Name: Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Aprenda a fabricar microeletrodos íon-seletivos de cano duplo e concêntricos para medir sinais iônicos extracelulares em fatias de hipocampo de camundongo. Este método permite analisar dinâmicas de potássio e sódio durante atividade neuronal.

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Os autores agradecem a C. Rodrigo de assistência técnica especializada. Agradecemos S. Köhler (Centro de Imagem avançada, Heinrich Heine University Duesseldorf) para obter ajuda na produção de vídeo. Pesquisa no laboratório do autor foi financiado pela Associação Alemã de Pesquisa (DFG: Ro 2327 / 8-1 para CRR), a Universidade Heinrich Heine Duesseldorf (a NH) e pelo National Institutes of Health conceder R01NS032123 (a MC).

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Líquido à base de transportadora, eletrodos íon-seletivo têm sido empregados com sucesso por décadas e por muitos íons, sensores altamente específicas estão disponíveis 22-26. Quando usado no espaço extracelular (ECS) de preparações de cérebro de vertebrados, deve-se ter em mente, no entanto, que esta é uma técnica bastante invasivos: enquanto a largura da ECS é apenas cerca de 20-50 nm, o diâmetro de íon-seletivo microeletrodos é cerca de 1 um (eletrodos dois canos) ou maiores (eletrodos concêntricos). As pontas de microeletrodos íon-seletivo, assim, não só irá danificar o tecido durante o seu empalamento do tecido, mas também ampliar o ECS, favorecendo uma subestimação dos transientes de íon. Apesar dessas armadilhas, transientes de iões extracelulares em resposta à atividade neuronal são notavelmente consistentes entre os diferentes laboratórios de 7,8, que atestam a confiabilidade desse método. O desempenho e adequação dos eletrodos íon-seletivoé dependente da sua sensibilidade e selectividade, que é definida pelo sensor de cocktail (&#39;ionóforo membrana líquida&#39;) utilizado. Sensor cocktails conter uma molécula transportadora especial, por exemplo, valinomicina para K + microeléctrodos selectivos que apresenta uma elevada selectividade para a 27 potássio. Não obstante, a reactividade cruzada com outros iões podem ocorrer e deve ser testado. Valinomicina apresenta uma reactividade cruzada significativa nas pesquisas de amónio, que tem que ser considerado na interpretação dos resultados (por exemplo, 11,12). Além disso, porque a resposta de tensão dos ionóforos segue um comportamento Nernstiana (cf. equação 1), a relação sinal-ruído e limiar de detecção dependem da concentração do ião a ser medido. Assim, enquanto os pequenos [K +] o transientes evocar grandes variações de tensão contra a baixo da linha de base [K +] o, pequeno [Na +] o transientes são muito mais difíceis de detectar contra o oiGH basal [Na +] o (cf. Figura 5 e 6). O desempenho dos eléctrodos selectivos de iões também é determinada pela resolução temporal, o que é fortemente regulado por a sua constante de tempo eléctrica. O último é principalmente determinada pela resistência axial do sensor, e pela capacitância distribuída ao longo do comprimento da pipeta, entre as suas soluções internas e o fluido externo. Na configuração de cano duplo, a resistência é alta, devido à longa coluna de sensor de ião de enchimento. Para um dado dieléctrica isolante (neste caso, vidro de borosilicato), a capacitância é governada pela espessura dieléctrica. Em eléctrodos de dois canos, o dieléctrico largura eleva-se a parede de vidro da pipeta. Como o vidro thins perto da ponta, a largura dielétrico cai, e a capacitância aumenta. Esses fatores se combinam para produzir eletrodos com tempos de resposta que variam de várias centenas de milissegundos a váriossegundos, uma vez que estes factores são variados. Uma grande vantagem da concepção concêntrica é que tanto a resistência axial e a capacitância para o banho são grandemente diminuídos. As derivações de pipeta concêntricos maioria da resistência do permutador de iões utilizados no enchimento, deixando apenas um remanescente nos últimos poucos micrómetros antes da ponta. Além disso, a solução de enchimento no interior da pipeta concêntrica é fisicamente afastado do banho, separadas por a espessura de duas paredes de vidro, reduzindo grandemente a capacitância. 10 Como mostrado anteriormente, o efeito combinado da reduzida resistência e capacitância é uma melhoria na resolução temporal de duas ordens de grandeza. No caso de concêntricos de Ca2 + e do pH micro-eléctrodos, os tempos de resposta de 90% foram tão baixas como 10 10-20 ms. Uma vantagem relacionada com o desenho do concêntrico é o nível de ruído mais baixo (ver Figura 8). Devido à resistência muito reduzida, transitórios de tensão a partir de qualquer ambient de ruído são minimizados. Além disso, a recuperação a partir de tais transientes é rápida, devido à constante de tempo rápido. Tais artefatos são, portanto, pequeno e rápido, e têm um efeito menos prejudicial em gravações fisiológicas (cf. Figura 8). Existem também desvantagens da técnica concêntrica. Em primeiro lugar, a sua montagem é mais complexo e demorado. Uma segunda desvantagem é a necessidade de colocar um microeléctrodo de referência separado, com a sua ponta, o que implica a utilização de qualquer um micromanipulador separado ou uma dupla manipulador especializado. Finalmente, microeléctrodos duplos de cano pode ser estendido para um design triplo de cano, permitindo a detecção de duas espécies diferentes de iões, ao mesmo tempo 28, o que não é possível para os eléctrodos concêntricos. Armadilhas mais comuns Silanização ineficiente. O passo mais importante, e obstáculo principal a fabricação de qualquer líquido-sensou microeletrodos íon-seletivo com base é o procedimento silanização. Quando eléctrodos não conseguem responder a alterações na concentração de ião específico ou responder com uma resposta sub-Nernstiana (ou seja, bem inferior a 58 mV por diferença de concentração de dez vezes), fraca eficácia de silanização é tipicamente a causa. Em nossa experiência, isso pode ocorrer se a humidade atmosférica é muito alto ou muito baixo, típico de condições no auge do verão, ou inverno, respectivamente. Se for viável a exercer algum controlo sobre a humidade ambiente, estes problemas podem ser superados. Resistência do eléctrodo é demasiado elevada. Se necessário, a resistência do tambor sensível aos iões pode ser reduzida por biselamento. Para este fim, expor a sua dica para um forte jato de um abrasivo em suspensão na água por um par de segundos. Isto fará com que a sua ponta ao máximo para quebrar e diminuir a resistência ao valor desejado. Pontes de sal. Salpontes entre os barris de iões e os eléctrodos de referência resultar em mal ou-nada, portanto, responder e pode também confunde bastante o seu desempenho na calibração. Como mencionado acima (ver ponto 1.6.), Este é principalmente um problema quando o vidro teta de cano duplo é escolhido, mas é uma ocorrência rara quando se usa o deslocamento, a técnica de cano retorcido descrito aqui. Com facilidade de fabricação em mente, o design de cano duplo original da Lux 29 pode muitas vezes ser utilizado de forma lucrativa. Este método utiliza a pré-enchimento dos barris de iões e de referência com soluções salinas, uma rápida exposição a uma solução de silano por sua aspiração e expulsão a partir da ponta, a seguir, por incorporação de permutador de iões, também através da ponta (ver 30,31) . Estes eléctrodos podem ser fabricada em cerca de 10 minutos, mas o tamanho da ponta é, tipicamente, 4 mm ou mais e que são mais propensos a falhar durante um experimento. Em contraste, os métodos de silanização que envolvem a exposição ao vapor e calor silanoing pode produzir eletrodos com dicas menores que duram dias, e às vezes semanas. Tomados em conjunto, existem vários protocolos e aproxima-se sobre a forma de preparar micro-eléctrodos selectivos de iões. Aqui, descrevemos dois procedimentos principais para a fabricação de microeletrodos dois canos, bem como concêntricos torcidos que funcionam bem e de forma confiável em nossos laboratórios, com uma taxa de sucesso global de perto de 100%. Importante, estas técnicas podem ser transferidas para a medição de outras espécies, incluindo iões de cálcio ou de pH, e será igualmente aplicável a outras preparações do que o cérebro, incluindo cavidades cheias de líquido ou líquidos em geral. Por último, mas não menos importante, microeletrodos íon-seletivo permitir a determinação da concentração de íons no interior das células. Devido ao seu tamanho relativamente grande ponta (~ 1 mm), isto, no entanto, ser possível somente em células com um corpo de grandes células, por exemplo, tal como se encontra nas preparações de invertebrados 28,32.

An author's middle initial was omitted from the publication, <a href="http://www.jove.com/video/53058/double-barreled-concentric-microelectrodes-for-measurement">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue</a>. The author&#39;s name has been updated to:
Christine R. Rose
from:
Christine Rose

A correction was made to Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.

Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

A sinalização elétrica no cérebro é baseada no fluxo de íons através das membranas plasmáticas. Os principais movimentos iônicos de e para o espaço extracelular não são apenas mediados pela passagem por canais iônicos dependentes de voltagem, mas também por receptores ionotrópicos pós-sinápticos, bem como transportadores de íons. A atividade neuronal é, portanto, acompanhada por mudanças complexas na concentração extracelular de todos os íons principais 1. Por exemplo, o influxo de sódio nos neurônios durante a atividade excitatória demonstrou resultar em uma diminuição na concentração extracelular de sódio ([Na+]o) 2. O mesmo vale para a concentração extracelular de cálcio porque os íons de cálcio entram rapidamente nas estruturas pré e pós-sinápticas 3. Ao mesmo tempo, o potássio se move na direção oposta e isso medeia um aumento na concentração extracelular de potássio ([K+]o) na faixa de mM baixo 4,5. A atividade sináptica também causa alterações no pH extracelular que são parcialmente mitigadas por fluxos concomitantes da membrana glial que alteram o pH intraglial 6,7. Essas mudanças relacionadas à atividade nas concentrações de íons extracelulares têm consequências funcionais significativas. Por exemplo, mesmo pequenos aumentos em [K +] o despolarizam neurônios, bem como células gliais, alterando assim a excitabilidade neuronal, e existem vários mecanismos para remover o excesso de potássio 8. A falha destes pode resultar em atividade epileptiforme dos neurônios ou fenômenos como depressão disseminada 1. 
Devido à sua importância crítica, a determinação quantitativa das concentrações de íons extracelulares é frequentemente necessária e exigida para entender a função e a disfunção das redes neurais em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Durante décadas, microeletrodos seletivos de íons de barril duplo provaram ser excelentes ferramentas para tais medições no tecido cerebral 9. Para muitos íons, sensores altamente específicos com baixa reatividade cruzada para outros íons estão disponíveis. Além dos eletrodos clássicos de barril duplo, os chamados eletrodos concêntricos foram introduzidos recentemente. Estes últimos fornecem uma resolução de tempo superior, mas levam um pouco mais de tempo e esforço para construir 10. 
A seguir, descreveremos a preparação e calibração desses dois tipos de microeletrodos seletivos de íons. Em seguida, mostramos como esses eletrodos podem ser empregados em preparações de fatias cerebrais para medição de mudanças em [K+]o ou [Na+]o induzidas por atividade excitatória seguindo diferentes paradigmas de estimulação, incluindo banho e aplicação de drogas sob pressão.

<table><tbody><tr><td>Abrasivo&nbsp; &nbsp;</td><td>MicroPolish&nbsp;</td><td>Buehler GmbH</td><td>Dissolvido em capilares</td></tr><tr><td>de vidro borossilicato</td> A.dest <td>1405059</td><td>Hilgenberg</td><td>Aplicação pipeta; 75 mm x 2 mm, espessura de parede 0,3 mm</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato com filamento</td><td>GC 150 F-15&nbsp;</td><td>Clark Electromedical Instruments, Aparelho Harvard</td><td>Para o sensor de microeletrodos de cano duplo&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato com filamento</td><td>GC100-F-15</td><td>Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus</td><td>Para referência de microeletrodos de cano duplo&nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato com filamento</td><td>GB-200TF-15&nbsp;</td><td>Produtos científicos</td><td>Concêntrico, canal externo. O.D. 2.0 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato com filamento</td><td>GB-120TF-10</td><td>Science Products</td><td>Canal interno concêntrico. O.D. 1.2 mm</td></tr><tr><td>Digidata</td><td>1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de eletrômetro com headstage</td><td></td><td>Feito sob medida</td><td>Rin = 10 T&Omega; e Ibias=50 fA-1pA (alternativas disponíveis comercialmente: e.g. Dagan IX2-700, com headstage (resistor de feedback de 10 Gig) ou EPMS-07, NPI, Tamm, Alemanha)</td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td> experimental <td>Feita sob medida</td><td>Disponível comercialmente em e.g. &nbsp; Warner Instruments, EUA; &nbsp; Scientifica, Reino Unido</td></tr><tr><td>Forno</td><td></td><td>Heraeus</td><td>Deve permanecer constante em 200 &deg; C</td></tr><tr><td>Cera pegajosa dura / cera dental&nbsp;</td><td>Deiberit 502&nbsp;</td><td>Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH</td><td></td></tr><tr><td>Placa</td><td></td> de aquecimento <td>Feita sob medida</td><td>Deve permanecer constante em 40 & C</td></tr><tr><td>Suporte de microeletrodos feito de plexiglas</td><td></td><td>Feito sob medida</td><td>Duplo-barril: O.D. &nbsp; capilares de 1,5 mm, concêntricos: O.D.&nbsp; capilares 2 mm</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td></td><td>Leitz</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>MD4R</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Estéreo</td><td>M205C</td><td>Plano Objetivo Leica</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0.8xLWD</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Pipetas</td><td>Modelo PP-830</td><td>Narishige</td><td>Microeletrodos concêntricos&nbsp;</td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Modelo P-97</td><td>Sutter Instruments&nbsp;</td><td>Sensor de microeletrodos concêntricos&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema pneumático de ejeção de drogas</td><td>Picospritzter Tipo II</td><td>Válvula Geral TM Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Estágio de cauda de andorinha de viagem</td><td>DT 25/M</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>Cola de dois componentes</td><td>&nbsp; Araldite</td><td>Huntsman advanced materials GmbH</td><td>Pode-se também usar uma pequena faixa de papel alumínio para colar os capilares juntos&nbsp;</td></tr><tr><td>Silverwire</td><td>99,9%&nbsp;</td><td>Wieland Edelmetalle</td><td></td></tr><tr><td>Slicer / Vibratome</td><td>Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>AxoScope 8.1&nbsp;</td><td>Extrator vertical Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tipo PE-2</td><td>Narishige Scientific Instruments</td><td>Com um mandril revolvável para&nbsp; microeletrodos de cano duplo</td></tr><tr><td>x/y estágio</td><td></td> translacional <td>Feito sob</td><td></td>medida</tr><tr><td>1(S),9(R)-(&minus;)-Metiodeto de bicuculina</td><td>Sigma aldrich</td><td>14343</td><td>Antagonista competitivo dos receptores GABAA (sensível à luz); CUIDADO tóxico</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma aldrich</td><td>C-127</td><td>AMPA/antagonista do receptor de cainato; CUIDADO:</td></tr><tr><td>tóxico Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>antagonista do receptor NMDA; CUIDADO</td></tr><tr><td>tóxico Hexametildisilazane (HMDS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>440191</td><td>CUIDADO: Inflamável, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) e corrosivo para metais e pele</td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma aldrich</td><td>A9256</td><td>Ativa NMDA e não-NMDA e EAATs</td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico sal monossódico hidratado</td><td>Sigma aldrich</td><td>G1626</td><td>Ativa NMDA-R, AMPA-R, QA-R e KA-R),&nbsp; mGluRs e EAATs</td></tr><tr><td>Ionóforo de potássio I - coquetel B</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>60403</td><td>À base de valinomicina; CUIDADO tóxico</td></tr><tr><td>Ionóforo de sódio II - coquetel A</td><td>Fluka&nbsp; &nbsp;</td><td>71178</td><td>Baseado em ETH 157</td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inibidor de canais de Na+ dependentes de tensão; CUIDADO tóxico</td></tr><tr><td>Água, ultra puro</td><td>Sigma aldrich</td><td>W3500&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de extracelular ion signals no tecido cerebral

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

A atividade elétrica no cérebro é acompanhada por fluxos iônicos significativos através das membranas, resultando em mudanças complexas na concentração extracelular de todos os íons principais. Como esses deslocamentos iônicos têm consequências funcionais significativas, sua determinação quantitativa é frequentemente necessária para entender a função e a disfunção das redes neurais em condições fisiológicas e fisiopatológicas. No presente estudo, demonstramos a fabricação e calibração de microeletrodos íon-seletivos de barril duplo, que provaram ser excelentes ferramentas para tais medidas no tecido cerebral. Além disso, os chamados microeletrodos seletivos de íons "concêntricos" também são descritos, que, com base em seu design diferente, oferecem uma resolução temporal muito melhor de mudanças rápidas de íons. Em seguida, mostramos como esses eletrodos podem ser empregados em preparações agudas de fatias cerebrais do hipocampo de camundongos. Usando microeletrodos seletivos de potássio de cano duplo, são demonstradas alterações na concentração extracelular de potássio ([K+]o) em resposta à aplicação exógena de agonistas do receptor de glutamato ou durante a atividade epileptiforme. Além disso, ilustramos as características de resposta de eletrodos sensíveis ao sódio, de duplo cilindro e concêntricos e comparamos a detecção de alterações na concentração extracelular de sódio ([Na+]o) evocadas pelo banho ou aplicação de pressão de drogas. Essas medições mostram que, embora as amplitudes de resposta sejam semelhantes, os microeletrodos concêntricos de sódio exibem uma relação sinal-ruído e tempo de resposta superiores em comparação com o design de cano duplo. Geralmente, os procedimentos demonstrados serão facilmente transferíveis para a medição de outras espécies de íons, incluindo pH ou cálcio, e também serão aplicáveis a outras preparações.

<html> Para monitorar [K +] o e modificações das mesmas, em resposta a actividade excitatória, um microeléctrodo de cano duplo de potássio-selectivo foi inserido no estrato radiante de CA1 área. Poucos minutos depois empalação, o barril selectivo de iões do eléctrodo alcançado uma linha de base estável (Figura 7A), que corresponde a uma [K +] o de cerca de 2,8 mm, um valor perto da [K +] do ACSF utilizado ( 2,5 mM). Aplicação do banho de glutamato 0,5 mM durante 10 seg induziu um aumento reversível na [K +] o por cerca de 4 mm, seguida por uma subestimativa abaixo da linha de base no valor de ~ 0,7 mM (Figura 7A). A redução da concentração de glutamato a 0,4, 0,3, e 0,2 mM provocou uma redução correspondente na amplitude de ambos o aumento transitório e a subestimativa em [K +] o (Figura 7A). oad / 53058 / 53058fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. transientes extracelular de potássio em resposta a actividade excitatória. (A) [K +] o transientes, que consiste em um aumento seguido por uma subestimativa abaixo da linha de base, induzida por aplicação de banho de diferentes concentrações de glutamato durante 10 seg, como indicado. (B) Influência de uma perfusão com bloqueadores de receptores de glutamato (100 ^ M, CNQX; APV, 100 uM) e tetrodotoxina (TTX; 0,5 uM) em [K +] o transientes induzida por aplicação de banho de glutamato 0,5 mM, durante 10 seg. (C) espontânea [K +] o transientes na presença de 0mg 2+ / BIC. Experimentos mostrados na AC foram realizadas utilizando eletrodos de dois canos. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, cl</a>ick aqui para ver uma versão maior desta figura. Experiências anteriores mostraram que tais [K +] sinais de o induzida por glutamato não são alterados de forma significativa durante a aplicação da TTX, e são, portanto, em grande parte independente sobre a abertura de canais de sódio voltagem-dependentes e ação neuronal potencial de geração de 15,16. Para estudar os mecanismos subjacentes às observadas [K +] o mudanças em resposta ao glutamato, aplicou-se bloqueadores de receptores de glutamato, ou seja, CNQX (100 uM; bloqueador de receptores AMPA) e APV (100 uM; bloqueador de receptores de NMDA) na presença de TTX (0,5 ^ M). Após a perfusão de banho com esses bloqueadores, induzida por glutamato [K +] o mudanças foram praticamente abolidas, confirmando a sua dependência em relação à abertura de canais de receptores de glutamato ionotrópicos como relatado anteriormente (por exemplo, 17; Figura 7B). Para demonstrar ainda mais o tele relevância glutamatérgica de excitação para a geração de matriz extracelular [K +] sinais, fatias foram perfundidos com solução salina nominalmente Mg2 + -livre contendo 10 uM metiodeto de bicuculina (2+ 0mg / BIC). Isto alivia a tensão dependente de Mg2 + de receptores NMDA -bloco e atenua a inibição bloqueando os receptores de GABA A, fazendo com que a actividade epileptiforme recorrente espontânea na rede (por exemplo, 18,19). Como esperado 20, espontâneo, recorrente [K +] o transientes, no valor de cerca de 1,5 mM foram detectados em 0mg 2+ / salina BIC (Figura 7C). Entre essas respostas, menor [K +] o transientes com uma amplitude média de cerca de 0,2 mM ocorreu (Figura 7C). Em um segundo conjunto de experimentos, usamos [Na +] microeletrodos sensíveis ao determinar [Na +] • mudanças evocadas pela aplicação deagonistas de glutamato. Aqui, nós também comparou as características de resposta de microeletrodos de cano duplo e concêntricas que empregam dois paradigmas de aplicação diferentes. [Na +] microeléctrodos sensíveis ao foram posicionados no stratum radiatum, a uma profundidade de cerca de 50 uM. Depois de uma linha de base estável foi alcançado, o agonista de glutamato L-aspartato foi aplicado por perfusão de banho (10 mM, 120 sec, banho de perfusão a 2,5 ml / min). Como observado anteriormente 21, a aplicação de aspartato causou uma diminuição lenta na [Na +] o por cerca de 15 mM, que durou cerca de 5 minutos e, em seguida, começou a se recuperar de volta à linha de base (Figura 8A). Nomeadamente, enquanto as amplitudes de pico e a cinética dos sinais de [Na +] o determinado por ambos os eléctrodos eram virtualmente idênticos sob estas condições, os eléctrodos concêntricos exibiu uma linha de base mais estável e um nível de ruído mais baixo (Figura 8A). Para testar o r<html> esposta características dos diferentes eléctrodos sob um paradigma aplicação mais rápida, que o glutamato-pressão aplicada por meio de uma pipeta de vidro fina posicionada no estrato radiante a uma distância de 20-40 uM a partir da ponta do microeléctrodo selectivo de iões. Como esperado 21, a aplicação de glutamato (10 mM) durante 200 ms causou uma queda no [Na +] o (Figura 8B). As amplitudes de pico de [Na +] O decréscimo estavam no mesmo intervalo para ambos os tipos de eléctrodos (cano duplo: 4,5 - 13,5 mM, n = 14; concêntrica: 2,0 - 19,1 mm, n = 15). No entanto, em contraste com os resultados obtidos com a perfusão de banho lento (ver acima), não só a relação de sinal-para-ruído, mas também do curso de tempo dos sinais de [Na +] o detectados pelos dois tipos de eléctrodos diferiram significativamente. O tempo médio de pico foi de 3,5 seg para a apenas 1,3 seg de cano duplo e para os micro-eléctrodos concêntricos. homólogos ve_content &quot;&gt; Assim, estes resultados demonstram e confirmam a cinética de resposta mais rápidos de Na + microeléctrodos selectivos duplos de cano concêntricos vs, (cf. Figura 6C e 8B), como também foi observado por Ca2 + e pH selectivos 10 . Em contraste com o estudo anterior, em que a estimulação sináptica curto-burst foi realizada para evocar transientes de iões rápido induzidas-sinapticamente, houve apenas uma tendência, mas não houve diferença significativa em amplitudes de pico médias entre eléctrodos concêntricos e dois canos com a nossa aplicação paradigma. Isto foi provavelmente devido ao facto de a distância da pipeta de aplicação a partir da ponta do microeléctrodo selectivo de iões variou por um factor de dois (20-40 uM), e, consequentemente, que a concentração máxima de glutamato na região alvo não foi a mesma em diferentes experiências, obstruindo qualquer diferença existente em amplitudes de pico. (A) Top traça: Mudança na voltaGE dos barris de referência (VREF) de um eléctrodo de cano duplo (traço pontilhado preto) e um eléctrodo concêntrico (cinzento traços) em resposta a alterações na concentração do banho de Na + ([Na +] b) como indicado. Note-se que as respostas de tensão de ambos os eléctrodos são virtualmente idênticas. Traços inferiores: Alterações na tensão da Na + -potential (V Na +) de um eléctrodo de cano duplo (traço preto) e um eléctrodo concêntrico (cinzento traços) em resposta a alterações na [Na +] b. (B) parcelas Half-logarítmicas de [Na +] b versus o V Na + de ambos os eletrodos. Parcelas lineares dos dados revelam uma inclinação de cerca de 48 mV para ambos os eléctrodos. (C) Resposta da V Na + de uma (traço preto) de cano duplo e um eletrodo concêntrico (cinza trace) para uma rápida mudança na [Na +] b de 152 mm para 70 mm. Note-se que o tempo de resposta do eléctrodo concêntrica é significativamente FASter. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53058/53058fig8.jpg" /> Figura 8: transientes de sódio extracelulares como detectado por eletrodos de cano duplo e concêntricos. (A) alterações transitórias da V ref e [Na +] o induzida por perfusão banho com 10 mM aspartato, durante 120 segundos, como indicado pelo bar. Os traços superiores mostram uma gravação executada com um eléctrodo de cano duplo, os traços inferiores foram registados utilizando um eléctrodo concêntrica. (B) as alterações transitórias em V ref e [Na +] O induzidas por aplicação local de pressão com glutamato 10 mM durante 0,2 segundos, tal como indicado pela seta. Os traços superiores mostram uma gravação executada com um eléctrodo de cano duplo, os traços inferiores foram registados utilizando um eléctrodo concêntrica.Linhas vermelhas pontilhadas representam ajustes lineares de o período entre o início do sinal para o seu máximo. Note-se que o tempo de resposta do eléctrodo concêntrica é significativamente mais rápido sob esta condição. Para fins de ilustração, os traços foram suavizadas com um filtro Sawitzky-Golay (largura 20). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53058/53058fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Demonstramos a fabricação, calibração e propriedades de dois tipos de microeletrodos seletivos de íons (de cano duplo e concêntricos) para medição de concentrações de íons no tecido cerebral. Estes são então usados na preparação da fatia do hipocampo de camundongos para mostrar que a atividade excitatória altera as concentrações extracelulares de potássio e sódio.

Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar e analisar a dinâmica iônica no espaço extracelular do tecido cerebral. A medição do transiente iônico é realizada utilizando microeletrodos seletivos a íons, que podem ser preparados com base em um design de duplo barril ou concêntrico. Como primeiro passo, os microeletrodos são calibrados no banho experimental.Em seguida, os eletrodos são inseridos em fatias hipocampais agudas de camundongo para gravação, a fim de provocar deslocamentos iônicos extracelulares; o neurotransmissor glutamato, ou um agonista do glutamato, é então fornecido. O glutamato se liga e abre receptores ionotrópicos nas espinhas pós-sinápticas, o que permite a entrada de sódio e a saída de potássio das células. Em última instância, isso resulta em uma diminuição do sódio extracelular bem como em um aumento do potássio extracelular, os quais são detectados pelos microeletrodos seletivos a íons.Este método é empregado para estudar a regulação iônica extracelular e os transientes de ferro induzidos por atividade no cérebro. Aqui descrevemos o preparo e a calibração de dois tipos de microeletrodos seletivos a íons. Mostramos como eles podem ser utilizados em fatias de tecido cerebral agudo para medir alterações no potássio ou sódio extracelular em resposta à aplicação de neurotransmissores.O procedimento será demonstrado por Nicole Hark e Simon para o meu laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare uma micropipeta de vidro borossilicatado com filamento a ser utilizada para o barril sensível a íons e outra para o barril de referência posterior. Em seguida, utilize cola de dois componentes ou uma pequena tira de folha de alumínio para fixar as micropipetas longa e curta juntas em ambas as extremidades.Aqueça a capilaridade dupla em um forno a 60 graus Celsius por uma hora para remover a umidade residual. Posteriormente, armazene os eletrodos em um dessecador até o uso. Centralize a capilaridade dupla em um puxador vertical com um giz de revólver. Use um giz para evitar o alongamento da capilaridade.Mantenha a bobina suavemente até que o vidro esteja macio o suficiente para permitir uma rotação horizontal do revólver. Gire 180 graus após o resfriamento e remova a quebra mecânica. Aplique um segundo protocolo de aquecimento para puxar a capilar, resultando em duas capilares duplas com pontas afiadas.O diâmetro da ponta da capilar dupla deve ser próximo a um mícron. Agora, encha o barril de referência até sua ponta com água destilada para evitar colonização. No procedimento a seguir, coloque uma capilar com dois barris com sua ponta voltada para cima em um suporte feito sob medida.Em seguida, coloque esse suporte no frasco de boca larga contendo o HMDS pré-aquecido e incube por 70 minutos. Depois disso, transfira a capilar para um suporte metálico. Posteriormente, coloque-a no forno pré-aquecido por duas horas para secar ambas as câmaras após a colonização; mantenha a capilar seca no dessecador até o uso.No dia do experimento, prepare o eletrodo seletivo a íons preenchendo a ponta do barril silanizado com dois a três microlitros do sensor seletivo a íons. Em seguida, preencha o barril no sentido retrógrado com cloreto de sódio 100 milimolar para um microeletrodo sensível ao sódio ou com solução salina de cloreto de potássio 100 milimolar para um microeletrodo sensível ao potássio. Tenha cuidado para não introduzir bolhas adicionais de ar durante este procedimento.Se a ionização for bem-sucedida e o sensor for preenchido corretamente, a superfície do sensor deve aparecer como uma superfície côncava claramente visível em contraste com o material de preenchimento posterior. Em seguida, preencha o canal de referência, insira os fios de prata cloridados em ambos os cilindros e feche cada cilindro com cera dental. Neste procedimento, puxe um capilar de dois milímetros no puxador horizontal para obter uma conicidade curta e um diâmetro de ponta de quatro mícrons.Imediatamente antes do uso, preencha a capilar de silicone com 0,2 microlitros do sensor. Para preparar a capilar interna, puxe uma capilar de diâmetro pequeno para obter duas capilares com cones longos e pontas afiadas. Em seguida, preencha-as com cloreto de sódio 100 milimolar ou salina de cloreto de potássio 100 milimolar.Coloque os capilares preenchidos com o sensor e com solução salina diretamente alinhados um com o outro sobre uma rolha personalizada feita de lamínulas. Insira parcialmente o capilar menor dentro do capilar maior. Em seguida, fixe os capilares em outra lamínula.Usando massa de modelar, transfira os capilares para a platina de um microscópio e visualize-os com ampliação de 100 x. Com a ajuda de uma haste de vidro montada em um micromanipulador, avance lentamente o capilar externo sobre o capilar interno até que a distância entre suas pontas seja aproximadamente cinco mícrons. Fixe a extremidade aberta do capilar externo ao capilar interno usando cera dental e insira o fio de prata.Para preparar o eletrodo de referência, puxe uma capilar com filamento em um puxador vertical, descarte a pipeta superior, então abra o mandril inferior e levante a pipeta inferior cerca de cinco milímetros. Feche o mandril novamente e levante-o até que a ponta do eletrodo inferior esteja posicionada cerca de cinco milímetros acima da bobina de aquecimento. Em seguida, aqueça a bobina e use pinça para dobrar a ponta em aproximadamente 45 graus para o lado.Dobre-o novamente cerca de menos 45 graus para direcionar a ponta de volta paralelamente ao eixo principal. Em seguida, encha o barril de referência com salina tamponada em excesso. Insira um fio de prata cloridado nele e feche o barril com cera odontológica.Neste passo, fixe ambos os eletrodos sensíveis a íons e de referência aos micromanipuladores e abaixe-os em uma câmara experimental perfundida com LCR A. Sob o microscópio estereoscópico, conecte os fios de prata clorurada às entradas respectivas do estágio inicial do amplificador diferencial. Em seguida, determine as resistências dos eletrodos.Em seguida, ajuste os sinais de tensão a zero e inicie a gravação para calibração. Após obter uma linha de base estável, mude para a solução salina contendo concentrações definidas do íon a ser medido. Agora, transfira uma fatia de hipocampo com 250 mícrons de espessura para a câmara experimental e fixe-a com uma grade.Posicione o microeletrodo seletivo a íons calibrado sobre a superfície da fatia. Em seguida, abaixe ainda mais o eletrodo cerca de 50 micrômetros para dentro da camada radiata da região CA1. Para aplicar o agonista do transmissor, encha a pipeta de aplicação com glutamato 0,5 milimolar.Acople a pipeta a um micromanipulador e conecte-a a um dispositivo de aplicação de pressão. Em seguida, abaixe a pipeta de aplicação no tecido e posicione-a cuidadosamente próximo à ponta do microeletrodo seletivo a íons. Inicie a aplicação de pressão em 40 milibares.É mostrada aqui a alteração na voltagem dos barris de referência de um eletrodo de duplo barril e de um eletrodo concêntrico em resposta a mudanças na concentração de sódio na solução banho. E estas são as alterações na voltagem do potencial de sódio de um eletrodo de duplo barril e de um eletrodo concêntrico em resposta a mudanças na concentração de sódio na solução banho. Esta figura mostra o gráfico semilogarítmico da concentração de sódio na solução banho versus a voltagem do potencial de sódio de ambos os eletrodos.Os gráficos lineares revelam uma inclinação de cerca de 48 milivolts para ambos os eletrodos. Abaixo está a resposta de um eletrodo duplo canulado e de um eletrodo concêntrico a uma mudança rápida na solução de banho. Concentração de sódio de 152 milimolar para 70 milimolar.Observe que o tempo de resposta do eletrodo concêntrico é significativamente mais rápido. Esta figura mostra a transiente de sódio extracelular conforme detectado por eletrodos duplos e concêntricos; alterações transitórias na voltagem dos barris de referência e na concentração extracelular de sódio foram induzidas por perfusão do banho com 10 milimolares de aspartato durante 120 segundos, conforme indicado pela barra. E nesta figura, alterações transitórias na voltagem dos barris de referência e na concentração extracelular de sódio foram induzidas por aplicação local de pressão com 10 milimolares de glutamato durante 0,2 segundos.Observe que o tempo de resposta do eletrodo conal é significativamente mais rápido sob esta condição. Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente que o silêncio adequado é a etapa fundamental para a produção bem-sucedida de microeletrodos eletivos de ferro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e usar esses eletrodos para a detecção de ferro extracelular, transitório, no tecido cerebral.

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