Name: Cabeça de base acrílica Resina de moldagem técnica de fixação em roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Aprenda uma técnica de fixação de cabeça sem metal usando resina acrílica dental em roedores. Este método acessível facilita estudos de comportamento e acesso ao cérebro em laboratórios sem capacidade de usinagem CNC.

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Esta pesquisa foi financiada pelo Programa de Pesquisa em Ciências Básicas por meio da NRF financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2010-0022362) e (2012R1A2A2A02046812).

Declaração de Ética: Este experimento foi aprovado pelo Comitê Animal Care Institucional e Use o Kyungpook National University, e foi realizada de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Instituto Nacional de Saúde, 1996). Depois de experimento, os animais foram sacrificados sob dióxido de carbono eutanásia. 1. Projeto do Bar Cabeça-fixação para ratos NOTA: Este passo é uma diretriz geral para um design de barra de fixação. Qualquer modificação sobre a dimensão e material é possível, dependendo animais ou implantes. Projetando um bar cabeça-fixação usando o software CAD é recomendado mas não necessário. <ol><li> Use um software de CAD para projetar uma barra de fixação. <ol><li> Projetar um bar fixação de uma forma retangular (123 × 35 × 6 mm) (Figura 1A). Faça um entalhe rectangular (16 × 20 mm; porta) no meio da barra de fixação. Adicionar encostas ou recuos which servir como um trilho de guia sobre as fronteiras da porta (Figura 1A-A, Figura 1B -arrows). NOTA: Certifique-se de que a área do porto cobre o retângulo prevista de crânio do rato sobre o cérebro para permitir acessos verticais utilizando um manipulador estereotáxica para a maioria das áreas do cérebro por meio de uma craniotomia. </li><li> Montar as placas (50 x 20 x 6 mm) com dois furos de fixação alongadas em ambos os lados da barra de fixação. Certifique-se de que esses buracos passar parafusos de 6 mm de diâmetro (Figura 1A-d). Fazer um buraco de 3 mm de diâmetro na frente da porta de um gancho de bloqueio (Figura 1A-b). </li><li> Faça uma caixa com um andar (135 × 305 mm) e paredes laterais (305 × 76 mm). Perfurar dois buracos de 6 mm de diâmetro, como mostrado na Figura 1A (inset). Adicionar paredes de suporte sobre a barra de fixação (Figura 1A-E). </li></ol></li><li> Fabricação a barra concebida e caixa e montar cada um deles usando como cianoacrilatomostrado na Figura 1A (inset). Monte a barra na caixa com parafusos de 6 mm de diâmetro. Aplicar inclinação, ajustando a posição do parafuso da barra de fixação de cabeça ergonômica (Figura 1A-inserção). NOTA: Para os ratos, a dimensão da barra de fixação é de 60 × 20 × 4 mm (que consiste em duas camadas de 2 mm de espessura) painéis de acrílico. A porta é quadrada de 8 mm de largura (superior) e 9 x 10 mm (inferior) tal como mostrado na Figura 1C. Placas de ancoragem são do mesmo tamanho de ratos &quot;. As paredes placa caixa e laterais são 100 × 72 milímetros e 100 × 50 mm, respectivamente. </li></ol> 2. Cabeça Mounter Construção durante cirurgia de implantação CUIDADO: Seja cauteloso ao lidar com resina acrílica dental. O líquido pode causar irritação na pele. Colocar uma máscara e usar luvas. Trabalhar em uma área bem ventilada. <ol><li> Preparação antes da cirurgia <ol><li> Enrole firmemente a fronteira do porto da barra de fixação com aparaffin película para impedir a adesão de resina acrílica aplicada à barra (ver Figura 1B e Figura 2A). Revestir a fronteira da porta coberta pela película de parafina com uma fina camada de resina acrílica. </li><li> Use instrumentos cirúrgicos esterilizados. Completamente desinfectar quadro estereotáxico e seu entorno partir de álcool etílico a 70%. </li></ol></li><li> Realizar a cirurgia de implantação estereotáxica <ol><li> Anestesiar um animal por injecção intraperitoneal de uma mistura de cocktail (2 ml / kg) de cetamina 10 ml (50 mg / ml), cloridrato de xilazina 1,5 ml (23,32 mg / ml), e 2,5 ml de solução salina. Confirme se o animal totalmente anestesiados e não responde a cauda e pitadas de dedo do pé. Injectar mistura cocktail de 1 ml / kg durante a cirurgia, quando necessário. </li><li> Corrigir o animal para o aparelho estereotáxico. Aplicar pomada oftálmica nos olhos para evitar a secura durante a cirurgia. Raspar e limpar o couro cabeludo com etanol 70%. Dê a injecção subcutânea de lidocaína a 2% e incisão no scalp ao longo da linha média do crânio. Completamente raspar periósteo. Enxaguar várias vezes com solução salina. </li><li> Faça perfuração burr-hole perto da borda do crânio. Parafusos de implante 4-5 voltas (até 1 mm) de profundidade da superfície do crânio para evitar uma violação da dura-máter. Certifique-se de nenhum vazamento de líquor e sangue na superfície do crânio após a implantação parafuso. Enxágüe com solução salina e secar a superfície do crânio usando ar-puff, especialmente em torno dos parafusos. </li><li> Revestimento de superfície do crânio com uma fina camada de &quot;cola dentária (Super-Bond C &amp; B)&quot;. Não cobrir inteiramente a superfície do crânio, incluindo o bregma se implante de eletrodos adicional está programado. Use a bregma para a marcação de coordenadas craniotomia. Eletrodos e / ou microdrive implantes e corrigi-lo no crânio através da aplicação de resina acrílica em torno dele. </li><li> Aplicar resina acrílica adicional no topo do cimento dental. Use quantidade adequada de resina acrílica de deixar espaço fill-out suficiente entre revestido por uma barra de resinaresina montagem inicial d quando fixando os parafusos e / ou eléctrodos (Figura 2A). </li></ol></li><li> Coloque bar cabeça-fixação 5 mm ou mais acima da superfície do crânio e alinhe seu centro (Figura 2A -Left). </li><li> Aplicar resina acrílica na folga entre a base do crânio e resinas iniciais de montagem. (Figura 2A -Center). Aguarde até que a resina se tornar difícil. </li><li> Remover ear-bar e puxe o montador moldado para fora da porta de bar fixação. (Figura 2A -Direita). Cuidadosamente aplicar resina acrílica adicional em torno dos trilhos da borda do montador moldado, se necessário. </li><li> Enxaguar a superfície da ferida do couro cabeludo com solução salina estéril. Injectar um antibiótico (enrofloxacina, 5 mg / kg sc) e um (tartarato de butorfanol, 2 mg / kg sc) analgésico imediatamente após a cirurgia. Abrigar o animal individualmente em uma única gaiola. </li></ol> 3. Animais habituar-a-Frente-a fixação Nota: Esta etapa deescribas horários de habituação com base em avaliações empiricamente bem-sucedidas dos autores. Para uma visão geral do processo de habituação para a cabeça-fixação, ver o trabalho de 11 de 10 Schwartz ou Guo. <ol><li> Dê período de recuperação suficiente (uma semana ou mais) para os animais. No dia 1, o manuseio de animais com freqüência em curtas sessões divididas. </li><li> No dia seguinte (Dia 2), exponha o animal ao ambiente de fixação (caixa). Não insira o seu montador cabeça na porta do bar fixação. Deixe os animais para se acostumar com o ambiente. Firmemente agarrar o montador cabeça usando a mão para 1 a 2 segundos e solte-o imediatamente. Repita fixação curto prazo com a mão-de agarrar várias vezes. </li><li> No Dia 3, os animais se habituam a cabeça-fixação. <ol><li> Trazer animais das gaiolas e liquidá-los na caixa de direção se dirige para o porto da barra de fixação. Pegue o montador cabeça e insira-o na porta do bar fixação. </li><li> Vincular o montador (animal decabeça) para o gancho de travamento da barra de fixação com uma faixa de borracha. Suporte para 5 min. NOTA: Não toque no tronco ou na cauda do animal após a fixação, o que leva o animal a ranger e luta aumentando o estresse do animal. Quando o animal continua lutando mais de 1 min, liberá-lo e tente mais tarde. A partir desta etapa, os animais mostram excreção de urina e fezes sempre que expostos a cabeça de fixação, mas isso gradualmente fica reduzida como habituação rendimentos. </li><li> Recuperar o elástico de bloqueio e ejetar o dispositivo de montagem para fora da porta. Coloque os animais de volta para a jaula de casa e prestar um pedaço de cereal ou uma semente de girassol na gaiola como uma recompensa. O próximo julgamento começa em 30 min. Repita 3.4.1 a 3.4.4 cinco ou mais dentro de um dia. </li></ol></li><li> No dia 4 a 7, expor o animal a cabeça de fixação tal como descrito no protocolo 3.4. Aumentar gradualmente a duração de fixação de cabeça (10 min, 20 min, 30 min e 50 min a habituação rendimentos). NOTA: Se os animais não fazemt alimentar a recompensa do alimento, ele pode ser um sinal de um nível elevado de stress. Não aumente o tempo de fixação. Se os animais mostram repetido lutando comportamento, habituá-los por um período mais longo. </li><li> Verifique o peso corporal do animal por dia. Considere habituação sem êxito quando o peso corporal está diminuindo. Continuar em tarefas comportamentais com fixação de cabeça depois de habituação bem sucedido. NOTA: Sucesso habituação facilita o treinamento comportamental subsequente (Figura 3E e F). </li></ol>

<ol><li>Mayrhofer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+two-alternative+forced+choice+paradigm+for+bilateral+vibrotactile+whisker+frequency+discrimination+in+head-fixed+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Novel two-alternative forced choice paradigm for bilateral vibrotactile whisker frequency discrimination in head-fixed mice and rats.</a> J Neurophysiol. 109, 273-284 (2013).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> J Neurosci Methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>Ollerenshaw, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+tactile+inputs+in+the+rat+vibrissa+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Detection of tactile inputs in the rat vibrissa pathway.</a> J Neurophysiol. 108, 479-490 (2012).</li>
<li>Lee, M. G., Manns, I. D., Alonso, A., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep-wake+related+discharge+properties+of+basal+forebrain+neurons+recorded+with+micropipettes+in+head-fixed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Sleep-wake related discharge properties of basal forebrain neurons recorded with micropipettes in head-fixed rats.</a> J Neurophysiol. 92, 1182-1198 (2004).</li>
<li>Lutcke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+neuronal+activity+with+a+genetically-encoded+calcium+indicator+in+anesthetized+and+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Optical recording of neuronal activity with a genetically-encoded calcium indicator in anesthetized and freely moving mice.</a> Front Neural Circuits. 4, 9(2010).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Kimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Hadlock, T., Kowaleski, J., Mackinnon, S., Heaton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+head+fixation+for+the+study+of+rodent+facial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">A novel method of head fixation for the study of rodent facial function.</a> Experimental neurology. 205, 279-282 (2007).</li>
<li>Roh, M., Jang, I. S., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Push-in+Head+Restraining+Apparatus+for+Intracranial+Self+Stimulation+Tasks+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Push-in Head Restraining Apparatus for Intracranial Self Stimulation Tasks in Rats.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 18, 103-108 (2014).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensory+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensory & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
<li>Guo, Z. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+Behavioral+Experiments+in+Head-Fixed+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Procedures for Behavioral Experiments in Head-Fixed Mice.</a> PLoS ONE. 9, (2014).</li>
<li>Osborne, J. E., Dudman, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIVETS%3A+a+mechanical+system+for+in+vivo+and+in+vitro+electrophysiology+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RIVETS: a mechanical system for in vivo and in vitro electrophysiology and imaging.</a> PLoS One. 9, e89007(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo demonstra um método simples e conveniente de fixação da cabeça usando materiais disponíveis. Para uma fixação fisicamente bem-sucedida da cabeça, os primeiros passos críticos durante a cirurgia são enxaguar e secar a superfície do crânio claramente antes de aplicar o cimento de resina adesiva dental. Em segundo lugar, este método não utiliza implantes de parafusos sob os músculos temporais e depende apenas dos parafusos no crânio, sua implantação perpendicular contra a superfície da borda do crânio é cruci...

Cabeça de fixação ou de contenção da cabeça é uma técnica de imobilização da cabeça do animal, anexando uma armação ou placa sobre o crânio de fixação rígida. A técnica foi adotada para estimulação sensorial preciso, detecção comportamental com ou sem gravação neural em animais acordados 1-3 e para a rotulagem juxtacellular durante o ciclo sono-vigília 4. É também utilizado para imagiologia in vivo cérebro 5,6. Agora técnica de fixação da cabeça é uma ferramenta comumente usada em neurociência e pesquisa comportamental. Basicamente, fixação de cabeça tradicional exige fixação cirúrgica de Metal Head-posts no topo do crânio 6-8. As peças de fixação são, em seguida, fixar-se uma plataforma fixa, o que resulta na imobilização da cabeça. Investigação neurofisiológica em animais acordados como neural e / ou gravação óptica, a intervenção circuitos cerebrais, imagens do cérebro é acompanhada por cirurgia de implantação usando acrílicos odontológicos. Portanto,parece uma tarefa simples para implementar a fixação de cabeça naqueles laboratórios quando é necessário experimentalmente. Os quadros devem ser projetado para ser leve e pequeno o suficiente para não perturbar o comportamento natural do animal nas suas gaiolas. Ele também fornece rigidez mecânica quando amarrado à plataforma estacionária. Tem ainda mais a biocompatibilidade dependendo fins experimentais. Portanto, é tecnicamente difícil de projetar e fabricar tais cabeça-lugares em equipamentos de laboratório geral. Neste estudo, um método de fixação de cabeça novela é descrita, proporcionando rigidez mecânica por meio de aperto conveniente, sem recurso a grampos metálicos cabeça-mensagens. Ao utilizar o método, de fixação de cabeça pode ser feita sob condições laboratoriais gerais, em que a cirurgia de implantação é geralmente realizada em roedores para estudo do cérebro. O metal cabeça-as mensagens são substituídos com cimento acrílico moldado parcialmente resina por uma barra de fixação de cabeça feito por encomenda e o processo de moldagem é feito durante IMPLANcirurgia tação. A barra de fixação possui alta compatibilidade espacial com outros implantes, como sondas de gravação neurais, eletrodos de estimulação. Também simplifica passos de fixação da cabeça do animal na plataforma de fixação por parafuso removendo-fixação. Nós usamos esse método no estudo comportamental anterior e concluímos que este método é fácil de implementar e conveniente em experimentação prática 9.

<table><tbody><tr><td>Resina acrílica dental</td><td>Lang Dental Manufacturing</td><td>Ortho-Jet</td><td>para fazer mounter moldado</td></tr><tr><td>Filme de parafina</td><td>Bemis</td><td>Parafilm</td><td>para evitar a adesão de resina acrílica à barra</td></tr><tr><td>Adesivo dental</td><td>Sun Medical</td><td>Super-Bond C& B</td><td>para ligar entre a resina acrílica e o crânio</td></tr><tr><td>Plexglass ou outra placa</td><td></td><td></td> acrílica <td>para fazer a barra de fixação e a plataforma da caixa</td></tr><tr><td>Cianoacrilato</td><td></td><td></td><td>para ligar placas de acrílico</td></tr></tbody></table>

cabeça de base acrílica resina de moldagem técnica de fixação em roedores

Acrylic Resin Molding Based Head Fixation Technique in Rodents

A fixação da cabeça é uma técnica de imobilização da cabeça do animal anexando um poste de cabeça no crânio para fixação rígida. A fixação tradicional da cabeça requer a fixação cirúrgica de armações metálicas no crânio. As estruturas anexadas são então presas a uma plataforma estacionária, resultando na imobilização da cabeça. No entanto, as armações metálicas para fixação da cabeça têm sido tecnicamente difíceis de projetar e implementar em ambiente de laboratório em geral. Neste estudo, fornecemos um novo método de fixação da cabeça. Usando uma barra de fixação de cabeça feita sob medida, o montador de cabeça é construído durante a cirurgia de implantação. Após a aplicação de resina acrílica para fixação de implantes, como eletrodos e cânula no crânio, resinas adicionais foram aplicadas em cima disso para construir um molde compatível com a porta da barra de fixação. O montador de cabeça moldado serve como trilhos de guia, os investigadores fixam convenientemente a cabeça do animal inserindo o montador de cabeça na porta da barra de fixação. Este método pode ser facilmente aplicável se a cirurgia de implantação usando acrílicos dentários for necessária e pode ser útil para laboratórios que não podem fabricar facilmente postes de metal usinados em CNC.

Este método de fixação de cabeça é aplicável aos ratos e camundongos. Total de oito ratos receberam implante bilateral de eletrodos de estimulação no feixe do cérebro anterior medial. Para quatro deles, personalizados eletrodos de fio de tungstênio (Microdrives) foram adicionalmente implantado em área forelimb o M1 (Figura 2C). Para ratinhos (n = 2), quatro eléctrodos de arame de aço inoxidável foram implantadas em áreas corticais frontais / occipitais. Durante a cirurgia, montadores de cabeça foi molda...

As técnicas tradicionais de fixação da cabeça usaram armações metálicas presas ao crânio como interface para aparelhos de fixação da cabeça. Este protocolo demonstra uma técnica de fixação de cabeça baseada em moldagem de resina acrílica sem moldura para tarefas comportamentais em roedores.

Cabeça de base acrílica Resina de moldagem técnica de fixação em roedores

Head fixation is a technique of immobilizing animal's head by attaching a head-post on the skull for rigid clamping. Traditional head fixation requires ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer uma nova técnica de fixação da cabeça utilizando acrílico dental, amplamente disponível em laboratórios que realizam cirurgias de implante em roedores. Este método pode responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do cérebro e do comportamento. As principais vantagens desta técnica são o não uso de hastes ou placas metálicas para a cabeça, permitindo seu uso em laboratórios que não possuem facilidade para fabricar hastes metálicas usinadas por CNC.Utilizando um software CAD, projete uma barra de fixação retangular com 123 por 35 por 6 milímetros, com uma abertura retangular centralizada que mede 16 por 20 milímetros. Essa abertura é usada para acessar o cérebro, portanto seu tamanho deve ser modificado conforme necessário. Adicione inclinações ou reentrâncias para servir como trilhos-guia ao longo das bordas da abertura. Em ambos os lados da barra de fixação, prepare placas para fixação por meio de furos de ancoragem alongados.Os orifícios devem acomodar um parafuso de 6 milímetros; adicione também, na frente da porta, um orifício de três milímetros de diâmetro para encaixar um gancho de travamento. Em seguida, projete as pared

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós apresentar um método para formar uma janela de imagem no crânio do rato que se estende por milímetro e é estável durante meses sem inflamação do cérebro. Este método é bem adequado para estudos longitudinais de fluxo de sangue, a dinâmica celular, e as células / estrutura vascular utilizando dois fotões microscopia.

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