Photopatterning proteínas e células em Aqueous Ambiente Usando TiO

O objetivo geral do seguinte experimento é realizar a modificação da superfície de uma estrutura para cultivo celular utilizando a atividade fotocatalítica do dióxido de titânio. Isso é conseguido depositando-se uma camada fina de dióxido de titânio sobre uma lamínula de vidro e, em seguida, revestindo-a com octa dessalina para tornar toda a superfície hidrofóbica. Como segunda etapa, o substrato é bloqueado imergindo-o em meio de cultivo celular contendo albumina sérica.

A albumina absorve-se à superfície e torna-a não permissiva à adesão celular. Em seguida, a amostra é transferida para uma solução aquosa contendo colágeno e uma luz UV focalizada é então usada para irradiar a superfície. Isso permite que as moléculas de colágeno se liguem seletivamente à região fotoirradiada e torna a região permissiva à adesão celular.

Esse processo pode ser repetido com o objetivo de padronizar múltiplas proteínas ou tipos celulares. Mostramos neste vídeo como a região adesiva de células PC 12 pode ser modificada seletivamente por meio de irradiação UV. Tivemos a ideia inicial para este método ao perceber que a fotocatálise do dióxido de titânio é aplicada comercialmente em janelas de vidro autolimpantes, que removem contaminantes orgânicos da superfície mediante radiação luminosa, demonstrando que o procedimento será conduzido por um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Comece numerando as lamínulas usando um riscador de diamante de forma que facilite garantir que o lado correto da amostra esteja voltado para cima. Em seguida, limpe as lamínulas primeiro sob água duplamente destilada corrente, depois imergindo-as em solução piranha por 10 minutos. Após 10 minutos, enxágue as lamínulas oito vezes com água duplamente destilada e seque-as com fluxo de nitrogênio.

Em seguida, coloque um alvo de óxido de titânio em um sistema de pulverização catódica por radiofrequência e prenda as lamínulas limpas no porta-amostras utilizando fita de poliamida. Posicione o porta-amostras na câmara de pulverização e evacue a câmara até que a pressão atinja 2,0 vezes 10 à potência de menos quatro pascals. Em seguida, introduza gás argônio na câmara e ajuste a pressão de deposição para 4,0 militar, mantendo o obturador fechado. Aumente gradualmente a potência de RF até 70 watts.

Em seguida, abra o obturador e faça a pulverização por 15 minutos para obter um filme com espessura entre 120 e 150 nanômetros. Comece secando um béquer de vidro e uma pinça em uma estufa a 120 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, coloque as lamínulas em um reator de plasma e trate a superfície de dióxido de titânio com plasma de oxigênio por cinco minutos a 200 watts, com um fluxo de oxigênio de 100 centímetros cúbicos padrão por minuto, para criar uma superfície mais hidrofílica.

Em seguida, remova as amostras e imerja-as em água bidestilada para confirmar que a superfície é superhidrofílica e seque bem a superfície com fluxo de nitrogênio. A seguir, transfira as amostras, o béquer seco e as pinças para uma bolsa de luvas preenchida com nitrogênio e prepare uma solução de um milimolar de octodesiltricloroetileno dissolvido em tolueno. Imerja a amostra na solução por uma hora à temperatura ambiente para formar uma camada molecular auto-organizada sobre o óxido de titânio.

Em seguida, remova quaisquer moléculas de fásor por lavagem da amostra em tolueno, acetona e etanol, e, por fim, água bidestilada por cinco minutos cada. Depois, enxágue a amostra quatro vezes em água bidestilada fresca e seque a superfície com fluxo de nitrogênio.

Esterilize as lamínulas revestidas imergindo as amostras em etanol 70% por cinco minutos. Em seguida, lave as amostras duas vezes com água destilada estéril. A seguir, coloque a amostra em uma placa de 35 milímetros e adicione dois mililitros de meio de crescimento para PC12.

Incube as amostras por pelo menos três horas em uma incubadora tamponada com CO2 a 37 graus Celsius, enquanto a albumina sérica do meio adere à superfície das lamínulas, durante a espera. Configure o microscópio de fluorescência invertido ligando primeiro a lâmpada de arco. Em seguida, insira o cubo de filtro UV e gire a lente objetiva para uma com magnificação de 20 x.

Meça a intensidade da luz com um medidor de intensidade UV e calcule o tempo de irradiação para uma dose de 200 joules por centímetro quadrado. Em seguida, utilize um micrômetro de estágio e ajuste o diâmetro da região a ser irradiada para 200 micrômetros, regulando o diafragma de campo. Após a incubação de três horas, complemente o meio que recobre as lamínulas com 200 microlitros de colágeno tipo quatro a 3,0 miligramas por mililitro.

Em seguida, transfira a placa de 35 milímetros para a platina do microscópio e foque o microscópio na superfície da amostra utilizando as marcas de risco. Irradie uma área do lamínula com luz UV em uma dose de 200 joules por centímetro quadrado. Em seguida, substitua o meio por dois mililitros de meio de crescimento fresco, com NGF e sem colágeno tipo quatro, e retorne a amostra ao incubador.

Colete as células PC12 diferenciadas por NGF em cultura em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue o tubo a 150 × g durante quatro minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e adicione um mililitro do meio de crescimento. Re-suspenda as células pipetando suavemente para cima e para baixo usando um hemocitômetro.

Conte a densidade celular e adicione 3,0 vezes 10 à quinta células a uma placa de 35 milímetros contendo lamínulas modificadas. Incube a placa por um a dois dias em um incubador com 5% de CO₂ a 37 graus Celsius, após um a dois dias de cultivo na superfície modificada XC dois. Utilize um microscópio para confirmar que as células estão se aderindo e crescendo apenas na região irradiada com UV das lamínulas.

Em seguida, adicione 67 microlitros de colágeno tipo IV ao recipiente com as células cultivadas para que a concentração final de colágeno seja de 100 microgramas por mililitro com o microscópio configurado para padronização de superfície. Coloque o recipiente na platina do microscópio e posicione a região de irradiação adjacente à localização atual das células. Irradie a lamínula com luz UV numa dose de 200 joules por centímetro quadrado.

Após a irradiação, substitua o meio por um sem colágeno e coloque a amostra de volta na incubadora, tentando concluir o processamento de uma única amostra dentro de 30 minutos. Esta é uma imagem de microscopia eletrônica de varredura em corte transversal do filme de dióxido de titânio depositado por pulverização catódica. A partir da observação, a espessura do filme foi estimada em aproximadamente 150 nanômetros.

Observa-se também aqui a planicidade do filme de dióxido de titânio depositado. Uma análise adicional por microscopia de força atômica revelou que a rugosidade quadrática média da superfície era de apenas 0,2 nanômetro. O colágeno tipo IV e a solução são absorvidos preferencialmente na região irradiada por UV, onde a albumina é deslocada pelo laser.

Para demonstrar a versatilidade desta abordagem, outras proteínas, como a fibrina, também foram padronizadas utilizando a mesma técnica. Aqui, as células estão crescendo na região padronizada em dois padrões do XC na lamínula e logo ao lado delas, na área definida pela linha tracejada. A lamínula foi recentemente irradiada com UV in situ em dois e revestida com colágeno do tipo quatro.

Nos próximos cinco dias, as células proliferam e migram para cobrir a região recém-codificada. O procedimento apresentado aqui pode ser empregado para manipular arbitrariamente células em cultura e, potencialmente, para padronizar múltiplos tipos de células a fim de construir sistemas elaborados de co-cultura em camadas.