Microeletrodos de cano duplo e concêntricos para a medição de Extracelular Ion Signals no tecido cerebral

O objetivo geral deste procedimento é detectar e analisar a dinâmica iônica no espaço extracelular do tecido cerebral. A medição do transiente iônico é realizada utilizando microeletrodos seletivos a íons, que podem ser preparados com base em um design de duplo barril ou concêntrico. Como primeiro passo, os microeletrodos são calibrados no banho experimental.

Em seguida, os eletrodos são inseridos em fatias hipocampais agudas de camundongo para gravação, a fim de provocar deslocamentos iônicos extracelulares; o neurotransmissor glutamato, ou um agonista do glutamato, é então fornecido. O glutamato se liga e abre receptores ionotrópicos nas espinhas pós-sinápticas, o que permite a entrada de sódio e a saída de potássio das células. Em última instância, isso resulta em uma diminuição do sódio extracelular bem como em um aumento do potássio extracelular, os quais são detectados pelos microeletrodos seletivos a íons.

Este método é empregado para estudar a regulação iônica extracelular e os transientes de ferro induzidos por atividade no cérebro. Aqui descrevemos o preparo e a calibração de dois tipos de microeletrodos seletivos a íons. Mostramos como eles podem ser utilizados em fatias de tecido cerebral agudo para medir alterações no potássio ou sódio extracelular em resposta à aplicação de neurotransmissores.

O procedimento será demonstrado por Nicole Hark e Simon para o meu laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare uma micropipeta de vidro borossilicatado com filamento a ser utilizada para o barril sensível a íons e outra para o barril de referência posterior. Em seguida, utilize cola de dois componentes ou uma pequena tira de folha de alumínio para fixar as micropipetas longa e curta juntas em ambas as extremidades.

Aqueça a capilaridade dupla em um forno a 60 graus Celsius por uma hora para remover a umidade residual. Posteriormente, armazene os eletrodos em um dessecador até o uso. Centralize a capilaridade dupla em um puxador vertical com um giz de revólver. Use um giz para evitar o alongamento da capilaridade.

Mantenha a bobina suavemente até que o vidro esteja macio o suficiente para permitir uma rotação horizontal do revólver. Gire 180 graus após o resfriamento e remova a quebra mecânica. Aplique um segundo protocolo de aquecimento para puxar a capilar, resultando em duas capilares duplas com pontas afiadas.

O diâmetro da ponta da capilar dupla deve ser próximo a um mícron. Agora, encha o barril de referência até sua ponta com água destilada para evitar colonização. No procedimento a seguir, coloque uma capilar com dois barris com sua ponta voltada para cima em um suporte feito sob medida.

Em seguida, coloque esse suporte no frasco de boca larga contendo o HMDS pré-aquecido e incube por 70 minutos. Depois disso, transfira a capilar para um suporte metálico. Posteriormente, coloque-a no forno pré-aquecido por duas horas para secar ambas as câmaras após a colonização; mantenha a capilar seca no dessecador até o uso.

No dia do experimento, prepare o eletrodo seletivo a íons preenchendo a ponta do barril silanizado com dois a três microlitros do sensor seletivo a íons. Em seguida, preencha o barril no sentido retrógrado com cloreto de sódio 100 milimolar para um microeletrodo sensível ao sódio ou com solução salina de cloreto de potássio 100 milimolar para um microeletrodo sensível ao potássio. Tenha cuidado para não introduzir bolhas adicionais de ar durante este procedimento.

Se a ionização for bem-sucedida e o sensor for preenchido corretamente, a superfície do sensor deve aparecer como uma superfície côncava claramente visível em contraste com o material de preenchimento posterior. Em seguida, preencha o canal de referência, insira os fios de prata cloridados em ambos os cilindros e feche cada cilindro com cera dental. Neste procedimento, puxe um capilar de dois milímetros no puxador horizontal para obter uma conicidade curta e um diâmetro de ponta de quatro mícrons.

Imediatamente antes do uso, preencha a capilar de silicone com 0,2 microlitros do sensor. Para preparar a capilar interna, puxe uma capilar de diâmetro pequeno para obter duas capilares com cones longos e pontas afiadas. Em seguida, preencha-as com cloreto de sódio 100 milimolar ou salina de cloreto de potássio 100 milimolar.

Coloque os capilares preenchidos com o sensor e com solução salina diretamente alinhados um com o outro sobre uma rolha personalizada feita de lamínulas. Insira parcialmente o capilar menor dentro do capilar maior. Em seguida, fixe os capilares em outra lamínula.

Usando massa de modelar, transfira os capilares para a platina de um microscópio e visualize-os com ampliação de 100 x. Com a ajuda de uma haste de vidro montada em um micromanipulador, avance lentamente o capilar externo sobre o capilar interno até que a distância entre suas pontas seja aproximadamente cinco mícrons. Fixe a extremidade aberta do capilar externo ao capilar interno usando cera dental e insira o fio de prata.

Para preparar o eletrodo de referência, puxe uma capilar com filamento em um puxador vertical, descarte a pipeta superior, então abra o mandril inferior e levante a pipeta inferior cerca de cinco milímetros. Feche o mandril novamente e levante-o até que a ponta do eletrodo inferior esteja posicionada cerca de cinco milímetros acima da bobina de aquecimento. Em seguida, aqueça a bobina e use pinça para dobrar a ponta em aproximadamente 45 graus para o lado.

Dobre-o novamente cerca de menos 45 graus para direcionar a ponta de volta paralelamente ao eixo principal. Em seguida, encha o barril de referência com salina tamponada em excesso. Insira um fio de prata cloridado nele e feche o barril com cera odontológica.

Neste passo, fixe ambos os eletrodos sensíveis a íons e de referência aos micromanipuladores e abaixe-os em uma câmara experimental perfundida com LCR A. Sob o microscópio estereoscópico, conecte os fios de prata clorurada às entradas respectivas do estágio inicial do amplificador diferencial. Em seguida, determine as resistências dos eletrodos.

Em seguida, ajuste os sinais de tensão a zero e inicie a gravação para calibração. Após obter uma linha de base estável, mude para a solução salina contendo concentrações definidas do íon a ser medido. Agora, transfira uma fatia de hipocampo com 250 mícrons de espessura para a câmara experimental e fixe-a com uma grade.

Posicione o microeletrodo seletivo a íons calibrado sobre a superfície da fatia. Em seguida, abaixe ainda mais o eletrodo cerca de 50 micrômetros para dentro da camada radiata da região CA1. Para aplicar o agonista do transmissor, encha a pipeta de aplicação com glutamato 0,5 milimolar.

Acople a pipeta a um micromanipulador e conecte-a a um dispositivo de aplicação de pressão. Em seguida, abaixe a pipeta de aplicação no tecido e posicione-a cuidadosamente próximo à ponta do microeletrodo seletivo a íons. Inicie a aplicação de pressão em 40 milibares.

É mostrada aqui a alteração na voltagem dos barris de referência de um eletrodo de duplo barril e de um eletrodo concêntrico em resposta a mudanças na concentração de sódio na solução banho. E estas são as alterações na voltagem do potencial de sódio de um eletrodo de duplo barril e de um eletrodo concêntrico em resposta a mudanças na concentração de sódio na solução banho. Esta figura mostra o gráfico semilogarítmico da concentração de sódio na solução banho versus a voltagem do potencial de sódio de ambos os eletrodos.

Os gráficos lineares revelam uma inclinação de cerca de 48 milivolts para ambos os eletrodos. Abaixo está a resposta de um eletrodo duplo canulado e de um eletrodo concêntrico a uma mudança rápida na solução de banho. Concentração de sódio de 152 milimolar para 70 milimolar.

Observe que o tempo de resposta do eletrodo concêntrico é significativamente mais rápido. Esta figura mostra a transiente de sódio extracelular conforme detectado por eletrodos duplos e concêntricos; alterações transitórias na voltagem dos barris de referência e na concentração extracelular de sódio foram induzidas por perfusão do banho com 10 milimolares de aspartato durante 120 segundos, conforme indicado pela barra. E nesta figura, alterações transitórias na voltagem dos barris de referência e na concentração extracelular de sódio foram induzidas por aplicação local de pressão com 10 milimolares de glutamato durante 0,2 segundos.

Observe que o tempo de resposta do eletrodo conal é significativamente mais rápido sob esta condição. Ao realizar este procedimento, é importante ter em mente que o silêncio adequado é a etapa fundamental para a produção bem-sucedida de microeletrodos eletivos de ferro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e usar esses eletrodos para a detecção de ferro extracelular, transitório, no tecido cerebral.