Geração e Análise Quantitativa de Baixa Freqüência ultra-som pulsado determinar Sonic sensibilidade dos tratados e não tratados células neoplásicas

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a eficácia e a reprodutibilidade do ultrassom pulsado de baixa frequência no dano às populações de células de leucemia humana na ausência ou na presença de um agente desprovido de colesterol. Isso é alcançado pela limpeza do sistema de sonicação e pela avaliação de sua estabilidade. As células de leucemia humana são então submetidas à sonicação na ausência e na presença de metil beta ciclodextrina.

Em seguida, contadores automatizados de células são utilizados para avaliar a viabilidade celular e os efeitos da sonicação e da depleção de colesterol. A atividade mitocondrial de células de leucemia é avaliada pelo ensaio XTT. Por fim, os dados sugerem que o ultrassom de baixa frequência pode ser usado para danificar células malignas, o que é potencializado pelo uso de um agente desprovido de colesterol.

Nosso laboratório tem interesse na terapia por sonar namp, uma nova modalidade terapêutica que combina os efeitos anti-neoplásicos do ultrassom com agentes especializados para amplificar os efeitos do som. Nosso protocolo avalia a sensibilidade sonora de células neoplásicas e normais para determinar possíveis abordagens quimioterápicas que justifiquem investigação pré-clínica adicional. Geralmente, indivíduos novos nesse método podem ter dificuldades com os equipamentos utilizados para avaliar a estabilidade do sistema de som, pois pode levar algum tempo para aprender a utilizar esses dispositivos de forma ideal.

A demonstração visual deste método é essencial, pois os procedimentos de limpeza e estabilização utilizados para avaliar o sistema de sonicação são fundamentais para obter resultados reprodutíveis. Antes de iniciar um experimento, utilize clorofórmio e um cotonete para limpar a junção entre o chifre e o conversor. Em seguida, aplique um pouco de óleo nas roscas do chifre e do conversor.

Para remover completamente quaisquer rebarbas metálicas, ferrugem ou acúmulo de oxidação, em seguida remova o óleo e quaisquer outros contaminantes da junção com mais clorofórmio e reconecte o chifre ao conversor. Para apertar corretamente o sistema, puxe o chifre para fora da parte inferior do copo e coloque uma chave de fenda dentro de um dos três pequenos orifícios próximos ao topo do conversor. Agora, posicione uma chave de torque equipada com uma chave de boca de meia polegada na parte ranhurada do chifre e aperte no sentido horário padrão até que o medidor de torque indique 39,99 libras-pé.

Após apertar, recoloque o conversor e o chifre de volta no copo e monte as peças em um suporte com argola na posição vertical, reconecte o conversor à fonte de alimentação e, em seguida, configure o sistema para dosagem pulsada. Usando um segundo de sonicação com um segundo de intervalo entre os pulsos, ajuste o sistema às amplitudes desejadas para avaliar a intensidade e o funcionamento do sistema Sauna Fire. Comece segurando o medidor de cavitação a 1,5 centímetro, tomando cuidado para que não haja bolhas na superfície da sonda do medidor.

Leia a tela do medidor de cavitação para confirmar que o sistema está funcionando na intensidade apropriada. Em seguida, imerga completamente o sensor do hidrofone em um vial de amostra contendo 12,5 mililitros de água e use o suporte com anéis para suspender o hidrofone. Para confirmar a estabilidade das características da forma de onda, conecte o hidrofone à entrada do osciloscópio e verifique a presença de uma onda senoidal clara, pois ondas anômalas podem alterar a Frequência do sistema.

Para preparar as células para a sonicação, primeiramente semeie-as a quatro vezes 10 à quarta células por mililitro em um frasco de 25 centímetros quadrados utilizando meio recém-preparado. Após determinar o número de células viáveis pelo teste de exclusão com azul de triam, incube a cultura a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que a cultura atinja a concentração desejada. Quando as células estiverem prontas para a sonicação, utilize um sistema a vácuo e um frasco de Buchner para desgaseificar um volume de água destilada desionizada.

Em seguida, use a água para encher o chifre do copo até 15 milímetros acima do topo do chifre. Execute o sistema com a água Desgaseificada por cerca de sete minutos. Em seguida, transfira três mililitros de células para um frasco de cintilação de vidro de 20 mililitros e fixe o frasco ao dispositivo de fixação.

Em seguida, fixe o dispositivo de fixação na parte superior do chifre de copo e use o mecanismo deslizante para ajustar o dispositivo de fixação a uma elevação de 15 milímetros a partir do topo do chifre na superfície da água. Agora, sonique as células utilizando três pulsos de ultrassom de um segundo cada, com intervalo de um segundo entre os pulsos, com amplitude de 33 e 50%. Avalie a viabilidade celular após a sonicação pelo teste de exclusão com azul de triam. Para avaliar o dano celular, enxágue a abertura de um analisador de partículas Z dois pelo menos duas vezes com solução salina isotônica.

Em seguida, adicione 100 microlitros das células sonicadas em 20 mililitros de solução salina isotônica e transfira a amostra celular para o suporte do contador. Então, eleve a plataforma até a abertura e analise os danos celulares, viabilidade e detritos de acordo com as instruções do fabricante. Para avaliar a viabilidade das células sonicadas pelo ensaio XTT, sonique as células utilizando uma faixa de um a três.

Pulsos de um segundo espaçados por um segundo para induzir uma variedade de danos a serem avaliados pelo kit XTT; em seguida, centrifugue as células e reconstitua os pellets em uma concentração de um vezes 10 à quinta células por mililitro em meio de crescimento recém-preparado. Em seguida, semeie 100 microlitros de células por poço em placas de microtitulação individuais de fundo plano, com 96 poços, em triplicata, incluindo três poços controle contendo apenas 100 microlitros de meio de crescimento completo para leituras de absorvância em branco.

Incube as células por 24 horas pela manhã no dia do ensaio, agitando suavemente alíquotas de 37 graus Celsius, reagentes XTT e de ativação aquecidos até que as soluções fiquem límpidas. Em seguida, adicione 0,1 mililitros do reagente de ativação a cinco mililitros de reagente XTT. Depois, adicione 50 microlitros da solução XTT ativada a cada poço das placas inoculadas com U 9 37 e THP um e retorne as células ao incubador de cultura celular.

Após duas horas, agite suavemente as placas para distribuir uniformemente o corante laranja nos poços positivos e meça a absorbância em um leitor de placas microtituladoras entre 450 e 500 nanômetros. Por fim, meça novamente a absorbância de todos os poços do ensaio, entre 630 e 690 nanômetros. Como esperado, um dano celular mais extenso é observado na população celular submetida à sonicação na amplitude de 50% do que na de 33%.

A amplitude de 33%, no entanto, permite a detecção de danos adicionais quando agentes são aplicados. Como neste experimento, em que os efeitos dependentes da dose do agente desprovido de colesterol, metil beta ciclodextrina, na potencialização da sensibilidade ultrassônica de células U 937 foram avaliados.

Embora as células tratadas com beta ciclodextrina metilada não tivessem viabilidade semelhante às células não tratadas, a viabilidade diminuiu acentuadamente após três pulsos de um segundo de ultrassom a 40 quilohertz. Além disso, a redução na viabilidade após a sonicação parece ter sido dependente da dose, já que cinco milimolares do agente desprovido de colesterol provocaram a maior queda na contagem celular, seguidos pelos tratamentos com um milimolar e 0,5 milimolar de beta ciclodextrina metilada, conforme avaliado pelo ensaio XTT. Embora as células THP-1 parecessem ser ligeiramente mais resistentes ao ultrassom do que as células U-937, ambas as linhagens celulares de leucemia humana foram danificadas de maneira dependente da dose.

Além disso, a combinação de concentrações mais elevadas de beta metilciclodextrina com um maior número de pulsos de ultrassom produziu a menor redução de XTT a um derivado solúvel fortemente colorido em laranja, tanto para as células U 9 37 quanto para as células THP 1, o que corresponde a uma viabilidade celular e atividade mitocondrial reduzidas para ambas as linhagens celulares. Após este procedimento, outros agentes sensibilizantes ao som, como agentes direcionados ao citoesqueleto ou produtores de espécies com ação reativa, podem ser avaliados quanto à sua potencialização da sensibilidade sônica, estabelecendo assim novas abordagens terapêuticas que podem ser investigadas quanto à sua eficácia pleoclínica. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de organizar adequadamente os dados de SON obtidos a partir dos contadores TC e Z 2, pois eles fornecem informações detalhadas sobre a eficácia do protocolo de tratamento que podem ser perdidas.

Se nenhum esquema logístico for usado, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar ultrassom de baixa frequência em combinação com potenciais sensibilizadores ano em modelos pré-clínicos in vitro para avaliar seu potencial terapêutico.