Microeletrodos guiada implantação de eletrodos no subtalâmica Núcleo de Ratos por longo prazo Estimulação Profunda do Cérebro
2 de outubro de 2015
Um método para implantar eletrodos no núcleo subtalâmico (STN) de ratos é descrito. A melhor localização do STN foi obtida usando um sistema de microregistro. Além disso, é apresentada uma configuração de estimulação caracterizada por conexões duradouras entre a cabeça do animal e o estimulador.
O objetivo geral deste procedimento é realizar um implante guiado por gravação de microeletrodos no núcleo subtalâmico de ratos e, posteriormente, uma estimulação de longo prazo desse núcleo. Isso é feito primeiro perfurando um orifício de eletrodo através do crânio exposto. O segundo passo é avançar o eletrodo através do orifício do eletrodo para o cérebro e, simultaneamente, registrar a atividade elétrica em diferentes regiões do cérebro até que a atividade específica do STN seja detectável.
Em seguida, o eletrodo é fixado aplicando cimento dental ao redor da haste do eletrodo e o plugue do cabeçote é conectado ao pino do eletrodo. A etapa final é fixar o plugue por cimento dental e conectá-lo ao fio que leva ao estimulador. Por fim, o cérebro colhido é cortado em fatias de oito mícrons de espessura e corado com hemat, toin e eoin para mostrar que a ponta do eletrodo é colocada no núcleo subtalâmico.
A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como um implante de eletrodo cego, é que o registro do implante guiado de microeletrodos melhora o direcionamento do núcleo subtalâmico com alta precisão Experimentos em animais foram aprovados pela Universidade de Burg e pelas autoridades estaduais legais e realizados de acordo com as recomendações para pesquisa em estudos experimentais de AVC e os relatórios atuais de pesquisa animal de experimentos in vivo. As diretrizes começam anestesiando o rato em uma câmara de indução com ar fornecido a dois litros por minuto e éde flúor a 3,5%Remova o rato da câmara de indução e raspe a área entre as orelhas e os olhos. Use um cotonete embebido em solução anti-séptica para esfregar a área raspada.
Para remover qualquer cabelo solto, mude o fluxo de ar para o cone do nariz e ajuste a anestesia para 2,5% de flúor Isof fornecido a uma taxa de fluxo de um litro por minuto. Posicione o rato no cone do nariz e coloque-o no quadro estereotáxico. Verifique o nível de anestesia beliscando a área interdigital.
Se o rato for anestesiado adequadamente, os reflexos defensivos são abolidos. Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Monitore e mantenha a temperatura corporal do rato em 37 graus Celsius.
Injete 0,2 mililitros de mepivacaína por via subcutânea no centro da área raspada para anestesiar a área cirúrgica, garantindo a esterilidade a partir deste ponto. Use um bisturi para fazer uma incisão na linha média começando entre as orelhas e estendendo-se para a frente por cerca de dois centímetros. Certifique-se de que o periósteo também seja incisado e, em seguida, exponha o crânio com quatro grampos.
Use um cotonete para remover suavemente o periósteo até que as suturas coronal e sagital fiquem expostas. Estuque qualquer sangue com algodão. Fixe uma agulha em um suporte de sonda e, em seguida, marque a ponta da agulha com uma caneta hidrográfica preta.
Usando os parafusos de acionamento da linha média anterior, posterior, lateral e dorso ventral. Posicione a ponta da agulha diretamente sobre o bgma. Faça as leituras da escala de folheado AP e ML.
Subtraia 3,6 milímetros da leitura AP e 2,5 milímetros da leitura ML para implantação do eletrodo no STN direito. Abaixe a ponta da agulha até a superfície do crânio para marcar o local da injeção com o corante da caneta hidrográfica, prenda a broca odontológica no suporte grande da sonda do instrumento estereotáxico. Mova a broca dentária para o ponto marcado no crânio e, enquanto olha pelo microscópio, faça um orifício de cerca de um milímetro de diâmetro no crânio até que a dura-máter fique visível.
Este é o orifício para o eletrodo. Retraia a dura-máter usando uma pinça de microdissecção ou uma agulha estéril, pois a dura-máter é resistente o suficiente para destruir a ponta do eletrodo. Faça um furo com a broca dentária em cada escama frontal e na escama parietal oposta ao orifício para o eletrodo.
Depois disso, faça um furo em cada escama interparietal. Aparafuse um parafuso ósseo em cada um dos cinco orifícios. Evite rosquear os parafusos muito fundo, o que pressionará o cérebro.
O número de voltas dependerá do passo do parafuso. Duas a três voltas de cada parafuso são usadas aqui. Desconecte o suporte da sonda do instrumento estereotáxico e clamp o suporte da sonda com o eletrodo no micro manipulador.
Usando os parafusos de acionamento AP ML e DV, mova o suporte da sonda com o eletrodo até que a ponta esteja quase tocando Breg ma. Observe as leituras da escala de folheado AP ML e DV em breg ma. Em seguida, levante o eletrodo alguns milímetros para evitar que o eletrodo raspe o crânio durante o movimento.
Para determinar as coordenadas da posição em que o eletrodo deve ser inserido no orifício, adicione 3,6 milímetros à leitura do AP e adicione 2,5 milímetros à leitura do ML. Usando os parafusos de acionamento AP e ML, mova o eletrodo para a posição calculada. Neste ponto, a ponta do eletrodo deve estar situada diretamente sobre o orifício do eletrodo perfurado.
Em seguida, enquanto olha pelo microscópio, abaixe o eletrodo até o nível da dura-máter. Observe isso como zero na direção DV. Em seguida, insira suavemente a ponta do eletrodo no cérebro.
Enquanto olha pelo microscópio, conecte o pino do eletrodo ao conector do sistema de gravação. Aterre o instrumento estereotáxico com o contrapeso da sala. Em seguida, coloque uma gaiola de Faraday sobre o rato no instrumento estereotáxico no lugar de uma gaiola de Faraday.
Você também pode usar papel alumínio como mostrado aqui, pois seu efeito é o mesmo de uma gaiola de Faraday. Inicie o sistema de gravação, se disponível. Use um alto-falante para obter um sinal acústico de descargas de unidades individuais enquanto avança o eletrodo.
Insira lentamente o eletrodo no cérebro enquanto registra a atividade elétrica durante o avanço do eletrodo. Durante a gravação, reduza a anestesia o máximo possível para 0,8 a 1%, pois os animais com baixa anestesia mostram uma atividade cerebral elétrica mais clara. A atividade elétrica específica do STN é geralmente detectável a uma profundidade entre 7,5 e 8,1 milímetros da dura-máter.
A atividade típica dos neurônios no STN é caracterizada por um padrão de disparo irregular e uma alta taxa de disparo. Agora, limpe qualquer sangue ou líquido cefalorraquidiano que foi deslocado na superfície do crânio ao abaixar o eletrodo, depois misture uma pequena quantidade de cimento dental e use uma pequena espátula para aplicá-lo ao redor do eletrodo e ao redor de quatro dos cinco parafusos. Quando o cimento dentário estiver endurecido, desconecte o pino do eletrodo do porta-eletrodo e do conector do sistema de registro.
Em seguida, desaperte o quinto parafuso que não foi fixado por cimento dentário. Coloque o plugue no pino do eletrodo e fixe o fio terra do plugue com o quarto parafuso. Aplique cimento dental ao redor do tampão à medida que o cimento engrossa.
Molde-o ao redor do plugue para formar uma tampa. Evite bordas afiadas do cimento dental que possam prejudicar o animal e remova-as durante o endurecimento. Desbride as bordas da ferida e feche-as com uma sutura atrás da tampa e na frente desinfete as bordas da ferida.
Conecte o plugue do cabeçote ao fio que está fixado em um giro. Em seguida, remova o rato do instrumento estereotáxico, administre analgesia pós-operatória apropriada. 12,5 miligramas por quilograma.
Tramadol é usado aqui. Coloque o rato em uma gaiola limpa com suporte térmico e fixe o giro nesta gaiola. Observe a recuperação do animal.
Esta imagem mostra uma seção de oito mícrons de espessura corada com hemat, toin e eoin de um animal sacrificado 14 dias após o implante e estimulação contínua para visualizar a posição onde a ponta do eletrodo estava localizada. Uma linha sólida circunda o STN. Uma pequena lesão é visível onde a ponta do eletrodo estava localizada durante um período de estimulação de 14 dias.
É importante notar que não há canal de penetração do eletrodo visível, indicando que o eletrodo não rompe o tecido circundante. Esta imagem mostra a mesma região com maior ampliação. Um pequeno número de células inflamatórias foi detectado ao redor da lesão devido à reação do tecido cerebral à ponta do eletrodo.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora e um quarto se for executada corretamente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para implantar eletrodos no núcleo subtalâmico (STN) de ratos, utilizando um sistema de microgravação para melhor localização. O procedimento permite a estimulação de longo prazo do STN após o posicionamento preciso dos eletrodos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Neuroestimulação
Contexto
- O núcleo subtalâmico desempenha um papel crucial no controle motor.
- A implantação de eletrodos é essencial para o estudo da atividade cerebral.
- A microgravação aumenta a precisão no posicionamento dos eletrodos.
- A estimulação de longo prazo pode fornecer informações sobre os mecanismos neurais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para implante de eletrodos no núcleo subtalâmico (STN).
- Permitir a estimulação de longo prazo do STN para fins de pesquisa.
- Aprimorar técnicas de localização utilizando microgravação.
Métodos Utilizados
- Fazer um furo no crânio para inserir um eletrodo.
- Avançar o eletrodo para dentro do cérebro enquanto se registra a atividade elétrica.
- Fixar o eletrodo com cimento dental.
- Conectar o eletrodo a um estimulador para uso prolongado.
Resultados Principais
- Localização bem-sucedida do núcleo subtalâmico utilizando microgravação.
- Estabelecimento de uma conexão estável entre o eletrodo e o estimulador.
- Demonstração de capacidades eficazes de estimulação a longo prazo.
- Validação da colocação do eletrodo por meio de análise histológica.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para o estudo do NTS.
- A estimulação de longo prazo pode aprimorar a compreensão do controle motor.
- A microgravação melhora significativamente a precisão no posicionamento do eletrodo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A localização precisa de núcleos cerebrais profundos é fundamental para estudos mecanicistas em pesquisas de neuromodulação. Este método permite o posicionamento exato de eletrodos no núcleo subtalâmico de ratos, apoiando estudos de estimulação de longo prazo que auxiliam na validação de alvos e na investigação de circuitos em modelos pré-clínicos de distúrbios do movimento. A abordagem aumenta a confiança preditiva ao reduzir efeitos fora do alvo e melhorar a reprodutibilidade nas investigações sobre o mecanismo de ação da estimulação cerebral profunda.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante o direcionamento preciso ao núcleo subtalâmico, uma região-chave nas vias de controle motor.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade na colocação dos eletrodos por meio da orientação com microgravação, aumentando a consistência entre os grupos experimentais.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao permitir a correlação entre parâmetros de estimulação e resultados eletrofisiológicos e comportamentais ao longo de períodos prolongados.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Fornece um sistema de implante crônico estável adequado para avaliação longitudinal das respostas de circuitos neurais à estimulação.
- Valor Operacional: Apresenta um sistema de proteção de fios baseado em girador que mantém a integridade elétrica e a mobilidade do animal durante estudos de longo prazo.
- Prontidão para Ensaios: Permite gravação e estimulação simultâneas, facilitando o monitoramento em tempo real de biomarcadores e a caracterização de resposta à dose.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Modela um alvo clinicamente relevante de estimulação cerebral profunda (STN) para estudar adaptações molecular-genéticas em circuitos neurais após estimulação crônica.
- Validação Pré-clínica: A confirmação histológica do posicionamento do eletrodo apoia a verificação do engajamento do alvo, uma etapa fundamental para a redução de riscos em estudos pré-clínicos.
- Avanço com Ajuste de Risco: Permite a avaliação da neuroplasticidade induzida pela estimulação e das possíveis alterações adaptativas que informam a determinação da janela terapêutica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a validação mecanicista e os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para abordagens de neuromodulação que visam circuitos motores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a investigação baseada em hipóteses da função do NTS ao permitir o posicionamento preciso do eletrodo guiado por gravação, isolando os efeitos da estimulação em padrões específicos de atividade neural.
- Triagem: Gera leituras eletrofisiológicas quantificáveis (por exemplo, taxa de disparo, padrões de rajada) que servem como biomarcadores funcionais para o engajamento do alvo e eficácia da estimulação.
- Análise: Permite o acompanhamento longitudinal das alterações na atividade neural, apoiando a análise estatística dos efeitos da estimulação ao longo de diferentes momentos e condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados eletrofisiológicos agudos a desfechos estruturais e moleculares crônicos por meio de histologia pós-estimulação, fortalecendo a ponte translacional.
- Reutilização em Ambiente Corporativo: A plataforma de implante crônico pode ser reutilizada em múltiplos estudos que visam o NTS ou adaptada para outros núcleos cerebrais profundos, promovendo a escalabilidade da plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Melhora a confiança na validação do alvo ao minimizar erros de posicionamento e permitir a correlação entre a estimulação e assinaturas eletrofisiológicas específicas do núcleo subtalâmico (STN).
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade por meio de coordenadas estereotáxicas padronizadas, validação por microgravação e métodos de fixação crônica.
- Valor Estratégico: Reduz o ruído biológico em estudos sobre os mecanismos da estimulação cerebral profunda (DBS), apoiando decisões mais claras de prosseguir ou não na seleção do alvo e na estratégia de modulação.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de neuromodulação ao fornecer evidências pré-clínicas confiáveis de modulação do alvo e seus efeitos downstream.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cirurgia estereotáxica, gravação eletrofisiológica e processamento histológico.
- Depende de manipuladores equipados com microdrives, sistemas de gravação e eletrodos compatíveis com impedância (~1 MΩ de platina/irídio).
- Necessita padronização dos protocolos cirúrgicos e dos cuidados pós-operatórios entre operadores e locais.
- A adaptação a outras regiões cerebrais exige reotimização das coordenadas e validação das assinaturas eletrofisiológicas regionais.
- Estudos de longo prazo devem levar em conta a encapsulação glial e as alterações na interface entre o eletrodo e o tecido ao longo do tempo, conforme observado pela presença de células inflamatórias na histologia.
