Name: Terapia Fotodinâmica com Blended polímero condutor / Fullerene Nanoparticle Fotossensibilizadores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a fabricar nanopartículas de polímero condutor misturadas com fullereno para terapia fotodinâmica em câncer. Este método avalia a eficácia in vitro em células de câncer de ovário agressivo.

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Os autores agradecem à National Science Foundation (NSF) pelo apoio financeiro a este trabalho por meio de um prêmio CAREER (CBET-0746210) e por meio do prêmio CBET-1159500. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Turkson (Univ. do Hawaii Cancer Center) e ao Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) pela assistência com a cultura de células.

1. Cultivar Linhas Celulares <ol><li> Thaw TE 71 (células epiteliais do timo mouse), MDA-MB-231 (células de câncer de mama humano), A549 (células de câncer de pulmão humano) e OVCAR3 (células de tumor do ovário humano) segurando os frascos criogênica em água morna por menos de 2 min . Adicionar 10 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para cada linha celular e centrifuga-se durante 6 min a 106 x g. </li><li> Aspirar a suspensão de 3 ml e adicionar meios para o sedimento. Misturar as células por pipetagem adequadamente várias vezes. Adicionar esta solução de células de pré-aquecida até 7 ml de meio DMEM suplementado com 10% de FBS em frascos T75 e manter os frascos em atmosfera humidificada de 95% ar / 5% de CO2 a 37 ° C. Marque esse balão como Passage 0. </li><li> Quando a confluência das células atinge 80%, a colheita das células, incubando-as com tripsina a 0,05% durante 10 min. Neutralizar a tripsina por adição de igual quantidade de mídia. Centrifugar esta solução durante 6 min a 106 x g. Retirar a suspensão e adicionar 3 ml de meio fresco a ele. Misture bem assimL e transferir pequena quantidade (100 ul) para um frasco de cultura contendo 7 ml de meio. Incubar o balão de cultura na incubadora. Rotular o frasco como uma passagem. </li><li> Cultura das linhas celulares até passagem 11 ou 12. </li></ol> 2. Fabrico de nanopartículas <ol><li> Preparação de ~ não diluído solução estoque 10 -6 M (ajustada) MEH-PPV <ol><li> Num frasco de 1 mg adicionar poli [2-metoxi-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenilenovinileno] (MEH-PPV) com um peso molecular (médio Mn) 150,000-250,000 g / mol e 3 ml de tetra-hidrofurano (THF) . Agita-se a mistura durante 2 h enquanto se aquecia a 80 ° C sobre uma placa quente. </li><li> Filtra-se a solução acima em um novo frasco utilizando um filtro de seringa de 0,2 um. Rotular esta solução como &quot;solução não diluída estoque MEH-PPV &#39;. Esta solução estará envolvido na preparação de nanopartículas depois de sintonia fina da concentração, tal como descrito nos passos 2.1.3 e 2.1.4. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de reserva não diluída do MEH-PPV em 3 ml de THF. Rotular esta solução como &quot;solução diluída estoque MEH-PPV &#39;. Transferir para uma cuvete de quartzo de 1 cm e medir a absorvância a 495 nm por espectroscopia de UV-vis. </li><li> Se a absorvância da solução diluída MEH-PPV é maior do que 0,17, diluir a solução de reserva não diluída MEH-PPV pela adição de mais 1 ml de THF de cada vez, e repetir a etapa 2.1.3, até a absorvância medida a 495 nm ser no variam 0,13-0,17. </li><li> Calcula-se a molaridade da solução de estoque diluída MEH-PPV usando a Lei de Lambert-Beer, como mostrado abaixo. Aqui 0,15 absorvância é utilizado como um exemplo para o resto do protocolo (isto é., Ajustar todos os seguintes cálculos com base na absorvância observada), o coeficiente de extinção MEH-PPV utilizada é de 10 7 M -1 cm -1 e o comprimento do percurso é utilizada 1 cm. A = ε xbxc (Eq 1) (ε - o coeficiente de extinção molar, A - absorvância, b - comprimento do percurso, C - concentração da solução) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm XC (Eq 2) C = 1,5 x 10 @ 8 M (Eq 3) Utilizar esta concentração para encontrar a concentração da solução de reserva não diluída MEH-PPV como se segue: H 1 V 1 2 V = H 2 (Eq 4) 0,15 x 10 -7 M x 3050 ul = H 2 x 50 uL (Eq 5) 2 H = 9,15 x 10 -7 M (Eq 6) Esta é a concentração da &quot;solução de reserva não diluída, ajustada MEH-PPV &#39;. </li></ol></li><li> Cálculo de massa de MEH-PPV na solução não diluída ajustada estoque MEH-PPV <ol><li> Calcula-se a massa de MEH-PPV em 1 ml da solução não diluída estoque adaptados tal como indicado abaixo utilizando a molaridade obtido na secção 2.1.4 e o peso molecular (M w) de MEH-PPV, que é de 10 6 g / mol. M = n / V (n -. Não de moles, V - volume, em L) (Eqn 7) Assim, a massa de MEH-PPV em 1 ml de ajustado undsolução estoque iluted é 9,15 x 10 -4 g. </li></ol></li><li> Misturando PCBM em MEH-PPV <ol><li> Calcula-se a massa de C-Fenil 61 -butírico éster metílico do ácido (PCBM) para ser adicionado à solução de estoque MEH-PPV para fazer dopado solução MEH-PPV 50% em peso PCBM, em que 50% em peso PCBM é definido com respeito à massa de MEH-PPV (ou seja, metade da massa de MEH-PPV). Ao usar o peso de MEH-PPV obtidos na seção 2.2. Massa de PCBM / 9,15 x 10 -4 g de MEH-PPV x 100% = 50% em peso PCBM (Eq 8) Massa de PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) </li><li> Pesar 1 mg PCBM num frasco e adicionar 500 mL de THF. Calcular a concentração de PCBM nesta solução com o peso molecular de 910,88 PCBM como g / mol A molaridade da solução PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 ul) (Equação 10) A molaridade da solução PCBM = 2,19 x 10 -9 mol / l (11 Eq) </li><li> Calcular o volume de solução necessário para PCBM adicionar ao não-diluido ajustado MESolução da H-PPV obter o PCBM dopado solução MEH-PPV 50% em peso em THF, utilizando a molaridade calculado no passo 2.3.2 4,57 x 10 -4 g de PCBM x 1 mol / 910,88 GX 1 ul / 2,19 x 10 -9 mol = 229 ul (Equação 12) Adicionar 229 ul da solução PCBM em 1 ml de solução de estoque MEH-PPV não diluído ajustado e misturar bem. </li></ol></li><li> Preparação de nanopartículas pelo método reprecipitação <ol><li> Transferir 1 ml da solução de MEH-PPV / PCBM misturados na seringa de 1 ml com a agulha ligada a ela. </li><li> Rapidamente injectar 1 ml da solução de MEH-PPV / PCBM misturado em 4 ml de água Dl agitação a 1200 rpm. Pare agitação imediatamente após a injecção. Use essas nanopartículas sem transformação. </li></ol></li></ol> 3. Incubação de linhas celulares com nanopartículas for Imaging Nota: Todos os experimentos com imagens foram concluídas em placas de Petri de 35 mm <ol><li> A absorção de nanopartiCiclos em linhas celulares <ol><li> Linhas celulares de cultura até a 12ª passagem. Nos 12 células de cultura de passagem th em 35 mm placas de Petri. Ajustar a concentração de células adicionadas às placas de Petri de 35 mm de tal forma que após 24 horas as células estão 40% confluentes. </li><li> Nesta fase, os meios de comunicação remover DMEM suplementado com FBS a 10% a partir das placas de Petri, lavar as células duas vezes com 1x de DPBS, e adicionar 100 uL da suspensão de nanopartículas em 2 ml de DMEM para as placas de Petri. </li><li> Após 24 horas remover o DMEM / suspensão de nanopartículas as placas de Petri e lavar as células com DPBS 1x 3 vezes. Em seguida, fixar as células por incubação com 4% de paraformaldeído durante 10 min. Lavar duas vezes com DPBS. Corar as células com 300 nM de DAPI por incubação com o corante durante 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente. </li></ol></li><li> Detecção de ROS <ol><li> A549 Cultura e linhas celulares OVCAR3 em placas de Petri, 6 por linha de células, como explicado no ponto 3.1.1. Rotular oAs placas de Petri, como mostrado na Tabela 1. </li><li> Adicionar 100 ul da suspensão de nanopartículas em 2 ml de DMEM para três das placas de Petri, como mostrado na Tabela 1 e incuba-se durante 24 h. Para as placas de Petri que receberão doses de luz, lavar as células após 24 h e suspender as células em HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hank) Dye meios livres. </li><li> Aqueça-se a lâmpada do simulador solar para 15 min. Coloque filtro UV em frente da lâmpada para filtrar a luz ultravioleta. Calibrar a lâmpada com uma célula solar de referência através do ajuste da potência da lâmpada para se obter 0,5 sol (50 mW / cm 2) intensidade na superfície da placa de Petri. Nesta configuração particular que a condição foi alcançada com 218 W de potência fornecida à lâmpada. </li><li> Colocar as placas de petri sob a lâmpada (tampa aberta) durante 60 min, o que resulta em uma dose de luz de 180 J / cm 2, tal como mostrado nos cálculos abaixo: 50 mW / cm 2 seg x 3.600 / 1.000 = 180 J / cm 2 </li><li> Remover HBSS sem lavagem e adicionar mais 2 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para as placas de Petri. Incubam-se as células durante mais 2 h. </li><li> Para o controlo positivo incubar as células com 100 | iM de peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) durante 30 min. </li><li> Corar as células em todas as placas de petri com uma concentração final de 5 uM de o reagente de detecção de ROS por incubação das células com o corante durante 30 min a 37 ° C. </li><li> Fixar as células por incubação com 4% de paraformaldeído durante 10 min. Lavar duas vezes com DPBS. Corar as células com 300 nM de DAPI por incubação com o corante durante 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente. </li></ol></li><li> Apoptose e necrose por PI e anexina V FITC <ol><li> Cultura em cada linha de células 5 placas de Petri. Três destes pratos de Petri será para a experiência, enquanto os restantes 2 placas de petri será amostras de controlo. Incubar as 3 placas de Petri para experimento com nanopartículas como explained no ponto 3.1.2. As amostras de controlo não são incubadas com nanopartículas. </li><li> Após 24 horas de incubação seguir o passo 3.2.3. </li><li> Colocar as placas de petri de 3 experimentais sob a lâmpada (tampa aberta) e remover um em 20 minutos, uma de 40 min e um aos 60 min. Obteve-se três amostras que foram expostas a doses de luz de 60, 120 e 180 J / cm2, respectivamente (de cálculo na secção 3.2.4). Em seguida, administrar uma de 180 J / cm 2 de dosagem de luz a um dos pratos de Petri de controlo. Este é o controlo com dose de luz aplicada na ausência de nanopartículas. Não aplicar dose de luz para a amostra de controlo restantes (sem nanopartículas e nenhuma dose de luz aplicada). </li><li> Substituir o HBSS com meio DMEM suplementado com 10% de FBS e manter as placas de Petri em incubação durante 4 horas. </li><li> Corar as células do experimental e as placas de Petri de controlo com 20 uL de FITC anexina V por incubação das células com o corante durante 15 min. Lavar duas vezes com DPBS. Manchar o cells com 300 nM de DAPI, bem como 300 nM de PI (iodeto de propidio), por incubação com os corantes por 2 min. Lavar duas vezes com DPBS. Em seguida, manter as células em DPBS para a imagem latente. </li></ol></li></ol> 4. Nanopartículas de citotoxicidade intrínseca <ol><li> Contar as células e cultura em placas de 96 poços <ol><li> Colheita das células a partir de balões de cultura, removendo meios e lavagem das células duas vezes com DPBS, seguido de incubação das células com tripsina a 0,05% durante 10 min. Adicionar 2 ml de meio DMEM suplementado com FBS a 10% para a solução de células resultante. Misture a solução correctamente para separar agregados de células em singuletos. </li><li> Tome 100 ul da suspensão de células e 900 ul adicionar ao meio DMEM suplementado com FBS a 10%. Misture bem. Colocam-se 10 uL desta suspensão para um hemocitómetro. Contar as células utilizando um hemocitómetro e a ajustar a concentração da suspensão de células em 4.1.1 a 5 x 10 4 células / ml. </li><li> Take 5 placas de 96 poços rotulado como 0 h, 24 hr, 48 h, 72 he 96 h. Adicionar 50 ul de 5 x 10 4 culas / ml (soluções de células TE 71 e A549) nas cavidades, como se mostra na Tabela 2, a sementeira, assim, 2.500 células / poço. Fazer o mesmo procedimento para OVCAR3 e MDA-MB-231 linhas celulares. </li><li> Após 24 horas lavar os poços com 1 x DPBS e adicionar 50 ul de concentrações crescentes de nanopartículas nas cavidades como se mostra na Tabela 2. Prepare-se diferentes concentrações de nanopartículas pela adição de 20, 100, e 180 ul de suspensão de nanopartículas de 2.4.2 para a DMEM obter um volume final de 2 ml, que origina concentrações de nanopartículas de 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / mL, e 3,6 x 10 -4 mg / ml, respectivamente. Cada linha celular tem triplicado para cada concentração de nanopartículas. </li></ol></li><li> Medir a viabilidade celular no escuro <ol><li> Adicionar 10 ul de MTT a 0 hr a placa imediatamente após a adição de nanopartículas. Incubar a placa durante 4 horas para cryst formazanpara formar als. Adicionar solução de solubilização 50 ul nos poços. Incubar a placa durante 6 horas para dissolver os cristais de formazano. </li><li> Medir a viabilidade das células da placa de 0 h, gravando a absorvância a 570 nm com um leitor de microplacas. </li><li> Por placa de 24 h, lavar as células com DPBS e 1x adicionar 50 ul meios em cada poço de incubação depois de 24 horas com nanopartículas. Adicionar MTT e ler a placa conforme explicado em 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Por 48 horas, 72 horas, e 96 placas de RH, lavar as células com 1x DPBS e adicionar 50 ul mídia nas cavidades após 24 hr de incubação com nanopartículas. Incubar as células para os períodos restantes. </li><li> 4.2.5) medir a viabilidade celular nos pontos de tempo particulares, tal como explicado nos pontos 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Repita a experiência completa para 3 vezes (n = 3) </li></ol></li></ol> 5. medir a viabilidade celular após a TFD <ol><li> Contar as células e cultura em placas de 96 poços. <ol><li> Rotular um conjunto de 9Placas de 6 poços, como mostrado na Tabela 3, tanto para as placas 71 de TE e A549 + + OVCAR3 MDA-MB-231 placas. A disposição das placas vai ser o mesmo que o indicado em 4.1.3. </li><li> Semear as placas de 96 poços como explicado no ponto 4.1 com o mesmo layout como mostra a Tabela 2 na seção 4.1.2. </li><li> Após 24 horas, adicionar nanopartículas para as placas como explicado no ponto 4.1.4. </li><li> 24 h após a adição de nanopartículas de lavar as células com DPBS e 1x adicionar 50 ul de HBSS a cada poço. </li><li> Irradiam-se as placas com as respectivas doses de luz, como explicado em 3.2.3. </li><li> Substituir o HBSS com 50 ul de meio DMEM suplementado com FBS a 10% e incuba-se as placas para os respectivos períodos de tempo após a TFD. </li><li> Após cada período de tempo medir a viabilidade celular, como explicado em 4.2.1 e 4.2.2. </li></ol></li></ol> 6. Microscopia de Fluorescência <ol><li> A absorção de nanopartículas <ol><li> Acender as lâmpadas do microscópio umaND o laser 30 min antes de imagem. Colocar a placa de petri contendo as células fixadas (como explicado na secção 3.1) na fase do microscópio. </li><li> Recolha a fluorescência a partir de nanopartículas de DAPI e por utilização de filtros, como mostrado na Tabela 4. Sobrepor a fase contraste, nanopartículas e DAPI imagens no software ImageJ. </li></ol></li><li> Detecção de ROS <ol><li> Acender as lâmpadas do microscópio 30 min antes de imagem. Colocar a placa de petri contendo as células (tal como explicado na secção 3.2) na fase do microscópio. </li><li> Recolhe-se o de fluorescência a partir das nanopartículas, DAPI, e o reagente de detecção ROS usando filtros, como mostrado na Tabela 4. Overlay o contraste de fase, de nanopartículas, de DAPI e ROS detectar imagens de reagentes em software ImageJ. </li></ol></li><li> Apoptose e necrose por PI e anexina V FITC <ol><li> Acender as lâmpadas do microscópio 30 min antes de imagem. Colocar a placa de Petri contendo as células (tal como explicado nosecção 3.3) na fase do microscópio. </li><li> Recolhe-se o de fluorescência a partir das nanopartículas, DAPI, PI e Anexina V FITC usando filtros, como mostrado na Tabela 4. Overlay o contraste de fase, de nanopartículas, DAPI, PI e Anexina V-FITC imagens no software ImageJ. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para conseguir a absorção de nanopartículas, foi necessário manter algumas medidas críticas enquanto a fabricação das nanopartículas. Uma solução de M MEH-PPV 10 -6 (misturado com 50% em peso PCBM) em THF foi preparada para injectar água Dl, uma vez que foi observado que a concentração desta solução desempenha um papel importante na determinação do tamanho das nanopartículas sendo formada. A concentração foi verificada por espectroscopia de Uv-vis. Note-se que no passo 2.1.3 protocolo foi necessário diluir a ...

Em Terapia Fotodinâmica (PDT) fotossensibilizantes são administrados para atingir o tecido, e após a exposição à luz do fotossensibilizador gera espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS espécies, tais como oxigénio atómico e superóxido pode induzir estresse oxidativo e danos estruturais após a células e tecidos 1-4. Devido à sua facilidade de aplicação desse método tem sido activamente investigados e ensaios clínicos foram realizados 5,6. No entanto, os problemas significativos tais como toxicidade no escuro dos sensibilizadores, a sensibilidade do doente a luz (devido a uma distribuição não selectiva do sensibilizador), e hidrofobicidade dos sensibilizadores (o que leva à redução da biodisponibilidade e potencial toxicidade aguda) permanecem. Relatamos aqui um método para a fabricação e in vitro de avaliação da realização de nanopartículas de polímero misturado com fulereno como os fotossensibilizadores próxima geração para PDT. As nanopartículas são formadas por auto-agregação deo polímero semicondutor MEH-PPV (poli [2-metoxi-5- (2-ethylhexyloxy) -1,4-fenilenovinileno]) com o PCBM fulereno (fenil-C 61 éster metílico do ácido butírico), quando estes materiais dissolvidos numa compatível solvente são rapidamente injectadas num solvente não-compatível (Figura 1A). A escolha de MEH-PPV como o polímero hospedeiro é motivada pelo seu elevado coeficiente de extinção que leva a altas taxas de formação de tripleto, e ao mesmo tempo eficiente e ultra-rápida de carga e energia transferência para o PCBM fulereno 7. Estas propriedades são ideais para a sensibilização de oxigénio atómico e formação de superóxido no PDT. Fulereno tem de facto sido aplicado no PDT, tanto na forma molecular e nanopartículas de 8-13. No entanto, a citotoxicidade grave tem dificultado o desenvolvimento adicional 12. Aqui nós mostramos que encapsular o fulereno em uma matriz hospedeira de MEH-PPV para produzir nanopartículas compostas MEH-PPV / PCBM resultados em um material de sensibilização PDT que inão é citotóxico intrinsecamente, mostra especificidade para células cancerosas devido ao tamanho das nanopartículas e carga superficial, e os rendimentos de tratamento altamente eficaz na TFD doses baixas de luz devido às propriedades fotofísicas acima mencionados.

<table><tbody><tr><td>Poli[2-metoxi-5-(2-etilhexiloxi)-1,4-fenilenovinileno] (MEH-PPV)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>536512-1G</td><td>média Mn&nbsp; 150.000-250.000</td></tr> <tr><td>[6,6]-fenil C61 éster metílico de ácido butírico (PCBM)</td><td>Sigma Aidrich</td><td>684449-500MG</td>><td>99,5%</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td>Seringa Drisolv</td></tr><tr><td>de 1 ml</td> Empresa <td>Científica Nacional</td><td>37510-1</td><td>Para filtração de solução MEH-PPV</td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>VWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm, 0,2 &micro; m,</td></tr><tr><td>seringa de PTFE 1 ml</td><td>Hamilton Company</td><td>81320</td><td>Para injeção de solução MEH-PPV em água para fazer nanopartículas</td></tr><tr><td>Modificação de Dulbecco do Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix (DMEM)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank sem vermelho de fenol (HBSS)</td><td>Quality Biological (VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco, 1x sem cálcio e magnésio (DPBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino, regular (inativado pelo calor) (FBS)</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1x 0,25%</td><td>Corning (VWR)</td><td>45000-664</td><td>Tripsina/2,21 mM EDTA em HBSS sem bicarbonato de sódio, cálcio e magnésio Parvovírus suíno testado</td></tr><tr><td>16% Paraformaldeído</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica&nbsp;</td><td>15710</td><td>O paraformaldeído a 16% é diluído a 4% pela adição de PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td> Biotium VWR</td><td>89139-054</td><td>Coloração nuclear</td></tr><tr><td>Pipetas de 5 ml</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de 75 cm2</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>para cultura</td></tr><tr><td>de células Placas de 96 poços</td><td>VWR</td><td>82050-771</td><td>para ensaios MTT</td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecidos com aberturas</td><td>Greiner Bio-One (VWR)</td><td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sondas moleculares</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Anexina V FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td><td>corante para apoptose</td></tr><tr><td>Celltiter 96 ensaios não-R 1000</td><td>Promega (VWR)</td><td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX Green Reagent, para detecção de estresse oxidativo</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td>para ROS </td></tr><tr><td>espectrômetro UV-vis</td> de detecção <td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de fluorescência</td><td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PD2000DLS de espalhamento de luz dinâmico</td><td>, detector</td><td></td><td></td>de precisão</tr><tr><td>Incubadora</td><td>NuAir DH Autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss Axioskop2</td><td></td><td>63X lente objetiva de imersão em óleo</td></tr><tr><td>Microscópio de epiluminescência</td><td>Olympus IX71</td><td></td><td>60X lente objetiva de imersão em água, câmera Andor Zyla sCMOS</td></tr><tr><td>Simulador Solar</td><td>Newport 67005 Oriel Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Referência célula solar</td><td>Oriel&nbsp;</td><td></td><td>Os padrões de VLSI incorporaram</td></tr> o <tr><td>hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td> de BioTek Ex808 do leitor BioTek Ex808 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>Microplate</td></tr> para contar pilhas</tbody></table>

terapia fotodinâmica com blended polímero condutor / fullerene nanoparticle fotossensibilizadores

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

Neste artigo, é relatado um método para a fabricação e avaliação in vitro reprodutível de nanopartículas poliméricas condutoras misturadas com fulereno como os fotossensibilizadores de próxima geração para Terapia Fotodinâmica (PDT). As nanopartículas são formadas pela interação hidrofóbica do polímero semicondutor MEH-PPV (poli[2-metoxi-5-(2-etilhexiloxi)-1,4-fenilenovinileno]) com o fulereno PCBM (éster metílico do ácido fenil-C 61-butírico) na presença de um solvente não compatível. O MEH-PPV tem um alto coeficiente de extinção que leva a altas taxas de formação de tripletos e carga eficiente e transferência de energia para o PCBM de fulereno. Os últimos processos aumentam a eficiência do sistema PDT por meio da formação de tripletos e radicais assistidos por fulereno e desativação ultrarrápida de MEH-PPV excitado. Os resultados aqui relatados mostram que este sistema de sensibilização de nanopartículas PDT é altamente eficaz e mostra especificidade inesperada para linhagens de células cancerígenas.

Absorção e citotoxicidade intrínseca de nanopartículas Os 50% em peso de nanopartículas misturados MEH-PPV / PCBM foram incubadas com TE 71, MDA-MB-231, A549 e linhas de células OVCAR3. O nível PCBM mistura foi escolhido como 50% em peso PCBM, o que foi mostrado para fornecer propriedades de carga e de transferência de energia ideal entre polímeros e conjugados fulerenos 14. As imagens de fluorescência de absorção de nanopartículas estão apresentados na Figura <st...

Este protocolo descreve um método para a fabricação de nanopartículas poliméricas condutoras misturadas com fulereno. Essas nanopartículas foram investigadas quanto ao seu potencial uso como fotossensibilizadores de próxima geração para Terapia Fotodinâmica (PDT).

Terapia Fotodinâmica com Blended polímero condutor / Fullerene Nanoparticle Fotossensibilizadores

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

O objetivo geral do seguinte experimento é desenvolver um fotossensibilizador de próxima geração para aplicação em terapia fotodinâmica ou PDT no tratamento do câncer. Isso é alcançado adaptando-se um método de precipitação de fabricação para produzir nanopartículas poliméricas condutoras dispersáveis em água. Como segunda etapa, as nanopartículas são incubadas com células cancerígenas in vitro, seguidas pelo tratamento com luz para gerar espécies reativas de oxigênio ou ROS, que são os radicais ativos que participam da PDT.A seguir, a eficácia do tratamento é avaliada por ensaios quantitativos e imagens qualitativas para determinar as frações vivas versus TED da população celular. Os resultados mostram que cânceres agressivos, como o câncer de ovário, modelados aqui pelo OAR três abundantes, incorporam amplamente o fotossensibilizador nanoparticulado relatado neste trabalho e que o tratamento com PDT é altamente eficaz in vitro. Nesse caso, a eficácia da PDT correlaciona-se diretamente com a quantidade de nanopartículas incorporadas pelas diferentes linhagens celulares.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como quimioterapia, radioterapia e cirurgia, é que o tratamento pode ser direcionado especificamente ao local da doença, reduzindo os efeitos colaterais. O material ativo utilizado não apresenta citotoxicidade in vitro, e o desenvolvimento adicional tornará o sistema de nanomateriais mais específico em relação ao local de estimulação transcraniana por corrente contínua (tDCS). Inicie este procedimento com o cultivo de linhagens celulares e a preparação da solução estoque de M-E-H-P-P-V conforme descrito no protocolo textual. Adicione 50 microlitros da solução estoque de M-E-H-P-P-V não diluída em três mililitros de TETRAHEDRAN ou THF.Rotule esta solução como solução estoque diluída de M-E-H-P-P-V, transfira para uma cubeta de quartzo de um centímetro e meça a absorbância em 495 nanômetros por espectroscopia ultravioleta-visível. Se a absorbância da solução estoque diluída de M-E-H-P-P-V for superior a 0,17, dilua a solução estoque não diluída de M-E-H-P-P-V adicionando mais THF, um mililitro por vez, até que a absorbância medida em 495 nanômetros esteja na faixa de 0,13 a 0,17. Em seguida, prepare as nanopartículas pelo método de precipitação, transferindo um mililitro de uma solução mista de M-E-H-P-P-V-P-C-B-M para uma seringa de um mililitro com agulha acoplada. Rapidamente.Injete um mililitro da solução M-E-H-P-P-V-P-C-V-M homogeneizada em quatro mililitros de água deionizada sob agitação a 1200 RPM, interrompendo imediatamente após a injeção. Utilize essas nanopartículas sem processamento adicional para realizar a PDT em células incubadas com nanopartículas. Primeiro, rotule um conjunto de placas de 96 poços conforme indicado no protocolo textual.Em seguida, colete as células dos frascos de cultura removendo o meio e lavando as células duas vezes com solução salina tamponada com docos fosfato ou DPBS, seguido pela incubação das células com 0,05% de tripsina por 10 minutos, e adicione dois mililitros de meio Eagle modificado por Delcos suplementado com 10% de soro bovino fetal à solução celular resultante. Misture bem a solução para separar os aglomerados celulares em células isoladas. Transfira 100 microlitros da suspensão celular para 900 microlitros de DMEM suplementado com 10% de SBF, homogeneíze bem e coloque 10 microlitros dessa suspensão em um hemocitômetro.Conte as células utilizando o hemocitômetro e ajuste a concentração da suspensão celular para 50.000 células por mililitro. Em seguida, semeie a placa de 96 poços adicionando 50 microlitros da solução celular nos poços, semeando assim 2.500 células por poço. A seguir, prepare diferentes concentrações de nanopartículas adicionando 2.100 e 180 microlitros da suspensão de nanopartículas preparada ao DMEM para obter um volume final de dois mililitros.Após 24 horas, lave as cavidades com um X-D-P-B-S e adicione 50 microlitros de concentrações crescentes de nanopartículas nas cavidades. Cada linhagem celular possui triplicatas para cada concentração de nanopartículas. 24 horas após a adição das nanopartículas.Lave as células com um X-D-P-B-S e adicione 50 microlitros de solução salina balanceada de Hank ou HBSS a cada poço, para irradiar as células aqueça a lâmpada do simulador solar por 15 minutos. Coloque um filtro UV na frente da lâmpada para filtrar a luz UV. Calibre a lâmpada com uma célula solar de referência ajustando a potência da lâmpada para obter uma intensidade de 0,5 sol na superfície da placa de 96 poços aqui.Essa condição foi alcançada com 218 watts de potência fornecida à lâmpada. Coloque a placa de 96 poços sob a lâmpada com a tampa aberta e irradie as células por 60 minutos, o que resulta em uma dose de luz de 180 joules por centímetro quadrado após a radiação. Substitua o HBSS por 50 microlitros de DMEM, suplementado com 10% de FBS, e incube as placas pelos períodos de tempo respectivos após a terapia fotodinâmica.Após cada período de tempo, meça a viabilidade celular adicionando 10 microlitros de MTT ao poço. Incube a placa por quatro horas para permitir a formação de cristais. Em seguida, adicione 50 microlitros da solução de solubilização aos poços e incube a placa por seis horas.Para dissolver os cristais de formazina. Meça a viabilidade celular registrando a absorbância em 570 nanômetros com um leitor de microplacas para avaliar a citotoxicidade intrínseca das nanopartículas. Leia a placa de 96 poços sem aplicar PDT para medir a captação das nanopartículas.Detecção de ESP formadas após a PDT e detecção de apoptose e necrose após a PDT. Primeiro, ligue as lâmpadas do microscópio e o laser 30 minutos antes da aquisição de imagens. Coloque a placa de Petri contendo as células fixadas sobre a platina do microscópio.Colete a fluorescência proveniente das nanopartículas. O reagente de detecção RROS propídio iodo. Um XIN cinco fitsi e DPI sobreposição as imagens de contraste de fase e as imagens de fluorescência no ImageJ. Resultados representativos do software após incubação de nanopartículas com diferentes linhagens celulares são mostrados aqui.A linhagem celular Ocar mostra a maior captação, seguida pela 5 49 e pela MDA MB 2 31. A TE 71 não mostra qualquer fluorescência de nanopartículas. As medidas de viabilidade celular nessas linhagens celulares quando mantidas no escuro são mostradas pelos gráficos de barras aqui.Praticamente não há morte celular até 96 horas em nenhuma das linhagens celulares. A formação de ESP detectada pelo reagente revelador de ESP é mostrada aqui para a linhagem celular car três. Nesta amostra controle.Não há fluorescência verde, pois não há nanopartículas nem dose de luz. No entanto, quando as doses de nanopartículas e luz são aplicadas às células imediatamente após a PDT, pode-se observar a intensa fluorescência verde do reagente revelador de R os. A viabilidade celular após a DT é mostrada aqui pelo gráfico de barras para diversas doses de nanopartículas.Os resultados do experimento de coloração dupla com células vivas e mortas são mostrados aqui, no qual a linhagem celular de car três sofre necrose com dose elevada de luz, enquanto que em doses baixas de luz, as células sofrem morte apoptótica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar nanopartículas compostas de polímeros condutores para a aplicação em tratamentos de doenças baseados em terapia fotodinâmica.

photodynamic-therapy-with-blended-conducting-polymerfullerene

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

A terapia fotodinâmica (PDT) é um método não invasivo e não cirúrgico para o tratamento do câncer de pulmão. Os fotossensibilizadores se acumulam seletivamente no tecido tumoral e levam à morte das células tumorais na presença de oxigênio e no comprimento de onda adequado da luz. Neste vídeo de protocolo, o método baseado em PDT é usado para avaliar o potencial fototóxico de um potencial fotossensibilizador em células de câncer de pulmão.

Ensaio de fototoxicidade in vitro: um método baseado em PDT para avaliar o potencial fototóxico de um fotossensibilizador em células de câncer de pulmão

Moléculas de corantes orgânicos e nanopartículas de conversão ascendente revestidas com ácido oleico não são solúveis em água. Este protocolo descreve um método 'plug and play' que permite a transferência de moléculas de corantes orgânicos e partículas de conversão ascendente de seu solvente hidrofóbico inicial para a água.

Um método &#39;Plug and Play&#39; para criar Nanoassemblies dispersáveis ​​em água contendo um polímero anfifílicas, corantes orgânicos e Upconverting Nanopartículas

Um método para estimulação da atividade elétrica de culturas de células in vitro com luz visível é descrito.

Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Um protocolo é apresentado para a síntese e preparação de nanopartículas constituídas por polímeros eletroativos.

Propriedades eletroativo Polymer Nanopartículas Exhibiting fototérmicos

A terapia fotodinâmica (PDT) é uma escolha alternativa para o tratamento do câncer de pulmão. Para aumentar o efeito terapêutico da PDT, foram desenvolvidas nanopartículas direcionadas ao câncer de pulmão combinadas com quimioterapia. Foram avaliadas as eficácias anticancerígenas in vitro e in vivo da TFD com nanopartículas preparadas.

Anticancer eficácia da terapia fotodinâmica com Nanopartículas Lung Cancer segmentadas

A terapia fotodinâmica (PDT) é um procedimento médico que envolve a incubação de uma forma exógena aplicada fotossensibilizador (PS) seguido de fotoativação de luz visível para induzir apoptose. Apresentamos um protocolo em vitro PDT projetado para simular o PDT que pode ser usado para estudar as diferenças em incubação de PS e parâmetros de tratamento com luz.

Uma abordagem In Vitro para terapia fotodinâmica

A crescente incidência de albicanos candida resistentes a medicamentos é um sério problema de saúde em todo o mundo. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) pode oferecer uma estratégia para combater infecções fúngicas resistentes a medicamentos. O presente protocolo descreve a eficácia da APDT mediada por Rose bengala em uma cepa c. albicans resistente a multidrogas in vitro.

Terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengala para inibir a candida albicans

Aqui, descrevemos um dispositivo novo, simples e de baixo custo para realizar com sucesso ensaios de terapia fotodinâmica in vitro (TFD) usando cultura de células HeLa bidimensionais e verteporfina como fotossensibilizador.

Um dispositivo de terapia fotodinâmica interno construído internamente e baseado em diodo emissor de luz para melhorar a citotoxicidade da verteporfina em um modelo de cultura de células 2D

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