções bioquímicas, moleculares, e metabólicas em um sistema fisiologicamente relevante experimental. Nós descrevemos um protocolo confiável para rato em perfusão de fígado in situ, que sempre gera hepatócitos viáveis ​​até to1.0 ×...

Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

Enxertos marginais, tais como fígado gorduroso, enxertos de doadores mais velhos, ou fígados recuperados após a morte cardíaca (DCD) tolerar estática de armazenagem convencional, o frio só mal. Foi desenvolvido um novo modelo de subnormothermic ex vivo de perfusão hepática para a preservação, avaliação e reparo de enxertos de fígado marginais antes do transplante.

Técnica de Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fígado de Perfusão para o armazenamento, Avaliação e Reparação de enxertos de fígado Marginal

Há uma escassez de doadores de fígado significativo, e expandiram-se critérios para doadores de fígado. Normotérmica ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi desenvolvido para avaliar e modificar a função do órgão. Este estudo demonstra um modelo do rato de NEVLP e testa a capacidade do peguilado-catalase, para atenuar a lesão hepática de preservação.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

Estabelecemos uma nova técnica cirúrgica para um modelo de perfusão na vivo único lóbulo hepático em ratos como um pré-requisito para estudar mais na vivo parcial fígado engenharia no futuro.

Uma nova técnica cirúrgica como fundamento na Vivo parcial engenharia fígado de rato

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

O protocolo descreve a captação cirúrgica e subsequente descelularização de retalhos suínos vascularizados pela perfusão de detergente dodecil sulfato de sódio através da vasculatura do retalho em um biorreator de perfusão personalizado.

Aquisição e Perfusão-Descelularização de Flaps Vascularizados Suínos em Biorreator de Perfusão Customizado

Descrevemos a técnica cirúrgica e o processo de descelularização de membros posteriores compostos de ratos. A descelularização é realizada usando dodecil sulfato de sódio de baixa concentração através de um sistema de perfusão de máquina ex vivo.

Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado

Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.

Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Aprenda a decelularização de fígados de rato usando um dispositivo de perfusão com pressão oscilante. Este método otimiza a homogeneidade da decelularização arterial para engenharia de tecidos.

Procedimento para Decelularização de fígados de rato em uma Perfusão dispositivo oscilante pressão

Explorar mais vídeos