Estudar a função da proteína eo papel da expressão proteína alterada pela interferência de anticorpos e reconstruções tridimensionais

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar as funções das proteínas e o papel da expressão alterada da proteína de maneira eficiente e rigidamente controlada. Isso é conseguido aplicando anticorpos para reduzir a quantidade de proteína funcional disponível para a célula. Para conseguir isso, os anticorpos são acoplados a um peptídeo chamado Chariot, que medeia uma passagem através das membranas celulares.

Em seguida, as estruturas celulares de interesse são fotografadas e reconstruídas em 3D para avaliar os efeitos do tratamento. Os resultados revelam que os peptídeos Chariot são particularmente adequados para atingir proteínas nucleares por interferência de anticorpos. As principais vantagens dessa técnica em relação aos métodos existentes, como a interferência de RNA, são que os anticorpos transportados para a célula são eficazes imediatamente e que o pesquisador pode controlar estritamente o grau de interferência ajustando as dosagens de anticorpos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as funções das proteínas em muitos tipos de células, é particularmente interessante para direcionar proteínas em culturas neuronais primárias, que são muito sensíveis aos tratamentos, mas toleram muito bem o Chariot. Na preparação, ressuspenda o pó de peptídeo de carruagem liofilizado em água estéril a dois microgramas por microlitro. Bata no tubo com cuidado para misturar o pó na solução.

Em seguida, prepare pequenas alíquotas de trabalho, apenas dois microlitros são necessários para cada reação, e armazene as alíquotas a 20 graus Celsius. Em seguida, prepare as células de mamíferos para a transfecção, semeando-as em uma placa de 24 poços com meio mililitro de meio contendo antibióticos. Ao usar neurônios, semeie as células apenas nas duas fileiras centrais e em baixa densidade.

Os poços vazios são úteis mais tarde. Seja rápido. Os neurônios cultivados não devem ficar fora da incubadora por mais de alguns minutos.

Até que os neurônios estejam no estágio de desenvolvimento desejado, troque cerca de um quarto a metade de seu meio duas vezes por semana. Culturas não neuronais devem ser usadas quando as células estiverem a 50% de confluência. O procedimento a seguir é mostrado para seis testes e seis amostras de controle.

Para cada carga, prepare uma diluição de 0,1 a 2 microgramas em 50 microlitros de 1X PBS por amostra. Complexos macromoleculares de anticorpos primários e secundários pré-ligados também podem ser usados como carga. Misturar a solução com um vórtice suave, seguido de uma breve centrifugação.

Em seguida, dilua dois microlitros de solução estoque de carruagem em 50 microlitros de PBS para cada reação. Use tubos separados para cada amostra, a fim de evitar a auto-associação da Carruagem. Agora, combine as proteínas preparadas nas diluições do Chariot.

Misture e gire as proteínas combinadas. Incube a amostra por 30 minutos em temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de carga Chariot. A quantidade ideal de peptídeo proteico depende da carga e do tipo de célula usada.

Portanto, esse valor deve ser determinado empiricamente. Com antecedência, pré-aqueça algum meio de crescimento sem aditivos, bem como 1X PBS contendo 0,5 milimolar de cloreto de magnésio e cloreto de cálcio a 37 graus Celsius. Agora, para começar, dilua os complexos de carruagem preparados com 100 microlitros de meio.

Remova o meio das células revestidas e transfira para os poços vazios para reutilização. Em seguida, lave as células suavemente com 500 microlitros de solução pré-aquecida de 1X PBS, cálcio e cloreto de magnésio. Aplique o meio que transporta os complexos Chariot até as células e balance a placa suavemente para garantir uma distribuição uniforme da solução.

Retorne rapidamente as células à incubadora e aguarde uma hora antes de precedir. Para neurônios, após uma hora de incubação, transfira o meio salvo para os poços. Para todas as outras células, adicione soro a uma concentração final de 10%Os neurônios cultivados são muito sensíveis, como mudanças na temperatura do meio e no pH.

Portanto, essas células devem ser lavadas e transfectadas suavemente com soluções pré-aquecidas e devolvidas à incubadora o mais rápido possível. Continue a incubação pelo tempo que for necessário, dependendo da carga transfectada e do tipo de célula. Após a incubação, processar as células para análises subsequentes, como de costume.

Os protocolos de fixação, bem como a imagem ao vivo, são compatíveis com esta técnica. Usando um microscópio de varredura a laser com uma lente 63X, tire imagens a uma distância de aproximadamente 0,25 a 0,5 mícron para obter pilhas Z de detalhes suficientes, evitando o branqueamento. A distância precisa da camada depende do tamanho da estrutura a ser reconstruída e precisa ser determinada individualmente.

Para reconstrução de imagem, abra os arquivos LSM no Imaris. Com este software, o botão Escape é usado para alternar entre Selecionar e Navegar. Além disso, vários objetos podem ser selecionados mantendo pressionada a tecla Control.

Usando o Ajuste de exibição, entre em cada canal e ajuste o contraste até que as estruturas mais brilhantes atinjam a saturação. Esse ajuste não influencia a construção da superfície, mas ajuda a limitar a imagem. Se o objeto a ser reconstruído estiver contido em arquivos diferentes, use a função Editar e Adicionar fatias para combinar os arquivos correspondentes.

Em seguida, clique no ícone Adicionar novas superfícies e selecione Segmentar apenas uma região de interesse. Agora, ajuste as margens da caixa de seleção para caber no objeto de interesse. Ajuste a forma e a inclinação da forma retangular até que todas as estruturas necessárias estejam dentro da caixa.

A seleção precisa ser ajustada em cada imagem em todo o plano Z. Objetos indesejados podem ser removidos posteriormente. Em seguida, selecione um canal apropriado.

Para continuar, use a ferramenta de limite para reconstruir a estrutura de interesse. O nível de detalhe da área de superfície, ou diâmetro da esfera, deve ser definido para corresponder às estruturas que estão sendo reconstruídas. Dependendo das características do sinal, a intensidade absoluta ou o contraste local podem ser usados.

Geralmente, o contraste local funciona melhor para sinais difusos. Devido às características desse sinal, o contraste local é usado para reconstruir a proteína dentro do núcleo. Em qualquer caso, as configurações precisam ser ajustadas separadamente para cada sinal ou estrutura de interesse.

Conclua a reconstrução clicando na seta verde na parte inferior da tela. Em seguida, ajuste o objeto ainda mais usando a ferramenta Lápis. Compare cuidadosamente as reconstruções com o sinal original e corte e remova superfícies inclinando as imagens conforme necessário para que a ferramenta Cortar possa servir com precisão ao seu propósito.

Agora, meça o volume, a área e as intensidades de cada superfície selecionando Estatísticas, Estatísticas detalhadas e Valores médios. Se desejado, as estatísticas codificadas por cores podem ser produzidas selecionando a guia Cor da superfície correspondente e alterando a opção selecionada de Base para Codificada por estatística. Empregando a ferramenta Tirar instantâneo, as fotos podem ser tiradas para publicação.

Se vários objetos dentro da mesma região forem reconstruídos, a função Armazenar Parâmetros poderá ser usada para salvar as informações. O Simiate expresso em células HEK293 foi especificamente detectado por anticorpos Simiate transportados para as células por peptídeos Chariot. As assembleias de anticorpos Simiate entram no soma, bem como no núcleo, após a aplicação, onde co-localizam especificamente com o FLAG-Simiate conforme marcado pelas setas amarelas.

De maneira dose-dependente, os anticorpos Simiate induziram apoptose maciça em células HEK293, enquanto os anticorpos de controle não tiveram efeito. Dado que as células neuronais são muito sensíveis aos efeitos tóxicos, a técnica foi aplicada a culturas primárias do hipocampo, onde não houve efeito sobre a viabilidade dos neurônios ao comparar células simuladas, ou não tratadas, e tratadas com Chariot. Seguindo o mesmo esquema de aplicação, conjuntos de anticorpos anti-cobaia Alexa568 de cabra foram vistos em cerca de 83% das células onde ocorreram em somata, bem como núcleos em graus variados.

Essas observações foram ainda apoiadas por uma análise 3D, que foi consistente com os resultados das células HEK293. Portanto, a técnica Chariot pode ser usada com sucesso para transfectar neurônios primários dissociados do hipocampo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a seis horas, se executada corretamente.

A complexa formação de Chariot e a proteína de interesse leva cerca de 40 minutos. Para transfectar as células com esses complexos, levará 70 minutos e mais uma a quatro horas, dependendo do tamanho e das propriedades da carga. Após esse procedimento, outros métodos podem ser realizados para analisar a função de uma proteína com mais detalhes, como imagens ao vivo e ensaios de motilidade, análises e registros eletrofisiológicos.